甘味タンパク質の構造機能相関

(1)

【解説】

ソーマチンから見えてきたこと

桝田哲哉

甘味は基本5味のなかで，最も親しみのある魅力的な味である．甘味を呈する食品は好んで食べられ，「甘いものは別腹」という現象も多くの人が経験している．しかしながら糖質の過剰摂取が生活習慣病や齲歯の一因と考えられているため，低カロリー甘味料の開発や，摂取後に血糖値の上昇を伴わない甘味料の開発が注目されている．新規甘味料の開発は，甘味物質の構造活性相関を土台にして，行われてきた背景がある．本稿では甘味タンパク質ソーマチンの甘味発現部位，構造活性相関を中心にほかの甘味タンパク質の知見を交え近年のトピックスについて概説する．

甘味を呈するタンパク質

精製されたタンパク質は一般的に無味，無臭であるが，例外的に甘味を呈するタンパク質が存在する．これまでに6種類のタンパク質（ソーマチン，モネリン，ネオクリン（クルクリン），マビンリン，ブラゼイン，卵白リゾチーム）が甘味を呈すると報告されている^（1〜5）

（表

1

_）．これら6種類のタンパク質については，すでに

その立体構造が明らかになっているが，甘味タンパク質間に共通して存在するアミノ酸配列や構造の特徴などは見いだされていない（図

1

_）．甘味タンパク質の多くは，

卵白リゾチームを除き，熱帯雨林に自生する植物に由来する．甘味強度についてはショ糖との相対比（モル比，

重量比）や，ヒト官能検査による閾値法により同定されており，ソーマチンやモネリンはショ糖に比べモル比で 10万倍，重量比で3千倍と非常に強い甘味を呈する．これら甘味タンパク質はいずれも天然甘味料（Natural Sweeteners）である．天然の甘味料としてはほかに

の葉に含まれるステビオシドやレバウデオシドA，ブドウやメロンに含まれるエリスリトール，

甘草の根に含まれるグリチルリチンなどがあるがいずれも低分子物質である^（4, 5）（表1）．一方，合成甘味料としては，サッカリン，アスパルテーム，アセスルファム K，スクラロースが挙げられるが，いずれも強い甘味を呈することから「高甘味度甘味料」とも呼ばれ，食品，

飲料に広く用いられている．

Structure‒Activity Relationships on the Sweet-Tasting Protein : Studies on the Sweet-Tasting Protein, Thaumatin

Tetsuya MASUDA, 京都大学大学院農学研究科

(2)

甘味タンパク質ソーマチンの特徴ソーマチンは西アフリカ原産の植物

Benth の果実から単離される．陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出パターンから少なくとも5つのバリアント（ソーマチン a, b, c, I, II）が存在し，

ソーマチンI，ソーマチンIIが構成成分の大半を占める．

ソーマチンはヒスチジン以外の19種のアミノ酸を構成成分とする207アミノ酸残基からなる一本鎖タンパク質であり，分子量22,000，等電点が12，分子内に8つのジスルフィド結合をもつ．ソーマチンの微生物生産が長年困難であったのは，このジスルフィド結合の多さに一因があるかもしれない．ソーマチンIおよびIIのアミノ酸配列を比較すると，4カ所のアミノ酸残基の相違が見られる．46番目，63番目，67番目，76番目のアミノ酸残基が異なるが，ソーマチンIではこの順でアスパラギン，セリン，リジン，アルギニンであり，ソーマチンII ではリジン，アルギニン，アルギニン，グルタミンである．このようにソーマチンIIのほうが全体として塩基性度が高い．

ソーマチンは甘味料のみならず，タンパク質結晶化のモデルタンパク質としても広く利用されており，現在までプロテインデータバンク（PDB）には40種類ほどの構造が登録されている．それら構造の多くは，ソーマチン IとIIの混合物や，精製ソーマチンIであり，分解能が1 Åを切る高分解能のソーマチンIの構造解析も行われている．近年，筆者らも大型放射光施設SPring-8において分解能が0.9Å前後の構造解析に成功し，また初めてソーマチンIIの構造を明らかにした．ソーマチンは3つ図1■甘味タンパク質の構造

