海洋化学研究 Vol.4.tif

戸蝙璽

「硫化熱分解や化学発光反応などに 基づく分析法の開発」

原

正＊

同志社大学工学部教授原正先生は 、

1989

年分析化学会学会賞を受賞されました、それを記念いたし まして平成 2 年 4月28 日に開催されました第10回石橋雅義先生記念講演会にて御講演頂きまし た。こ こにその内容を元に 、御寄稿頂きましたので掲載致します。

ここで紹介する仕事は、すべて著者の研究室で いっしょに研究された人達によ ってなされたもの である 。 ここでは前半で硫化熱分解ガスク ロマ ト グラフィー

(PSGC)

法の開発を、後半で化学発 光反応に基づく分析法の開発を述べる。

1.

硫 化 熱 分 解 ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー

( P S G C )

法の開発

有機元素分析の進歩を歴史的に見ると、 1830年

に

Liebig

によって始められた酸素燃焼（マク ロ

C

H

分析）法 、

1916

年 に

Pregl

によって開発され た 微量化学天びん とそれを用いる元素分析の微量化、 その後の装置の改良 、測定法の進歩、精度の向上 を経て今日に至っ てい る。 このような歴史的経過 の中で基本原理ともいうべき反応を見直すことも なく使われてきたため、 150年後の今日 にあ って

も主成分の酸素を

C

、

H

、

N

と同時に直接定量 す ることができない 。

このような観点から著者らは、 酸素燃焼法 に代 わってイオウ燃焼法という全く新しい構想に基づ

＊同志社大学工学部教授

＜元素分析法すなわち

P S G C

法を考案し、それを 多角的に検討した。この

P S G C

法によれば、たと えば(1)試料をひょう量することなく（実際には、

ある質量範囲内の試料を見かけ体積として採取す る）、 1 回の分析操作でC 、H 、0 、N 比を同時に 決定でき、 ⁽²⁾通常の有機化合物をはじめ高分子化 合物、含金属有機化合物 、ハ ロゲン化合物 、リン 化合物など各種試料に適用で きるなど、いくつか の優れた特徴を明らかにできた 。以下にその概要 を述べる 。

1.  1   P S G C

法の原理

たとえば、 C 、H 、0 、N で構成される有機化合 物の約0. 5mgを 5 叩のイオ ウとヘリウム置換 した 石英封管中、

950

℃で

30

分間反応させると、生成 物は、試料の種類に関係なく 8 種以内であった 。 表 1 には成分元 素 と生成物の関係を示した 。 比

0

と

SO2

は、試料中の

C / 0

原子組成比が

1

以 下の場合にのみ生成 し、 通常の有機化合では生成 しなか った。また

C O

生成量 は小 さく、通常無視 できた 。 これ らの事実 は、生成物のヒ°ーク面積比

52  (24)  海洋化学研究 4 ,  2  

(1990) 

T a bl e  1.  R el ationship  between  elements  and  their  p rodu cts. 

Elements  C H O N  

Products  CO,,  COS, CS,,  ( CO )   H ぶ， （H 心 ）

CO,,  COS, (CO), (H 心），（SO2) N2 

o   5   10  /  m i n  

Fi g .1  T yp ica l  chro m a t og ra m s  of the  products. 

1  :  N ,  2 :  . C O,  3:H ,S,  , 4:C O S.  5:H ,O ,   6:S O,,  and 7:C S, .

G C  condition s:C o l u m n  parki ngs Pora‑

pak  O S  (45cm, 105c m )  a nd  C h r o m osorb  104 (50cm )、co l u m n tem peratu re  85°C ,   and fl ow  rate  of ca rrier  gas 50cm '/ m in .  

から試料中のC、H、0、N原子組成比を決定でき る可能性を示唆した 。生成物の代表的なク ロマ ト グラ ムをFig. 1に示した 。

ここでは、試料をひょう量することなしに 各 元 素間の比 を求めるため、理論的に誘導される式(1) を使った 。

a ( w t % ) =  ‑ X lOO   (1)  

:E M ( r )K( r )A( r )  

r

はa を含有する生成物を、

M '( f3 )

は

B

の分 子 量 からイ オ ウの式量を差 し引いた値を、 M ( r )

はr中のa の式量 を、 K ( r ) はrの計算係数を、

A ( r ) はrのビ ー ク面積値を、それぞれ示 して いる 。

:EM' ( /3）K(/3）A ( /3） 

式中でa は目的元素を、

f3

は本法による生成物を、

海洋化学研究 4 ,  2   (1990) 

式(1 )中の計算係数は、 4 種の標準試料を本法で 分析 した結果を使いK ( H ぷ） ＝1 と してk (N2)、 k ( C S 2 )、K ( C O S )、K ( C Oりを各算 出した 。 これ ら計算係数を使い、式(1 )からC、H、0、N原子組 成を百分率％ で表すことができた 。 また

1

回の分 析に採取される試料量 は0.

2 1. 

0mgの範囲内であ ればよか った。

1 .  

