はじめに
細胞の生命活動を理解するうえでその代謝物の挙動を 精密に捉えることができるメタボロミクス（メタボロー ム解析）は極めて有効な手段の一つであり，医療・製 薬・工業・食品といったさまざまな分野に適用できる汎 用性の高い技術となっている．なかでも，クロマトグラ フィーに質量分析（MS）を接続した分析系は，対象サ ンプル中に存在する代謝物を網羅的かつ選択的に観察で きることから，メタボロミクス研究において頻用されて いる．しかしながら，メタボロミクスにおける観測対象 物，つまり代謝物は，数が多いだけでなく多種多様な化 学的性質をもつため，対象代謝物の特性から適した分離 分析手法を選び出し，分析メソッドの最適化を行う必要 がある．主な分離手法としてGC/MS, LC/MS, CE/MS が用いられているが，脂質のような比較的疎水性の高い 代謝物プロファイリング手法として，超臨界流体を用い たクロマトグラフィー／質量分析（supercritical fluid chromatography; SFC/MS） が 近 年 注 目 を 集 め て い る（1）
．
SFCは1960年代に提唱された分離技術の一つであり，
一般的に超臨界または亜臨界状態の二酸化炭素を移動相 として用いる（2）
．本稿では，二酸化炭素の移動相として
の特徴を説明するとともに，SFCの分離・検出技術の概要とSFC/MSを用いた代謝物プロファイリング技術 の開発について応用例も示しながら紹介する．
クロマトグラフィー移動相としての超臨界二酸化炭 素
超臨界流体（supercritical fluid; SCF）は，臨界点を 超えた温度および圧力下にある物質の状態を指す．もう 少しイメージしやすい言い方をするならば，「高密度に 圧縮された気体」であろう．このSCFがSFCの移動相 であるため，さまざまな気体がSFCに利用可能だが，
取り扱いの簡便性から二酸化炭素の使用が一般的であ る．SFCは移動相である超臨界二酸化炭素（supercriti- cal CO2; SCCO2）により特徴づけられる分離技術である ため，もう少し詳しい説明を交えてその利点を紹介す る．
二酸化炭素は温度31.1°C，圧力7.38 MPaの臨界点を超 えるとSCCO2となる．SFCのシステムではカラム温度 を臨界点以上に設定すると同時に，圧力をカラム下流に 設 置 さ れ た 背 圧 制 御 装 置（back pressure regulator;
BPR）で制御する．その結果，BPR上流において二酸 化炭素は超臨界状態に保たれSCCO2として存在する．
SCCO2はクロマトグラフィーの移動相として優れた3 つの物理特性を有する．第一に，SCCO2の粘度は気体 に近く，その拡散係数は気体と液体の中間である．これ
refer- ence
CO2 ボンベ
共溶媒 CO2送液
ポンプ 共溶媒
送液ポンプ カラムオーブン
メイクアップ 溶液
UV
オート サンプラ
BPR MS
（モディファイヤ） 図1■SFCシステムの概要
refer- ence
CO2
ボンベ
共溶媒
（モディファイヤ）
CO2送液 ポンプ 共溶媒
送液ポンプ カラムオーブン
メイクアップ 溶液
UV
オート サンプラ
BPR MS
化学の 窓
超臨界流体クロマトグラ
フィー／質量分析のメタ
ボロミクスへの応用
はつまり，分析時に流速を上げても液体に比べると背圧 がかかりにくく，分離が迅速に行われるため，高分離を 維持しつつ高速分離が可能という利点につながる．第二 の物理特性はその極性である．SCCO2の極性は低くヘ キサンと同程度であり，脂溶性物質に対して高い溶解性 を示す．また，SCCO2は温度や圧力によって密度を連 続的かつ大幅に変化させることができることから，溶媒 物性（溶解力，誘電率，拡散係数，粘度など）を精密に 制御することにより使用目的に応じた溶媒性能を付与で きる高機能の媒体である．加えてSCCO2は低極性であ りながらも，メタノールなどの極性溶媒と混和可能であ る．これが第三の物理特性であり，このように対照的な 極性の移動相を直接混和できるのはSFCの特徴である と言える．SCCO2に添加する極性溶媒の比率を制御す ることでその溶出力を大きく変えることが可能であり，
温度や圧力に比べて大きな変化となる．上述のように SFCでは移動相の溶出力を変えるパラメーターが複数 存在しており，結果として，SFCは低極性から高極性 の幅広い化合物に適用可能な分離技術となっている．
分離技術としての
SFCの特性