上段左から，ソーマチン（3al7）, モネリン（3mon）, ブラゼイン

（2brz）, 中段左からネオクリン（2d04）, マビンリン II （2ds2）, 下段左から，鶏卵リゾチーム（2vb1）, ガチョウリゾチーム（153l）. 括弧内はPDB番号．α-へリックスを赤色，β-ストランドを黄色で示す．図はpymolで作成した．

表1^■甘味タンパク質，甘味物質の特性

分子量等電点甘味度¹ 構造到達分解能（Å）²

甘味タンパク質

ソーマチン 22,000 12 1,600‒3,000 （100,000） β-sandwich ; 11 β-strands in 2 sheets 0.94 （2vhk）

モネリン 11,100 （二量体） 9.3 3,000 （100,000） α and β;α‒β （×4） 1.15 （2o9u ; MNEI）

ブラゼイン 6,500 5.0 2,000 （40,000） β-hairpin and 2 adjacent disulﬁdes NMR （2brz）

マビンリンII 12,400 （二量体） 11.3 110 （4,000） all α; 4 helix 1.7 （2ds2）

ネオクリン 25,000 （二量体） 7.5‒9.5 550 （20,000） β-prism II ; 4-stranded sheets （×3） 2.76 （2d04）

リゾチーム 14,500 11 20 （700） α and β;α＋β motif 0.65 （2vb1）

天然甘味料

ステビオシド 318.45 210

レバウデオシドA 967.01 242

エリスリトール 122.12 0.7

グリチルリチン 822.94 93‒170 高甘味度甘味料

サッカリン 183.19 400‒700

アスパルテーム 294.30 200

アセスルファムK 201.24 200

スクラロース 397.64 600

ネオテーム 378.47 6,000‒10,000

シクラメート 201.22 30‒50

1甘味度はショ糖に比べ重量比で示す．括弧内はモル比．²到達分解能，括弧内はPDB番号を示す．

(3)

のドメインからなり，コアドメインであるドメインIは典型的な11個の

β

-ストランドで構成されている（アミノ酸残基1 〜53, 85 〜127, 178 〜207）．残りの2つのドメインはジスルフィド結合に富むドメインIII （アミノ酸残基54 〜 84）とドメインII （アミノ酸残基128 〜 177）を含んでいる（図

2

_）．SCOP （Structural Classiﬁ- cation of Proteins）においてソーマチン様タンパク質

（thaumatin-like protein）スーパーファミリーに分類されている．高分解能構造解析を行うことにより，異方性温度因子（anisotropic temperature factors）を考慮した構造の精密化が可能となり，多くのアミノ酸残基において，水素原子の存在も確認できた^（6）．また異なるpHに

おける高分解能構造データの比較により，pH変化に伴うタンパク質の揺らぎ，構造変化をも追跡することも可能となっている^（7）．

ソーマチン発現系の構築，ソーマチンプレ配列が発現効率に与える影響

成熟型のソーマチンは207アミノ酸残基からなるが，

前駆体としてN末端に22アミノ酸残基からなるプレ配列とC末端に6アミノ酸残基からなるプロ配列を有する

（図

3

_）．これらプレ，プロ配列は植物においては成熟過程で除去される．また，酵母においてもプレ，プロ配列を含む植物由来のソーマチン遺伝子を用いて発現を行うとプレ配列が除去される．近年，

の発現系において，プレ配列ならびにプロ配列の影響について検討が行われ，プレ配列を用いるとN末端が正しくプロセスされ，かつ発現量が大幅に増加する結果となった．一方，プロ配列は除去されず，植物とは違う機構で発現されることが示唆された．培養条件の検討，マルチコピー株が作製され，発現量も1 Lあたり 100 mgと大きく改善されている．麹菌での発現では，

甘味を呈する組換え体ソーマチンの大量取得に成功しているが，N末端が正しくプロセスされず配列の異なる複数のタンパク質が発現されている．またトランスジェニック植物による発現も試みられており，ジャガイモ，