2  

P S G C法の改良

P S GC法の精度向上や分析時間の 短 縮 を目 標 と

して各種の改良がなされた 。市販特級のイオウと いえども不純物が多く不適当であ ったので独 自の 方法で精製し、使用した 。反応終了後の多数石英 封管試料の分析には3個の破砕装置 を並列 に配置 する連続分析装置 を試 作 し、使用した 。 また 反応 時間の短縮のため、 Fig.

2

に示 すような 高 周 波 加熱炉を試作した 。 それを用いることにより反応

時間を30分から約40秒に短 縮 できた 。 またヘリウ

ム置換装置の開発も行 った。

1 .  3   P S G C法の応用

P S G C法によれば、大部分の通常有機化合物の ほかに、含金属有機化 合物、 ハ ロゲ ン化合物 、含 リン化合物などのうちの多くを分析することがで きた 。若干の通常有機化合物の分析例をTable

2  

に 、 ま た 若 干 含 金 属 有 機 化 合 物 の 分 析 例 を T able  3にそれぞれ示 した 。

フッ 素含有試料 で は 、 石英 (Si Oり との反応 で酸素 を発生したので、 P S G C法を適用できなか っ た。 その他 のハロゲ ン元素

(CJ :   Br: I)

を含有 する化合物試料では、 生 成する ハ ロゲ ン化物 のた めG C分析が不可能であ った 。 そ の よ う な 問 題 点 を克服す るため、 一端を閉じた石英管内で高純度

(25 )   53  

T a b l e   2   Analytical  results  of  n o r m a l  organic c o m p o u n d s .  

C   H  

゜

^N  

w t %   w t %   w t %   w t %  

S a m ple  

C alcd  Found  Error  C alcd  Found  Error  Calcd  Found  E rror  Calcd  F ound  Error  2 ,  N  2', 3, 3', 4, 4' ,  on a mcthyld1‑phenyl  5, 5', 6 ‑ ,  m ethane  8 9  73  8 9  84  + 011  10 27 

Suben c  acid  5 5  16  55 00  ‑ 0  16  8  10  L au nc  acid   '11 95  72 17  + o  22  12 08 

2, 6  ‑ D,methylphenol  78.65  78  69  + o  04  L ‑ G lu tamm e   41 0 9   41 0 5   ‑ 0  04  Di methylglyox ime   41 3 7   41.38  + 0 0 1   m ‑ N itroa m h ne   52.1 7   52.09  ‑ 0  08   L ‑ Tryptophan  64 6 9   64.4 3  ‑ 0  26  8  ‑ Q u molinol   74.47  74.40  ‑ 0  07  2, 2' ‑ B ipyndine   76 90  76 98  + 008 

R  

Fig.2  High‑frequency induction furnace. 

54 

A : W o r k  coil,  B :outer  quartz tube  (10 .5‑

m m i .d .,  1 2 . 5 m m  o .d.,  a n d  5 0 m m  long) ,   C: inner quartz tube ( 5 . 5 m m  id.,  6 .5 m m   o .d.,  a n d   5 0 m m  long) ,  D :a m p u l e  con‑

taining s a m p l e  a n d  S ,  E:granulated  tungsten  (1 0 2 0 m e s h ) ,  a n d  F:ceramic  su p p o r t .  

8  25  6  90  6  94  4  3 8   5.92  4  8 6   5.16 

(26)  

10 16  ‑ 011 

8  23  + 0.13  36.74  36.77  + o  03  12  07  ‑ 0  01  15  97  15  76  ‑ 021  8  30  + 0 05   13  10  13  01  ‑ 009 

7  04  + o  14  32 84  3 2  78  ‑ 0  06  19  17  19.13  ‑ 0  04  6  82  ‑ 0  12   2 7  56  2 7  58  + 0.02  24 13  24 2 2   0  09  4  42  + o  04  2 3  17   22.92  ‑ 0.25  20.28  20 57  + o  29  6. 12  + o  20  15.67  15  47  ‑ 0.20  13  72  13  98  + o  26  4  8 8   + o  02  II 0 2   10.94  ‑ 0  08  9  65  9  78  + o  13   5. 15  ‑ 0  01  17.94  17.87  ‑ 0  07 

イオウSxとアジ化ナトリウムを反応させて (Sx

+ Na,S)

を得、これを使 って常法の

P S G C

法を 適用した 。封管内の気体の分析でC 、H 、0 、N 原 子組成比を、また固体中のハロゲン化物を溶解後 イオンクロマトグラフ分析により

Cl

、B r、

I

原子 組成比を、決定できた。また両分析をリンクさせ ることにより、一つの試料から

C

、

H

、

0

、

N

、

Cl

、 B r、

I

原子組成比を決定できた 。含金属ハロゲン 化合物試料の場合につき、その概要を^{T a b le}

4  

に示した 。

なお

P S G C

法を

30

μgまでの試料へ適用可能な こと、およびC 、H 、0 、N の同時絶対定量の可能 なことも 実験結果をもって示した 。 これまでに検 討した50種の共存元素のうち、 37元素が無害、 3 元素が試料組成により無害、

10

元素が妨害した 。 その概要を

Fig. 3

に示した 。

1 .  4  

大気圧下の硫化熱分解とその応用

大気圧下で連続的に硫化熱分解させるための独 特な装置（金石英製）を開発した

(Fig. 4 )

。本 装置 によれば、

G C ‑ I

からの流出成分

(He

キャ

リア ）はイオウ蒸気と高温炉内で反応し、生成物 が

G C ‑ I1

で検出される 。 このときの 全装置図 を 海洋化学研究 4,  2   (1990) 

Table 3  Analyt ica l  results  of  metallo‑organ ,c  compounds. 