充填カラムを用いたSFC（packed column SFC; pc- SFC．本稿におけるSFCはpcSFCのことを指す）は光 学異性体の分離に特化して発展し，分取手段として他を 寄せ付けないコストパフォーマンスの高さから絶大な支 持を得ているが，近年ではその分離特性が見直され，分 析用の分離手段としても注目されるようになってきた．
これらの背景には，メーカー努力による装置の発展や実 践的なアプリケーションの展開が大きな理由であるが，
SFCの分離挙動に関する研究が近年盛んに行われてい ることも理由として挙げられる．ここではSFCの分離 特性について最近の研究成果も踏まえ解説する．
SFCはLC同様，移動相の特性を変えることでその分 離を制御することができる．移動相のベースとなる SCCO2に添加する有機溶媒は共溶媒またはモディファ イヤと呼ばれ，一般的にメタノール，エタノール，アセ トニトリルやイソプロパノールといった比較的極性の高 い有機溶媒が用いられる．共溶媒添加は移動相極性を変 えるだけでなく，水素結合性や双極子相互作用に影響を 与えるとともに，カラム固定相のシラノール残基と相互 作用し層を形成することで分離に影響を与える（3）
．特に
SFCはLCと異なり移動相に多量の水を添加することが ないため，水素結合供与性の高い化合物は水素結合授与 体のシラノール残基と相互作用をもち，ピークテーリン グが起こりやすい．このような場合，水素結合供与性の 高いアルコール類を共溶媒として用いることで分離条件 を最適化する（4）．また，共溶媒への酸や塩基，塩，水の
添加はピーク形状や溶出順序に影響を与え，特に塩基性 化合物や高極性化合物に対してこの方法は有効であり，ギ酸やアンモニウム塩（〜0.2% w/v）
，水（〜5%）な
どがよく使われる．これ以外に，添加する共溶媒の比率 によっても移動相極性を変化させることができる．その 比率は一般的に0%から50%と幅広く設定可能であり，移動相の極性を大きく変えることができる．さらに最近 の研究で，SFCはシリカカラムのような高極性固定相 からODSのような低極性カラムまで，HPLCで使用さ れるほとんどすべての固定相が利用可能であることが明 らかとなってきており，逆相クロマトグラフィー（re- versed phase liquid chromatography; RPLC）
，順相ク
状態 密度 (kg/m3)
粘度 (Pa・s)
拡散係数 (m2/s)
気体 0.6–1 10–5 10–5
超臨界流体 200–900 10–5 –10–4 10-7–10-8
液体 1000 10-3 <10–9
クロマトグラフィーの移動相として優れた性質を持つ
圧力
31.1 ℃ 温度
7.38 MPa
固体 液体
気体
超臨界
＜二酸化炭素の相図＞
＜気体，液体，超臨界流体の物性比較＞
＜SCCO2の極性と溶解性＞
溶媒 ヘキサン
トルエン
アセトニトリル メタノール
水 SCCO2
の極性
直接溶解可
間接溶解可
特徴
v
低粘度・高拡散v
低極性v
幅広い溶媒との溶解性 テトラヒドロフラン図2■超臨界流体の特徴 状態 密度
(kg/m3)
粘度 (Pa・s)
拡散係数 (m2/s)
気体 0.6–1 10–5 10–5
超臨界流体 200–900 10–5 –10–4 10-7–10-8
液体 1000 10-3 <10–9
クロマトグラフィーの移動相として優れた性質を持つ
圧力
31.1 ℃ 温度
7.38 MPa
固体 液体
気体
超臨界
＜二酸化炭素の相図＞
＜気体，液体，超臨界流体の物性比較＞
＜SCCO2の極性と溶解性＞
溶媒 ヘキサン
トルエン テトラヒドロフラン
アセトニトリル メタノール
水 SCCO2
の極性
直接溶解可
間接溶解可
特徴
v
低粘度・高拡散v
低極性v
幅広い溶媒との溶解性ロマトグラフィー（normal phase liquid chromatogra- phy; NPLC）および親水性相互作用クロマトグラフィー
（hydrophilic interaction chromatography; HILIC）の代 替え分離技術として注目されている（5, 6）
．また，LCに
おいては順相と逆相で使用する移動相が大きく異なる が，SFCではカラムの種類が変わってもほぼ同じ種類 の移動相を用いて溶出が可能なこともSFCの特筆すべ き特徴である（7）．以上のように，SFCの分離特性は特
徴的な移動相に由来するものであり，これまで好適とさ れてきた低極性化合物だけでなく，有機溶媒に溶解性の あるさまざまな極性化合物についても適用可能であるこ とから，分離対象となる化合物が広く極めてフレキシブ ルな分離技術である（8）．