トマトなどでの発現が行われている．

甘味タンパク質の構造活性相関

1. ソーマチンの甘味発現部位の探索，構造活性相関ソーマチンの甘味発現部位の同定はアミノ酸残基側鎖の化学修飾により古くから検討されてきた．初期の知見では，アルギニン残基ではなくリジン残基の正電荷が甘味にかかわり，チロシン残基も甘味にかかわっていると考えられていた^（8）．しかしこれら化学修飾の解析では修飾残基の同定，構造変化の有無についての検討は十分なされず，後年リジン残基をピリドキサール5リン酸で化図2■ソーマチンの構造

上段左，ソーマチンのcartoonモデル．ドメイン I, II, III, をそれぞれ赤色，緑色，青色で示す．黄色は変異体の結果から甘味発現に重要であると指摘された，Lys67, Lys137, Tyr169 を stick model で示している．上段右，ソーマチンとモネリン双方に反応する抗体のエピトープ．認識部位を赤色で示し，Asp21, Phe80 を stick model で示す．Arg82を青色で示す．下段，甘味に影響を与えた残基 2オーダー以上の甘味低下が見られた残基 Lys67, Arg82 を赤色で，1オーダー程度の甘味低下が見られた残基を青色で示す．下段右図は左図（クレフト中心）を垂直軸に対し −90 度回転させクレフト面を側面から描く．

図3■ソーマチンの核酸配列ソーマチンIの核酸配列，プレ配列

（22アミノ酸残基）を橙色，プロ配列をピンク色で示す．4カ所の実線赤色はソーマチンIとIIで配列が異なる箇所を示し，破線赤色は113番目の残基を示す．植物ではプレ配列，プロ配列双方除去されるが，酵母においてはプレ配列のみ除去される．

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学修飾した1残基修飾体の分離，同定が行われ，5つのリジン残基（Lys78, Lys97, Lys106, Lys137, Lys187）の重要性が指摘された^（9）．またこれら修飾体の負電荷をアルカリフォスファターゼで除去すると，Lys106以外は未修飾と同様の甘味閾値に戻ったが，クレフト内部に存在するLys106については，負電荷を除去しても甘味が減少したままであり，その側鎖構造が甘味発現に重要であるとの結果が得られた．それぞれの修飾体のCDスペクトルによる解析では，未修飾ソーマチンと顕著な構造の違いが見受けられず，クレフト構造を含む面に広く存在するリジン残基の正電荷が，受容体とmulti-point in- teractionしているとの報告がなされた．化学修飾法では，意図したアミノ酸残基のみの修飾や，修飾体を単離するのに多くの労力がかかるのが欠点である．

部位特異的変異体によるソーマチンの甘味発現部位の解析は，変異を行う部位としてまずソーマチンIとIIとで配列が異なる箇所に検討がなされた^（9）．その結果によるとSer63とArg76の変異は甘味に影響を与えなかったがLys67の変異により甘味が減少した．K67Eの場合，

植物ソーマチンIと比べ〜50%, K67A の場合20%以下であった．そのほか Lys137, Asp113, Tyr169 の変異により甘味が減少したとの報告がある．これら残基はいずれもドメインIIとドメインIIIが寄り合った位置に存在している（図2）．次に，ピリドキサール5リン酸による化学修飾の結果をもとに，酵母を発現系として検討がなされた^{（10, 11）}．まず重要性が指摘されていたクレフト構造を含む面に存在する塩基性アミノ酸残基に焦点が絞られ，変異体が作製された．リジン残基変異体では特にK67Aの甘味が19.3倍，K67Eでは33.3倍低下した（図2）．そのほかの変異体（K19A, K49A, K106A, K163A）では1.6倍から4倍程度の甘味の低下であった．化学修飾の結果から重要性が示唆されていた Lys106の変異体K106Aでは3.1倍の甘味低下に留まり，