Sample a)  C   H  

゜

^N  

w t %   w t %   w t %   w t %   Bis(anthranilato )— Theor  61. 76  4.44  23.51  10.29  copper ( II )   Exptl  62. 04   4.55  23.28  10.11  Cu(C,H,O,N),  Error  + 0.  28  + 0.11  ‑ 0.  23  ‑ 0.18  (Benzoin oximato)— T heor   74.65  4.  91  14. 21   6.23  copper (II )   E xptl  74.60  4.65  14. 55  6.20  Cu(C14HぃO , N ) Error  ‑ 0.  05   ‑ 0.  26  + O.  34  ‑ 0. 03  Tns(8‑q urn ohnolato)— T heor  74.98  4.20  11. 10  9.  72  c h r o m i u m  (ill )   Exptl  74.95  4.  18   11.26  9.61  Cr(C, H ,ON),  Error  ‑ 0.  03   ‑ 0. 02  + 0.16  ‑ 0.11  D10xo b1s(8‑q umo lmolato)— T heor  67.50   3. 78  19.98  8.  75  tungsten(VI)  Exptl  67.35  3.58  20. 19  8.88  W O ,(C, H , ON),  Error  ‑ 0.15   ‑ 0. 20  + o.  21  0.  13 

a) Metal atoms were neglected  rn  the  composition of metallo‑orgamc c o m p o unds. 

Table 4  The modified  P S G C  method for a  halogen‑contain ing  sample. 

C H O N X M   s  X I  N~S

N 2 ,  ( C O ) .  C O 2・均

s.

C O  S .  ( H  2 0 ) ,  ( S  0が， C S 2  

N : i O ,  

N a  I ,  

Na Br,  M m  Sn 

G C   analysis 

s  

.I

s 

  y  al 

I a T  

c  

C   H  O   N  p   q   r   s  

a ̲  

_X  Br.‑ ・y   . ・I  z  

ー

ca

凡 0 c  N  d  a  e  Br 1  I  9  

海洋化学研究 4 ,  2   (1990)  (27)  55 

I A   I D A   I V A   V A   V I A  V I I A   v m   I B   IIB  I D B   I V B   V B   V I B  V I I B   0   H e N e A r K r x e R n  

△ 喜

At

O s ◎

Te po  

： Q

旦 怠

Ge sn

◎

喜 曼

喜 ◎ 喜

◎ 喜

冒

昌

Ir

◎

Ruos 

◎

TC Re  

冒

晨

Ta

喜 回

s c Y

◎

Ac 

旦 ︺

｀

Ra

C X

3 文

喜

Fr

L a

＝ ◎   ◎⑤

^{N b ,  P m}、S m

， ◎

G d , T b ,  Dy,  H o ,  E r、T m , Y b ,  L u   A c =  A c ,

日

P a

、 口

N p , P u

、

^{A m ,} C m ,  B k ,  C f ,  E s ,   F m

、

^{M d}

、

N o , L r  

Fig .3  Effect  of the coex istent elements o n  the determination of the  atomic ratio .  

0 : Harmless ,

口：

f o r m o x ide  a n d  harmful ,

： 口

f o r m both oxide  a n d  nitride and harmfu l, △：react  w ith  reaction tube a n d  also  harmful ,  O :can be determined by P S G C .  

一 ︒

︒

ーー ー﹁

Ol ,̲1 9 11 90 11

・

︒ ︒

︒

゜

0 0  

︒ ︒

゜ ゜゜

^o  

゜ ゜

^o  

furnace 

゜

^ヽ

to  GC‑Il 

Fi g .4  T h e  system  of the  pyrolytic surfuri lation  reactio n .   0 : Sulfur，●：sample,  a n d ( )：products .  