SFCでは，LCで用いられるUV-VIS検出器，蒸発光 光散乱検出器，蛍光検出器などを用いることができる．
もちろん，質量分析計も接続可能であり，これまでに ESIやAPCIといったさまざまなイオン化法を適用でき ることが報告されている．移動相中の共溶媒組成が5〜
10%以下の場合は，イオン化促進のためのメイクアップ 溶液を添加する．SCCO2はイオン化部でスプレーされ ることで圧解放され直ちに気体へと変化するうえに共溶 媒およびメイクアップ溶液は有機溶媒であるため，水 リッチな移動相に比べてイオン化部における脱溶媒が速 やかに行われる．化合物にもよるが，特に塩基性医薬品 の場合，SFC/ESI/MS/MSはLC/ESI/MS/MSに比較し て10倍程度の感度増加が認められている（9）
．また，LC
と同様に四重極型，飛行型，イオントラップ型といった 一般的な質量分析計との接続が可能であり，目的に応じ て適した質量分離モードを選択することができる．SFC/MS
の代謝物プロファイリングへの応用上記のように，SFCは分析可能対象物の範囲が広く，
質量分析との相性も良いことから，高い可能性を秘めた 分離技術である．そのためさまざまな分野での利用が期 待されるが，これまでSFCの分離特性が正しく理解さ れていなかったことに加え，光学異性体の分離に特化し た形で発展してきたため，GCやLCのように一般的な 分離分析手法として認識されてこなかった．そこでわれ われはSFCをMSと接続することで複雑な代謝物のプロ ファイリングが可能となる新たな分析手法を構築し，世 界に先駆けてメタボロミクスへの応用に取り組み実践的 なアプリケーションを展開している．
われわれの研究室ではGC/MS, LC/MSおよびSFC/
MSなどの分離技術を駆使し，食品・バイオプロダク
ション・医薬といった分野におけるメタボロミクスの研 究に日々邁進している．SFC/MSを用いたメタボロミ クスとしては脂質プロファイリングが実用段階に達し，
さまざまな研究に用いられているので紹介したい．
脂質は，極性基や脂肪酸側鎖の組み合わせにより数万 種に及ぶ分子種が存在しうる．また，構造類縁体や異性 体が多数存在するため，極めて多様性の高い分子群であ ることから，LC/MSによる分析系ではクロマト分離に 時間がかかるうえに，一部の異性体の分離が困難など網 羅的な代謝物分析に課題がある．そこでわれわれは SFC/MSの適用を試み，高分離かつハイスループット のリピドミクスシステムを構築した（10）
．このシステム
は現在さらに発展し，極めて疎水性の高いステロール脂 質やグリセロ脂質から，スフィンゴ脂質，親水性の高い 極性基を有するリゾリン脂質やリン脂質などの極性リン 脂質までを10分程度で網羅的に分析するとともに，リ ン脂質の異性体も同時に分離し，生体サンプルを用いた 場合でも400種以上の成分を同定することに成功してい る（11）．また，SFC/MSを用いた脂質分析システムでは
酸化脂質の分離も可能であり，脂質酸化と疾患の関連性 解明に役立つ代謝プロファイリングツールとして期待さ れている（12）．
さらに，近年注目されているワイドターゲット分析に おいても，SFCは網羅性，解像度，スループットの点 などで優れている．これまでにトリアシルグリセロール をターゲットとした精密プロファイリングにおいて，質 量分析で分離不可能な位置異性体の分離にも成功し，そ の有用性を示している（13, 14）
．これ以外にも酸化ストレ
スマーカーの候補化合物であり発がん誘導作用といった その生理活性に注目が集まるカロテノイドとその酸化生 成物の一斉分析システムを構築し，臨床サンプルに応用 してきた（15, 16）．
加えて，SFCはステロイド分析にも応用されている．
ステロイドは生命活動にかかわる新たな役割が近年明ら かとなっており，創薬や診断医療のターゲット分子とし て重要視されている．ステロイドの分析にはスループッ トや分離の面で解決すべき問題があり，SFC/MSの高 分離を活かしたハイスループット分析が近年報告され始 めている．乳がんなどの疾患に関係するとされるエスト ロゲンとその代謝物を10分以内で分離し，LCに対する 分析時間の有意性が示されている（17）
．われわれはSFC/
MSを用いて，ラット血清中に存在する位置異性体も含 めた25種類の胆汁酸を13分という短時間で分離・検出 することに成功しているとともに，LCやGCと全く異 なる分離挙動を示すことを報告している（18）
．