先のピリドキサール5リン酸の化学修飾の結果（5.8倍）

と少し結果を異とした．ピリドキサール5リン酸を用いた化学修飾の場合，かさ高い芳香環がリジンの

ε

-アミノ基側鎖に導入されるため，リジンをアラニンに置換した部位特異的変異体と比べ，ほかのアミノ酸残基側鎖などに局所的な影響を与えることも考えられ，化学修飾と部位特異的変異との実験結果について注意を払う必要があると考えられる．Lys106の近傍に存在する塩基性アミノ酸残基について立体構造上で検討すると，9Å離れたところにLys49の

ε

-アミノ基が位置している．しかしながらK49A変異体では3.1倍程度の甘味低下であったためほかの残基の関与が推測された．そこで塩基性アミ

ノ酸であるアルギニンに注目すると，Lys106から10 〜 11Å離れたところにArg82とArg79の側鎖が位置しており，それら変異体について検討がなされた．その結果 R79A変異体では，3.8倍，R82A変異体では，24.4倍甘味が低下し，これまでアルギニン残基がソーマチンの甘味に寄与しないという化学修飾の報告と大きく結果を異とするものとなった．R82A変異体の結果からそのほかのアミノ酸置換体について検討がなされ，R82K変異体で5.3倍，R82Q変異体で22.4倍甘味が低下し，負電荷を導入したR82E変異体ではおよそ200倍甘味が低下する結果となった（図2）．R82E変異体の甘味低下は後述するほかの甘味タンパク質の変異による甘味の低下に比べ極めて著しい低下であった．R82Q変異体とR82E変異体の甘味強度の違いも興味深い点であり，Arg82の側鎖はソーマチンの強い甘味を決定づける要因であると考えられる．これまでのソーマチン I, II の高分解能構造解析より，甘味発現に重要な2残基である，67番目と82 番目のアミノ酸残基の側鎖のフレキシビリティーが高いことが明らかとなっており，この揺らぎが甘味受容体との相互作用に重要な役割を果たしていると考えられる．

部位特異的変異体を用いた研究以前にはモノクローナル抗体を用いた甘味発現部位の探索もなされていた．

ソーマチンに対して作成された抗体が，モネリンとも交差して反応し，その逆の現象（モネリン抗体もソーマチンと交差する）も確認されていた^{（12, 13）}．つまり抗体が認識する部位が甘味発現部位であるとの発想から，双方のエピトープの探索がなされた．その結果，この交差抗体はソーマチンの19-KGDAALDAGGR-29と77-CKRF- GRPP-84を認識していた（図2）．このエピトープのなかには，アスパルテーム様の構造（Asp21-Phe80）が見いだされており，興味深いことに，ソーマチンの強い甘味を決定づける残基であるArg82もこのペプチドのなかに含まれている．受容体と甘味タンパク質との相互作用には分子表面に存在する（ソーマチンの場合はクレフトが含まれる面）複数のアミノ酸残基が寄与していると考えられるので，抗体が認識する抗原決定基（エピトープ）とオーバーラップしていたのは，ごく自然な結果とも捉えることもできる．

2. モネリンの特徴，甘味構造活性相関

ソーマチンが一本鎖タンパク質であるのに対しモネリンは44アミノ酸からなるA鎖と50アミノ酸からなるB 鎖が非共有結合したヘテロ二量体タンパク質である（図

4

_）．モネリンは非共有結合したヘテロ二量体であるため加熱に対して極めて不安定である．モネリンは比較的小

(5)

さいタンパク質であるので，A鎖，B鎖のそれぞれのポリペプチド鎖をペプチド固相化学合成し，両者を混合することで再構成させたモネリンアナログを用いた解析が行われている点がほかの甘味タンパク質と大きく異なる^（14）．アスパラギン酸残基をアスパラギンに置換したアナログが作製され，甘味に与える影響が検討された結果，B鎖の7番目に存在するAspをAsnに置換したアナログが甘味を消失した．このアナログはCDスペクトルで天然モネリンと同様の波形を示した．AspB7近傍のアミノ酸残基についても検討がなされ，IleB6, IleB8, GlyB9 の重要性も指摘された（図4）．興味深いことに，