Fig.  5に、代表的なクロマトグラムを^{Fig. 6} に、

さらに化合物の判定結果をTable 5 にそれぞれ 示 した 。

大気圧下での硫化熱分解反応の生成物は、封管

内のそれと異なった 。 これまでの検討結果に よれ ば、定性的には十分満足できる結果を与えたが、

定量的には不十分であった。

56  (28)  海洋化学研究 4,  2   (1990) 

H  

「‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ I  

l   I   l   l   l   I   I   I  

L ̲  ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑̲ L  ‑̲ J  

,‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑D  

‑‑‑,‑ ‑ ‑‑,  

l   I  

＇ 

I   l   I   I   l   I  

‑ ‑ I  ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑：――￨―‑‑

‑I ‑

^――{  

‑ J  

r, 1 1 1 1ー

1

ー

1 1 1 1 1 9,

﹂

C

ロ ロ ロ ロ

r

̲ 9 9 9

ー1

ー

1 9 1 L 1 , L

Fig .5  

Fi g .6 

Schematic flow d i a g r a m  of system.  A:Molecular S ieve 5  A  c o l u m n ,   B :copper c o l u m n ,  C :g a s  c h o m a t o g r a p h ‑ 1 ,  D :gas chromatograph‑II ,   D ,: C h r o m o s o r b  104 column,  D ,: P o r a p a k  O S  c o l u m n, 

D ,: Deactiigle column,  E :four‑way cock ,  F  a n d  G :si x ‑ w a y  cocks ,   H  :electric furnace,  I  :reaction tube,  J  :quartz‑ m a d e  apparatu s,   K :sulfur trap ,  L :trap c o l u m n ,  a n d  M :stainless steel  tube .  

10   10  I  m,n 

C h r o m a t o g r a m s  of  s a m p l e s  (A : cy c lohexene ,  B : m ethyl  a lcohol ,   C :pyridine,  a n d  D :m o r p h o l i n e ). 

1  :  C O,,  2  :  H ,S ,  3  :  C O S ,  4  :  S O,,  5   H C N ,  a n d   6  :  C S,. 

海洋化学研究 4 ,  2  

(1990)  (29)  57 

T a b l e  5   Analyti cal  results  of  o r g a n i c  co m p o unds. 

Products  Components 

S:1mplc 

C O,  

I  

H,S 

I   cos  I   so.   I  

^{H C N}  

I  

^1‑1,0 

I   cs. 

Theoretical 

I  

Found 

Benzene  ＋  ＋  C,  H   C,  1‑1 

n ‑Hexnne   ＋  ＋  C ,  H   C.  H  

M ethanol   ＋  ＋  ＋  ＋  C . H .  0   C,  H, 0  

Ethanol   ＋  ＋  ＋  C .  H, 0   C.  H ,  0  

A cetone  十 ‑1  ‑ ＋  C.  H, 0   C,  H ,  0  

Methyl acrylate   ＋  ^十 ＋  ＋  C,  H , O   C,  H, 0  

Tr1ethylomine  ＋  ＋  ＋  C,  H, N   C ,  H. N  

Pyridine  ＋  ＋  ＋  C ,  H. N   C ,  H, N  

N1 I  romethane  ＋  ＋  ＋  ＋  ＋  ＋  ＋  C,  H, 0, N   C,  H ,  0,  N  

M orphol1nc  ＋  ＋  ＋  ＋  C,  H. 0,  N   C,  H, 0,  N  

2.

化 学 発 光 反 応 に 基 づ く 分 析 法 の 開 発 生体試料中の微量成分、とくに タンパク質と そ の誘導体 を分析するたとを 目的として、化学発光 反応に基づく分析法の開発を行ってきた 。 この場 合、金属錯体が触媒として働く化学発光反応の利 用に重点が置かれ た。すなわち

Fig. 7

で示す化 学発光反応の機構のうち 、触媒に金属錯体 を用い ることを特色とした。なおタンパク質の分析法は 次に挙げる両面から検討した 。(1)試料中の各成分 の分離とそれに続く 個々の検出（たとえばクロマ トグラフ分離や電気泳動分離 に続く検出 ）、（

2

）各 種成分の共存する試料中の特定成分（タンパク質）

の直接かつ特異的検出（免疫分析など）。

著者らは、化学発光系 にタンパク質が共存する と金属錯体触媒の活性が著 しく低下することを見

Type I  

＞

h 

 

ヽ tノ .

 

＋  

c r   d u u o

←  

u c t O F l   o d P r +   Pr

／ ヽ

﹄ 9

p

ロ

 

Fluor +  h v  

F ig. 7   M echa ni s m  of  chemil u m inescence  reaction .  

58  (30) 

い出し、こ れを用いる各種タンパク質定量法（化 学発光触媒活性抑制法；

M A L C L C )

を確立した 。 他方、従来のR I AやE I Aにおける標識剤（放射性 同位体や酵素）の代わりに化学発光系の錯体触媒 を用いる免疫分析法も確立した 。以下にそれらの 概要を述べる 。

2 .  1

化学発光錯体触媒免疫分析

(CLCCIA)

複雑な試料マトリックス中の特定微量タンパク 質を定量する目的 で、化学発光錯体触媒免疫分析

(CLCCIA

と呼ぶことにする）法につき検討した。

酵素免疫分析 ( E I A ) 法は放射免疫分析 ( R I A ) 法に代わり 得る高感度の優れた方法であるが、な お(1)標識剤酵素分子の立体障害に基づく不均質免 疫反応、 (2)不安定性、(3)高価などの問題点をも つ。

これまで合成金属錯体触媒を標識剤として用いる 免疫分析の報告が見当らないので、それについて 検討 した 。金属錯体触媒と しては

Fig. 8

に示す 配位子を使った 。検討錯体触媒中 、

Fig. 8   ‑d

の鉄 (III ) 錯体 ( T C P ‑ Fe(III) ）が最も有望であっ た ので、それを標識剤とし 、ヒト 血清アルプミン

（モデルタンパク質；H S A ) を競合法（免疫分析）

で定量 した 。免疫分析は

Fig. 9

に示すような簡 単 な装置 で行 った。 この場合の免疫分析法を

Fig.