また，われわれのグループでは，変化しやすい成分を マイルドにかつ効率良く抽出できる超臨界抽出（super- critical fluid extraction; SFE）のオンライン化について も積極的に取り組んでいる．抽出操作時に酸化を受けや すい成分を暗所無酸素下で試料より抽出しそのままに分 析できるオンラインSFE‒SFC/MSは，生体中の抗酸化 物質や酸化代謝物などの高精度のプロファイリングを可 能にする画期的な手法として期待できる．オンライン
SFE‒SFC/MSを用いて前処理から分析までを自動で行 うことによって，これまでに酸化しやすい還元型コエン ザ イ ムQ10の 分 析 や，マ ウ ス のdried plasma spots
（DPS）サンプル中の134種類のリン脂質の一斉分析に 成功している（19, 20）
．
上記のようにSFC/MSを用いた代謝プロファイリン グ技術の開発が急速に進み，さらにSFEとのオンライ ン化についても実用性が示されてきている．このことか ら，今後さまざまな分野においてSFC/MSのみならず，
図3■SFCを用いたラット血清中の胆汁酸分析
（A）遊離型，（B）グリシン抱合体，（C）タウリン抱合体．ターゲットとした25成分の胆汁酸が13分以内に溶出し，すべてが検出された
（文献18より許可を得て転載）．
図4■オンラインSFC‒SFEを用いた還元型・酸化型コエンザ イムQ10の分析
（a）ヘキサンで抽出後SFCで分析した場合，（b）SFE‒SFCで分 析を行った場合．SFE‒SFCでは酸化が抑えられ，還元型コエンザ イムQ10のより正確な定量が可能となった（文献19より許可を得 て転載）．
表1■マウス血漿中で検出された脂質クラス
Class Annotateda Identifiedb
PC 151 72
LPC 31 31
PE 67 58
LPE 8 8
PI 32 31
PG 1 1
SM 13 13
Cer 10 10
TAG 209 191
DAG 22 22
MAG 3 3
CE 21 21
aCompounds for which either the polar head group or one fatty acid side chain was determined.
bCompounds for which the polar head group and fatty acid side chains were determined．
文献11より許可を得て転載．
SFEとのオンラインシステムが一般的な分析手法とし て用いられるようになり，そのアプリケーションの幅が さらに広がることが期待される．
おわりに
SFCはHPLCよりも前の1960年代に提唱された古い 分離技術であるが，近年の研究により極性化合物への有 用性が示されたことで，新たな局面を迎えている．さら に，近年われわれが示してきたメタボロミクスへの応用 実績から，SFCは分取のみならず分析スケールの分離 においても有効な手法であるとともに，新たな分離手法 としての可能性を見いだすことができるのではないだろ うか．SFCは分離技術としてGCやLCとは異なる分離 モードを有しているとともに，脂溶性化合物から極性化 合物まで幅広い成分の分析に適用できることから，さま ざまな化合物の分離に対応可能なフレキシブルな分析 ツールとして今後さらに応用範囲が広がっていくことが 期待される．また，分離のみならず，前処理として SFEが接続可能なこともSFCの魅力の一つと言えよう．
SFEとのオンライン化についても装置開発が進むこと によってこれからさらに発展していく技術である．暗所 無酸素下での前処理はサンプルの酸化を防ぐだけでな く，直接ヒトの手を介さずにサンプル調製・分析が自動 で行えるため，再現性やスループットが飛躍的に向上 し，ハイスループットスクリーニングなどへの応用も大 いに期待できる．このようにSFCは発展性と拡張性に 富んだ分離技術である．今後さらに装置の開発や応用研 究が進むことで，近い将来，SFCが分離分析技術の第 一選択ツールになりうるとわれわれは考えており，さら なる技術開発を含めたアプリケーションの提案に今後も 積極的に取り組んでいきたい．
文献
1) S. P. Putri, S. Yamamoto, H. Tsugawa & E. Fukusaki:
, 116, 9 (2013).
2) 斎藤宗雄：ぶんせき，3, 152 (2012).
3) E. Lesellier: , 1216, 1881 (2009).
4) C. West & E. Lesellier: , 1302, 152 (2013).
5) E. Lesellier: , 31, 1238 (2008).