このモネリンB鎖の甘味発現部位，Ile-Asp-Ile配列は，

ソーマチンの配列100番目から102番目（Ile-Asp-Ile）にも存在している．ソーマチンの場合これら残基は分子内部に存在する

β

-ストランドに位置しており，直接甘味受容体との相互作用には関与しないと思われるが，甘味発現に必須な立体構造保持に重要な役割を果たしている可能性も挙げられる．この点については今後の検討課題であると言えよう．

部位特異的変異体を用いた甘味発現部位の同定では，

2つのペプチド鎖を遺伝子工学的手法により結合させた一本鎖モネリンが用いられている．立体構造上A鎖のN 末端とB鎖のC末端が近傍に位置しているため，A鎖の N末端（Arg1）とB鎖のC末端（Glu50）を直接結合させた94アミノ酸残基からなる SCM^（15）とA鎖とB鎖の間にグリシンとフェニルアラニン2残基のスペーサを導入した96残基からなるMNEIの2種類の一本鎖モネリンが作製された^（16）（図4）．固相ペプチドによる構造活性相関の結果を基に検討がなされ，R86E （ArgA36）,

R70E （ArgA20）変異体では100倍から25倍甘味が低下する結果となり，Asp72 （AspA22）を含む Arg86, Arg70 で形成される領域が重要な役割を果たすことが明らかとなった^（17）（図4）．またモネリンのC末端には Pro-Val-Pro-Pro-Proという連続したプロリン残基が分子表面に存在する．これらPro残基を順次欠損させた変異体を作製しその甘味強度を検討したところ，Pro残基が減少するにつれ甘味も減少することがわかった．この時点ではpreliminaryなCD解析が行われ，わずかな2次構造変化が見られたという報告であったが，近年，MNEI 変異体のX線構造解析の結果から，このC末端のPro残基が甘味に与える影響についても議論されている^（18）．また，SCMの変異体の解析より，Glu2 （GluB2）, Asp7

（AspB7）, Arg39 （ArgB39）の3残基が甘味にかかわり，

なかでもAsp7とArg39の2残基に変異が導入されるとモネリンの2次構造および3次構造の安定性と甘味に影響を与えると報告されている^（19）．

3. ブラゼインの甘味構造活性相関

ソーマチン，モネリンなど甘味タンパク質の多くは塩基性タンパク質であるが，ブラゼインは等電点が5の酸性タンパク質である．甘味強度はショ糖に比べモル比で 4万倍，重量比で500から2,000倍と報告されている．果実中にはアミノ酸残基54残基と53残基の2種類のブラゼインが存在している．前者は80%を占め，N末端がピログルタミン酸化されている．後者はピログルタミン酸が欠如している．54アミノ酸残基中，約50%のアミノ酸残基が極性アミノ酸残基である（Asp 5残基，Arg 2 残基，Glu 4残基，His 1残基，Lys 7残基，Tyr 6残基，

Ser 2残基）．ブラゼインは甘味タンパク質のなかでは最も小さく（分子量約6,500），分子内に4つのジスルフィド結合を有し，80度，4時間の加熱でも安定である^（20）．ブラゼインの構造はNMRで決定され，3つの逆並行

β

- ストランドと一つの

α

-へリックスから構成されることがわかった（図1）．また近年，分解能1.8ÅのX線結晶構造解析もなされ，NMRで得られた構造との相違点も指摘されている^（21）．ブラゼインの発現はstaphylococcal nuclease をN末端に融合させた大腸菌発現系や酵母発現系を用いて行われている．ブラゼインの甘味‒構造活性相関の研究においても多くの変異体が作製され，N末端とC末端を含む領域と，Arg43を含むフレキシブルなループがブラゼインの甘味発現にかかわることが報告された^（22）．後年さらに25種類の変異体を用いた解析により，C末端領域と，Asp29-Arg33, Glu36, Tyr39-Arg43 が甘味に大きく影響することが示された^（23）（図

5

_）_．ま図4^■モネリンの構造

モネリンは44アミノ酸からなるA鎖と50アミノ酸からなるB鎖が非共有結合したタンパク質である．A鎖を赤色，B鎖を青色で示してある．一本鎖モネリンはB鎖のC末端とA鎖のN末端を直接結合させたSCMとB鎖とA鎖の間にグリシンとフェニルアラニンの配列を挿入したMNEIが知られている．右図，モネリンの甘味発現にかかわる残基 2オーダー以上の甘味低下が見られた残基