10

に、また検量線を

Fig. 11

に示した 。

ルミノ ールー過酸化水素化学発光系 に対し最高 海洋化学研究 4 ,  2   (1990) 

c 1 9 H O

◎ 

0 .N   N =C  

気

。

^H

( a )  

99O O C  

◎

^{D H  H O}

◎ 

^{C O O H}  

C   N = C   H 2とも，2

( b )  

◎

‑ O H   H O

恐 〉

H.0‑‑NH  H N ‑ C H   H忍 I I ¥

H 2 C‑ C H  

， 

C O OH   IC I  

o o H  o o H ̀

式

パ 勺

̀II

^{H  ↑HOO} 

喜

C O O H  

( d )  

C O OH   ( e )  

Fig .8  T h e  structure of  ligands.  

a :  3,  4‑Bis  (salicylideneamino)benzoic acid,  b: N ,  N‑bis(4‑carboxysalicylidene)ethylenediamine, 

c :  N,  N‑bis[2‑( o‑hydroxyphenylacetic acid )]  ethylened1am1ne,   d  :  4,  11 ,  18,  25‑tetracarboxyphtha locyan i  ne,  and 

e :  5,  10,  15,  20‑tetrakis(4‑carboxyphenyl )porphine.  

80  r  ‑-—— •— ——

c  

2

‑9  

ー

＂＂ 

L  ‑ ‑ ‑ ‑ ̲  ＿ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑

Fig.9  T h e  apparatus for  C L C C I A .  

a :  Test tube,  b :  glass bead,  c: shutter,  d :  photomultiplier,  e: dark box ,   f :  photon counter,  and g  :  recorder. 

0 0   6 4   紫＼

︵

O

︳＼

20 

゜ ゜

log  (H S A/  μ g  tube²   ―1)  Fig.11  Calibration curve. 

I,  lo: C L  intensity  of the sample in  the  presence or absence of  H S A .  

3  

感度を示した合成T C P‑Fe( ill ) （天然のヘマ チ ン より 高感度）を標識剤とする免疫分析を 、はじめ て行 った。2 1 0 0 0  μg/ tubeのH S Aを変動係数 6 1 6% ( n = 5 ) で定量 できた 。 この方法を 実 用的なものとするため、改良（特にカルボン酸形 T C Pの酸塩化物形T C C Pへの転換に よる 標識操作 海洋化学研究 4 ,  2   (1990) 

の簡易化と分析時間の短縮）と諸条件の最適化を 行っ た。その結果5 0 n g 5 0 μ g H S A/  tu beを、ガ

ラスビ ーズを用いる 競合法で定量できた 。 前述の免疫分析（競合法）はすべて回分（バ ッ チ）式 に行われたので 、化学発光強度を連続的に 測定できる流通式装置 (Fig. 12) を試作し、そ

(31)  59 

0   0   0  

0   0   0  

l   ￨   I   I   h v  

̀ 「: ‑

( A )   ( B )   ( C )  

心

^{I  a  I}  

゜

^{( b  I}  

g  

^{( C )}  

F ig .10  T h e  procedure for  i m m u n o a s s a y.  

(a )  

I  b )  

( c )  

( d )  

A  :  I m m u n e  reaction,  B  :  separation of  bound a n d  free fractions,  a n d   C :  m e a s u r e m e n t  of  C L  intensity.  a :  Glass bead  immobilized  with  antib o d y,  b  :  H S A ,  a n d  c  :  labeled  H S A.  

(I)  

〇

^{(m )}

Fig .12  Schematic fiow diagram. 

a :  Luminol solution,  b :  liberating solution,  c :  buffer solution ,   d :  H ,O ,  solution,  e ,,  e,,  e,,  e

、

: p u m p, f,  h :  s a m p l in g  loop,   g ,  i,  j :  si x‑w a y  cock ,  k :  immobilized antibody co lu m n ,  I :  flow‑cell ,   a n d  m :  photomult iplier. 

の性能を調べた 。その結果、 C L C C I Aの感度 と精 度が向上し、 化学発光強度測定時間も次のように 改良できた： 20n g 50 μ, g H S A/ tube測定の変動 係数は

5.8 7.   2%  

(n =  

9 )

で、測定時間は

4

分。

連続C L C C I Aのための操作法をF i g. 13に、その とき の標準曲線をFig. 14に、それぞれ示 した。

この ようなC L C C I Aによって一層微量のタン パ ク質を定量する試みとして、光学ファイパを用い

60  (32)  海洋化学研究 4,  2  

(1990) 

Ag Ag on 72  

.