6) C. West, S. Khater & E. Lesellier: , 1250, 182 (2012).
7) C. West & E. Lesellier: , 1191, 21 (2008).
8) C. West: , May/June, 22 (2013).
9) A. Grand-Guillaume Perrenoud, J.-L. Veuthey & D. Guil-
larme: , 1339, 174 (2014).
10) T. Bamba, N. Shimonishi, A. Matsubara, K. Hirata, Y. Na-
kazawa, A. Kobayashi & E. Fukusaki: , 105, 460 (2008).
11) T. Yamada, T. Uchikata, S. Sakamoto, Y. Yokoi, S. Nishi- umi, M. Yoshida, E. Fukusaki & T. Bamba:
, 1301, 237 (2013).
12) T. Uchikata, A. Matsubara, S. Nishiumi, M. Yoshida, E.
Fukusaki & T. Bamba: , 1250, 205 (2012).
13) J. W. Lee, T. Uchikata, A. Matsubara, T. Nakamura, E.
Fukusaki & T. Bamba: , 113, 262 (2012).
14) J. W. Lee, T. Nagai, N. Gotoh, E. Fukusaki & T. Bamba:
, 966, 193 (2014).
15) A. Matsubara, T. Bamba, H. Ishida, E. Fukusaki & K. Hi- rata: , 32, 1459 (2009).
16) A. Matsubara, T. Uchikata, M. Shinohara, S. Nishiumi, M.
Yoshida, E. Fukusaki & T. Bamba: , 113, 782 (2012).
17) X. Xu, J. M. Roman, T. D. Veenstra, J. V. Anda, R. G.
Ziegler & H. J. Issaq: , 78, 1553 (2006).
18) K. Taguchi, E. Fukusaki & T. Bamba: , 1299, 103 (2013).
19) A. Matsubara, K. Harada, K. Hirata, E. Fukusaki & T.
Bamba: , 1250, 76 (2012).
20) T. Uchikata, A. Matsubara, E. Fukusaki & T. Bamba:
, 1250, 69 (2012).
（田口歌織，福崎英一郎，馬場健史，大阪大学大学院工 学研究科）
プロフィル
田口 歌織（Kaori TAGUCHI）
＜略歴＞1998年高知大学理学部生物学科 卒業／2000年同大学大学院農学研究科修 士課程修了／同年株式会社マリンワーク ジ ャ パ ン／2003年 株 式 会 社 日 本 ウ ォ ー タ ー ズ／2007年Waters Corporation／
2013年大阪大学大学院工学研究科博士課 程後期，現在に至る＜研究テーマと抱負＞
研究テーマ：超臨界流体クロマトグラ フィー，ステロイドプロファイリング．抱 負：SFCをクロマトグラフィーの第一選 択肢にすること＜趣味＞スキー，機織り 福崎英一郎（Eiichiro FUKUSAKI）
＜略歴＞1983年大阪大学工学部醗酵工学 科卒業／1985年同大学大学院工学研究科 博士前期課程醗酵工学専攻修了／同年日東 電工株式会社生物化学研究所研究員／1992 年日東電工株式会社基幹技術センター副主 任研究員／1993年博士号（工学）取得（大 阪大学）／1995年大阪大学工学部応用生物 工学科助教授／1998年同大学大学院工学 研究科応用生物工学専攻助教授（配置換 え）／2005年同学同大学院生命先端工学専 攻助教授（配置換え）／2007年同上教授＜
研究テーマと抱負＞研究テーマ：メタボロ ミクス，メタボリックプロファイリング．
抱負：教育と研究の相乗効果の最大化＜趣 味＞読書，散歩，麻雀（最近やっていな い），野球（こちらも最近ご無沙汰）
馬場 健史（Takeshi BAMBA）
＜略歴＞1994年岡山大学農学部総合農業 科学科卒業／1996年同大学大学院農学研 究科修士課程修了／同年株式会社日本生物 科学研究所研究員／1997年株式会社JBDL 主任研究員／2001年日立造船株式会社主 任研究員（NEDOプロジェクト研究員）／
同年大阪大学大学院工学研究科学位（工学 博士）取得／2006年同助手／2007年同助 教／2008年准教授＜研究テーマと抱負＞
超臨界流体工学，メタボロミクス．SFC/
MSを用いた代謝プロファイリング技術を 世界に広めるために，超臨界流体を用いた 抽出・分離技術の開発ならびに応用研究に 取り組んでおります＜趣味＞テニス Copyright © 2014 公益社団法人日本農芸化学会