（B鎖：Ile6, Asp7, Ile8, Arg39, A鎖：Arg36）を赤色で，1オーダー程度の甘味低下が見られた残基を青色で示す．C末端のPro‒

Pro-Pro配列を水色で，変異により甘味が強まった残基Tyr65（A 鎖Y13）を黄色で示してある．

(6)

たLys18とAla19間にジペプチドArg-Ileを挿入すると，

甘味が消失することが示され．ジペプチドの挿入で Cys16-Cys37のジスルフィド結合が変化し，間接的に Glu36の構造に影響を与えていることが明らかとなっている．近年，His31, Glu36, Glu41 をそれぞれ Arg, Asp, Ala に置換した2残基変異体（H31R-E36D, H31R-E41A, E36D-E41A）, 3残基変異体（H31R-E36D-E41A）が作製され，いずれもwild-typeに比べ甘くなると報告されている^（24）．また高分解能NMRにより，甘味に寄与する Tyr11の温度依存的な構造変化を追跡した興味深い報告もある^（25）．

4. ほかの甘味タンパク質の構造活性相関

これまで，ソーマチン，モネリン，ブラゼインについて甘味構造活性相関について紹介してきたが，そのほかにマビンリン，ネオクリン，リゾチームが甘味を呈する．マビンリンについては2008年に立体構造が決定され，ほかの甘味タンパク質とは異なり，

β

-ストランドを含まず

α

-へリックスのみから構成されることがわかった（図1）．しかしながら，変異体作製による甘味部位の同定，構造活性相関の観点からの研究はまだ十分な結果を得られていない．ネオクリンについては，それ自身甘味を呈するが，酸味を呈する物質を味わうと甘味に変える「味覚修飾タンパク質」であり，すでにその観点から多くの変異体の検討がなされており，これらについては，総説を参照されたい^（26）．リゾチームについても，

多くの化学修飾体，部位特異的変異体が作製され，溶菌活性に重要な残基Glu35とAsp52が存在する面とは反対の面に散在している5つの塩基性アミノ酸残基（Lys13, Lys96, Arg14, Arg21, Arg73）が甘味発現に重要である

ことがわかった．また，これらそれぞれの残基の甘味に対する貢献度について検討がなされ，Lys13とArg14はいずれかの残基があれば甘味を保持できるが，そのほかの残基は相加的な役割を果たしているとの知見が得られている^（27）．

甘味受容体

1999年cDNAサブトラクション法により，味覚組織に特異的に高発現している味覚関連遺伝子のスクリーニングが行われ，新規の7回膜貫通型のGタンパク質共役型受容体（GPCR）遺伝子（T1R1, T1R2）がクローニングされた^（28）．その後，ヒトゲノムデータベースからヒト第1染色体1p36領域にあたるBACクローンの塩基配列がスクリーニングされ，新規な遺伝子（T1R3）がクローニングされた^{（29〜32）}．T1RsはGPCRファミリーのサブグループCに属するが，このグループの特徴として細胞外のN末端部分が大きなドメインを形成していることが挙げられる（図

6

_）．T1Rsはおよそ500アミノ酸残基からなる細胞外ドメイン（NTD）, その下流に50アミノ酸残基ほどのシステインリッチ領域（CRD）を有し，さらに300アミノ酸残基からなるC末側膜貫通領域

（TMD）を有する（図6）．その後の研究により，T1R1- T1R3のヘテロ二量体はうま味受容体をT1R2-T1R3のヘテロ二量体は甘味受容体を形成することがわかった^{（33, 34）}．甘味受容体T1R2-T1R3は，糖類，アミノ酸，