. .   I  

aー

H  

．

． 

．

．  ar p 

．

．   b b   A A s e .mm. p

鬱

Bne10

↓   op op n2  

10 7  9 Ag ac tH   e p  

A

． 

．   r

 

．

．  

．

．  

．

．   b b e m n  m   u

  A A

讐

  im m1 0

2   7

  nt pH  e

  m .m  

Ab A b 

＂

  冒

^{紐紐AA gg  AA} 

↓ ↓   ↓ ↓  

S a n d w i ch  reactio n   10  m in.  p H  7 2  

↓ 

二

A A  

．

．  

．

．  

．

．   g ,  

A A   ゅ

璽

ゅ

‑ 綴

心

A g 1 i A

心

3 r e A g A n PHg

ee  A bA b

的

m e e o 5 m

ー︐

e s n

 

.I

m 

  Li 5  

u  

冒

・1

↑

﹄

W a shing   10  m in ,  p H  7.2  

Fig .13  Operating procedure for continuous C L C C I A .  

A b :  Antibody,  A g :  antigen ,  O p :  other protein ,  a n d  L :  [1 ,  8,  15,  22‑

tetrakis(ch loroformyl )phtha locyan i  nato]  iron (ill ). 

( S A

＼ュ ea He エe ad ) 6u o1  

゜

゜

Fi g.  14 

2  

log (H S A  ng)  Standard  cu rve  of  H S A.  

る方法を検討 した。 この方法では、ファイ バ先端 の平面上に抗体を固定化し、 競合法かサンドイッ チ法で免疫反応 させた後 、ルミノ ールー過酸化水

その 様子を 素流路内での 化学 発 光 を 検 出 した 。

F ig. 15に示 した。 この場合、競合法とサ ンド イ ッ

チ法の検量線をFig .16とF ig .17に示した 。 競合 法では 1 x 10- • ~ 1  x 10―l g d m―3H S Aを 検 出 下 限400p gで、またサンドイ ッチ法では 1 x 10‑ '  

1  x 10‑ 1 g d m ‑ 3H S Aを検出下限40pgでそ れ ぞ れ 定量できた 。

口 口 胃 戸

6c 0  

ー

0 Q6  

︐ ︒  

y   a   s   i3

心

0 8   u   g  

勾゜

︒Q

︒Q

︐  

e  

口 叫

Th e

人人人人

U , e   p l● 9  n  ●n d   o l●99  0 I99  9C● I  

(，b●9   9  m o b  9  l  i  zぷiw 9  9  99 ●9ヽし9 b o d y  ^●n ' 1 9 e n  

?   X' 

m "  i  b o d y   I  •lm l叫 ●99C 9 Q e n  

゜

□ ロ 夏

^]

Hぃ

D o o o m x  D

o o o 5 

[ O O O O 

T he  s口wにれi m m o n o m ay  

Fig.15  Schematic d i a g r a m  of  the  i m m u n o a s s a y.  

(A ),  (A ') ,  (C') :  Antigen‑antibody reaction, 

(B ),  (B ') ,  (D ') :  separation of  bound and free  fractions,  a n d   (C),  (E' ): measurement of  C L  intensity. 

海洋化学研究 4 ,  2  

(1990)   (33)  ₆₁ 

1()()  I-(~ ^{3 0 0 0}  

． 

80 

m  ⁶⁰ 

凌 40 

2 0  

゜

^{‑ 6   ‑ 5   ‑ 4   ‑ 3   ‑ 2   ‑ 1}  

log  (H S A  concn / g  d m―' ）

Fig .16  Calibration curve for  H S A  obtained  b y   the competitive  i m m u n o a s s a y.  

%8=((1.‑1.。) （I,,‑1,.)} x  100 

1、, I.,: C L  intensity of  the s a m p l e  in  the  presence or absence of  H S A ,  

I,.  :  C L  intensity  of background, a n d  

（●）： Blank value. 

U )  

＞ 2000~ / •

E  

＼ こ

U )  

s  

c: 

C   1000 

‑」Q  

(...） 

96 

‑5  ‑ 4   ‑3  ‑2  ‑1  ‑0 

log  (H S A  concn/ g  d m^―3) 

Fig.17  Calibration cutve for  H S A  obta ined b y   the sandwich i m m u n o a s s a y.  

（●） ：Blank value.  

•

to  W a s t e  

言 言

Fig .18  Schematic d i a g r a m  of the apparatus for  indirect  FIA. 

a :  Buffer solution,  b :  H ,O心olution , c :  luminol solution ,  d :  s a m p l e  solution,  e: six‑way cock ,  f :  flow‑cell ,  h :  photomultiplier、i : amplifier,  j  :  recorder,   k :  syringe,  a n d  P ,,  P ,,  P ,: p u m p.  

62  (34 )   海洋化学研究 4 ,  2   (1990)  

T a ble  6  D etecti o n  limit  of  protein  by vari ous  indirect  FIA. 

Method No.  C L  syste m   Detection limit of  protein  (injection volum e )  

1 2 3 4 5 6  

T h e  indirect F I A   L u m i nol‑H心,‑Cu(Il) Luminol‑H心,‑Co( III) Luminol‑H心,‑Fe( III) Phen‑H,0,‑Cu (Il)  Phen‑H,0,‑Ru (III)   Phen‑H心,‑Os (VIll) 

200ng  200ng  4ng   5ng  ln g   0.25ng 

(400 μI )   (400 μI )   (400 μ] )" >  

(50 μI )   (50 μI )   (50 μI)   a) N o t  detected for bovine ser u m   r‑glo bulin and h u man  ser u m  r‑globulin.  

Table 7  Comparison of  the present  FIA with the  other  FIA.  

Method N o.   Method  Detect ion 

limit/ ng  Determi nation 

range/ g  d m  ^{‑ 3}   Sampl1n̲g   volume/ ninl 

7 8 9 0 1 2 3   1 1 1 1  

Present  Luminol‑H ,0 ,‑C u ( II )   Ultrasoni c  lumi nol‑Co (Ill )   P hen‑H ,0 ,‑Cu ( II )   Dyestuff‑b ind ing  Electrode 

Spectrophotometry   L o w r y  

10  0.20  0.25  40  120  1000  1000 

2.  o x  10― ‑1.  o x  10̲  1  

5.  o  x  10̲' ‑1 .  o x  10̲,   5.  0  X  10‑' ‑1 .  0  X  10‑1  

2.  0  X  10‑' ‑5.  0  X  10‑1  

1.  o x  10‑,  ‑2.  o x  10‑•

1.  0 X 10―̀  ‑1. 0   5.  o x  10‑,  ‑2.  o x  10  ̲,  

400  40  50  20  40  10  100 

2 .  

2  

化学発光触媒活性抑制法 (M A L C L C ) 著者らは、標記の方法をM A L C L Cと呼び、

れについての検討を次の順序で行った ：（A ) 間 接 F I A法、（B ) 直 接F I A法、 ( C ) M A L C L Cの 原理、 ( D ) M A L C L C検出器のH P L Cへの応用 。

間接F I A法

この方法では、試料溶液中のタンパク質 をあら かじめ金属イオンと一定条件下で反応させた後、

( A )  

こ

その一定量をフロ ーイ ンジ ェクション系に注入し、

分析した 。 これに用いる 装置の 一例をFig .18に 示 した 。 また各種間接F I A法によるタン パク質の 検出限界をTable 6に示 した 。Table 6のM e t h od

6

によれば、

( B )  

5  x 10- •~ 1  X lO→ g d m―3タンパ ク質を、検出限界250pg （注入量50 mmり 、 変 動 係 数2.9 %  ( n  = 10) で定量できた 。M e t h o d 6 は、

従来の比色法や蛍光法に比べ約10 2 1 0・倍高感度 であった 。

直接F I A法

この方法では、試料の一定量 を流通系に 直接加 えることにより定量 が行われた 。本法と他法の比 較をT a ble 7に示した 。M e t h o d 7    9が本 法 に 相当し、 M e t h o d 9で使用した 装 置 をFig. 19に、

またその場合のフ ロー チャ ー トをFig.20に示 し た。M e t h o d 8 によれば、 5  x 10‑ '  1  X lO―1  

海洋化学研究 4 '  2  

(1990)   (35)  63  

g d m‑3タンパク質を 、検出限界200pg （注入量 40mmり、変動係数2. 9 %  ( n  =  8 )、60試料／時の 速度で定量できた 。M e t h o d 9 による 9種タンパ ク質の検出感度は0. 84 1 .  42 ( B S A=  1.  00) であっ た。なお直接F I A法は、ヒト血清中のアルプミン

／ グロプリン比の 決定 に応用できるほか、 250pg までのa ーフェトプロテイン（ガンマーカ）を検 出できた 。

( C )   M A L C L Cの原理

本法の原理は、次のように説明できる 。

n

モル の金属イオンと 1モルのタ ンパク質が式(2 )によっ

Protを生成するとき、

nM  

+  

Prot~Mn • Prot  (2)  C L強度の減少△

It

は式(3 )で与え られる 。

△It = ①k  • Prot〕・exp( ‑ kt)  (3) 

Protは金属 ータンパク質錯体 <l>は発光量子収 率、K はC L反応の速度定数をそれぞれ意味 する 。 測定感度を高めるには式(3)の△Itを大きくすれば

よく、そのための必要条件を明確にした 。それら 条件 は、これまでに得られ た実験結果と 矛盾 しな いことを確認できた 。加熱操作は、 M A L C L Cを

使う直接F I Aでタンパク質を迅速、鋭敏かつ適確

に検出するための最も重要な因子の一つであった。

△I t (％）は、見かけの速度定数と安定度定数を

使い算出できた 。

( D )   C L検出器のH P L Cへの応用

タンパク質混合物を分離、検出するための各種 ,・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・ ・・・・・n  ・・・・・・・・・・・・・・・: 

64 

; . . .  

^;  

:... 