ペプチド，合成甘味料，甘味タンパク質を認識する．以下に主な甘味物質について受容体上での結合，応答に係る部位について概説する．

低分子甘味物質の受容体結合部位の探索

甘味物質は糖類から合成甘味料，甘味タンパク質にいたるまで構造特性は大きく異なる．これまでの実験結果から甘味物質に対する応答は生物種によって異なることが知られている．代表例としてマウスやラットなどのげっ歯類は，ヒトが甘味を感じることのできる甘味タンパク質（ソーマチン，モネリン，ネオクリン，ブラゼイン）や合成甘味料のアスパルテーム，ネオテーム，シクラメートなどを認識しない．一方でシュクロースやグルコースなどはヒトを含めげっ歯類も感知することができる．そこでこの種間の甘味物質に対する感受性の違いを利用して，ヒト由来甘味受容体やマウス由来甘味受容体をHEK293細胞などの培養細胞で強制発現させ，甘味物質にどのような応答性を示すのかを調べることにより，

図5^■ブラゼインの構造

ブラゼインは54アミノ酸残基からなる．N末端がピログルタミン酸化されたバリアントが80%を占める．甘味発現にかかわる残基，Lys6, Lys30, Arg33, Glu36, Arg43, Tyr54 を赤色，Lys5, Tyr8, Lys15, His31, Asp50 を青色で示す．部位特異的変異により甘味が強くなった部位については黄色で示す．

(7)

受容体のどの領域が甘味物質の結合や応答に関与しているのか検討された．ヒト型T1R2-T1R3は，ラット型 T1R2-T1R3で応答性が見られないアスパルテームやソーマチン，モネリンなどの甘味タンパク質に対して応答が見られた．次にヒト型T1R2とマウス型T1R3を組合せた受容体（hT1R2-mT1R3）を作製し，応答性を検討したところ，マウス型T1R2-T1R3に対して応答が見られなかったアスパルテームに対し応答が見られたことから，アスパルテームの応答はヒト型T1R2が必要であることが示唆された^（35）．この結果についてはT1R2遺伝子をノックアウトしたマウスに，ヒト型のT1R2遺伝子を導入すると，本来マウスが感じえない甘味物質（モネリン，ソーマチン，アスパルテーム，アセスルファム K，グリチルリチン）に対して反応を示したでの実験によっても検証されている^（36）．次に受容体内の応答に係わる領域をさらに特定するため，ヒトとラットのT1R2，T1R3遺伝子からN末端側細胞外ドメイン

（NTD）とC末端膜貫通ドメイン（TMD）を置換したキメラレセプターを作製し，検討したところ，アスパルテームとネオテームの応答にはヒト型T1R2のNTDが必要であることが示された^（37）（図

7

_）_{．さらに，ヒト由} 来T1Rsのアミノ酸配列とマウスおよびラット由来 T1Rsのアミノ酸配列とを比較し，ヒトのアミノ酸配列を基に受容体の点変異体を作製し検討がなされた．その結果アスパルテーム，ネオテームに対する応答には，ヒトT1R2のSer144およびGlu302が重要であることが示された．さらに近年，T1R2-T1R3の甘味受容体モデルを用い，低分子甘味物質（アスパルテーム，^D-トリプトファン，サッカリン，アセスルファムK，スクラロー

ス）との応答に関する受容体のアミノ酸残基が詳細に特定されており，アミノ酸誘導体，スルファミン酸類，糖アナログの3種の構造が異なる甘味物質がどのような選択性で受容体の応答に寄与しているか精緻に検討が行われている^（38）．一方シクラメートはヒト型T1R3のTMD が関与していることが同様の実験で示されている．以上のことから，甘味受容体T1R2-T1R3には多くの甘味物質に対するリガンド結合部位が存在し，さまざまな構造をもつ甘味物質に対して幅広く対応していると考えられる．

甘味タンパク質の甘味受容体応答部位の探索先述の種間の甘味物質に対する感受性の違いを利用し，モネリンの応答にはT1R2が，一方ブラゼインは T1R3が関与していることが見いだされた^（39）．さらにブ

図6^■甘味受容体

上図：甘味受容体のサブユニットはおよそ500アミノ酸残基からなる細胞外ドメイン（NTD）, その下流に50 アミノ酸残基ほどのシステインリッチ領域（CRD）を有し，さらに300アミノ酸残基からなるC末側膜貫通領域（TMD）を有する．Cartoon図はグルタミン酸受容体（2e4u）アドレナリン受容体（3p0g）の構造をもとに，modeller （9.10）を用いて作製した．下図：Wedge model．ドメインの配置が「Open」型（左）と