;  

_{to  waste} 

゜

;・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・; 

記

Fig .19  Schematic diagram of the apparatus for direct  FIA. 

a :  Phen solution,  b :  H , O ,  solution,  c :  copper (II)  catalyst solution ,  d :   buffer  solution ,  e: sample solution,  f :  regulator,  g  :  N, cylinder,  h  :  flow‑

meter equipped with a  needle valve,  i:  pump, j: six‑way cock ,  k :  sampling  loop,  I  :  syringe、m : m i x ing  coil,  n  :  thermostat,  o :  reaction  tube、p :coo|—

ing  tube,  q :  flow‑cell ,  r :  photomultiplier,  s :  amplifier,  t :  recorder, and u: 

Integrator. 

(36)   海洋化学研究 4 ,  2   (1990) 

s

  s

 

s

1 0    

← ,＇

^S

 

＞ュ

＼

J¥ ll SU 8l U!

7 8  

b

  b

5    

s

  s

 

3  m i n  

c 

c  

゜

Fig .20 

Fig .21 

海洋化学研究 4 '  

F l o w  chart of  the direct  injection  m e t h o d  using a  phen‑H ,0 ,‑C u (II) system.  

a  :  5.  o x  10― g  d m―'‑, b :  1.  o x 10― g  d m―3  ‑、 c : 1.0 X 10 ―g d m―' B S A ,  a n d   s :  sample injection  point. 

Conditions :  5.  0 X 10 ―' m o l  d m― phen ,  5.0wt %  H ,O , ,  a n d  1.0  X 10―' mol  d m―Cu(II). 

e  

: h  

・

・

・・・ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・ ・・・・, 

り L...  ~... ~.••~ .. ~..•~.. ... .. .. .. . !渇 。 w aste

｀ 

... ,... k  

州

,...  

m   0 .  6 4  m  

Sample injector   s 

Schematic d i a g r a m  of  the  ion‑excha nge chromatograph‑CL d etector system.  

[ C L  detector]  a :  Phen solution,  b :  H ,0 ,solution,  c: Cu(Il) solution, d :  reg‑

ulator,  e :  N ,  cylinder,  f: flowmeter equipped  with a  need le  valve、g :  flow‑

cell ,  h :  thermostat,  i :  m i x ing  coil,  j :  reaction tube,  k :  colling tube,  I:  pho‑

tomultipli er,  m :  amplifier,  n :  recorder,  o :  integrator,  p :  four‑way cock, q :   column, 

[Sampl e  injector]  r :  six‑way cock,  s :  sampling  loop,  t: syr inge,  u  :  s a m ‑ pie  solution ,  

[Eluting system] a ' :  N a C l  solution ,  b':  peri sta lti c  pu m p,  c': gradient‑mix‑

er,  d ' :  magnetic stirrer,  a n d  e' :  p u m p.  

2  

(1990)   (37)  65 

gu eq Jo sq e 

>

n  

ー

ノ

．

／

／   

ー

／ 0 3 /   1

‑m /   x d /   o g

︑ ー

・／

／

／ 

H  

＇

／

 

 

／ 

r  

 

7 / レ 

／

／ 

／  ノ  

／

／ 

／   

1.0  X  10 ‑3  g  d m ‑3 

0.50 

0 . 2 5   C,

E P

‑ O E¥ u3 U0 3 

Al lS U8 lU  

゜

3e N 

l J

 

ヽ

／

／   

／  

3

︑ /

／  

3  0

‑

ー m / x d /   o g

/   1

/  

r /  

0 .5 0  

0 .25 

? E p 1  0E

¥u 3U 03  

゜

3e N 

゜

^{4  6  8  10} 

゜

^{6  12   18  24  3 0}  

ElutlOn  time/ m i n   Elution  time/ m i n  

(a)  C h r o m a t o g r a m  using a  U V  detector.  (b)  C h r o m a t o g r a m  using a  C L  detector. 

Fig.22  C o m p a r i s o n  of  both detectors for the separation of  a  model sample.  

S a m p l e :  Ovalbumin a n d  trypsin  inhibitor f r o m  soybean. 

H P L Cが、ルミノ ールー過酸化水素 一銅 ( II ) 系

か

1. 10

ーフェナント ロリ ン (ph en ) 一過酸化水 8 ) を用いるC L検出器 素一 銅 ( II ) 系 ( T a ble

と各種カ ラムを結合することにより、開発された。

例としてイオ ン交換クロマト グラ フーC L検出器 系の模式図をFig.

21

に示した 。 その分析系で得 られたタンパク質混合物のク ロマト グラムを、

U V

検出系 による ク ロマト グラムといっ しょに Fig.  22に示した 。Fig.22から、 C L検出系の有用 性を確認できた 。

2. 3  

むすび

これらの結果を考えるとき、今後特に重要 と思 われる点は、 (1)より有効な化学発光触媒の開発、

(2)キャピラリーゾ ー ン電気泳動／C L検出器のイ ンタフェイス 、(3)非化学発光性成分（分析成分） の化学発光体への簡易誘導体化、 (4 )化学発光強度 の増大など、多くの発展が期待される 。

66  (38)  海洋化学研究 4 ,  2

 

(1990)