「Closed」型（右）の平衡状態にあり，

リガンド存在下では活性状態を示す

「closed-open/A」の構造（右側）になる．低分子甘味物質の場合，結合部位に結合し活性型となるが，甘味タンパク質の場合，低分子甘味物質の結合部位ではなく，受容体に楔

（wedge）を打ち込むような様式で活性状態になる．

図7^■甘味受容体と甘味物質の相互作用部位

(8)

ラゼインの認識にはヒトT1R3のCRDに存在する Ala537とPhe540が関与していることが明らかとなった．また，この部位における変異体が，わずかではあるが低分子甘味料（ショ糖，^D-トリプトファン，サッカリン，アスパルテーム）やモネリンに対する受容体活性に影響を与えていたことから，T1R3のCRDが甘味受容体として機能するうえで重要な役割を担っていると示唆されている．また，ネオクリンの応答にはヒトT1R3の NTDが^（40），ソーマチンの応答にはヒトT1R3のCRDがかかわっていると示唆され，近年CRD中の5つのアミノ酸残基が応答に重要な役割を担うとの結果が得られている^{（41, 42）} （図7）．

甘味受容体モデルを用いた甘味タンパク質とのドッキングシミュレーション

T1Rsは現時点でそれらの立体構造は決定されていないが，甘味受容体と同じファミリーに属する代謝型グルタミン酸受容体（mGluR）については構造が決定されている．グルタミン酸受容体はホモ二量体からなり，N末端側にあるLB1とLB2ドメインの間にグルタミン酸を結合する．通常リガンド物質非存在下では，ドメインの配置が「Open」型と「Closed」型の平衡状態にあり，リガンド存在下では活性状態を示す「closed-open/A」の構造に，アンタゴニスト存在下では非活性状態である

「open-open/R」に柔軟に構造を変化させる（図6）．この構造を鋳型としてT1R2-T1R3のモデルが構築され，

甘味物質との応答や活性化モデルが提唱されている^（43）．このモデルでは，甘味タンパク質の正電荷部位と，

T1R3細胞外ドメイン中央部の負電荷部位とが静電的相互作用することによって，T1R2-T1R3の活性化状態を安定化している．甘味タンパク質間には配列相同性や構造類似性はないが，その表面上にくさび（wedge）の様な構造的特徴をもち，T1R3中央部に大きくはまり込むことができる．この甘味タンパク質‒甘味受容体の結合モデルは wedge model と呼ばれている（図6）．甘味タンパク質の研究において，甘味発現に関与しているアミノ酸残基は，甘味タンパク質分子表面上の比較的広い範囲に存在していることが明らかになっており，甘味受容体との相互作用には分子表面の広い範囲が関与すると

いう “wedge model” を間接的に支持するものとなって

いる．モネリンの甘味発現について受容体とのドッキングシミュレーションに基づき検討がなされた^（18）．受容体と相互作用すると予測される面の縁に存在する Met42 （Met42B）, Tyr63 （TyrA11）と，中央に位置している Tyr65 （TyrA13）, 甘味に寄与する酸性残基

Asp68に着目し変異体を作製した．その結果，グルタミン酸に置換した変異体（M42E, Y63E, Y65E）やD68R変異体はいずれも甘味が減少した．一方，アルギニンに置換した変異体（M42R, Y63R）も甘味が減少したが，正電荷を増加させる置換よりも負電荷を増加させる置換のほうが甘味に与える影響が強い傾向があった．一方，

Y65R変異体ではwild-typeより1.6倍ほど甘味が強くなる結果となった．このように受容体とのドッキングモデルを用いることで，さらに甘いタンパク質をデザインすることも可能であると期待される．しかしながら相当数の変異体タンパク質やアナログの構造活性相関の結果をもとに受容体のモデル構造の有用性が導き出されているのも現況である．

このwedge modelとは別に，ブラゼイン変異体のデータを参照にして受容体とのドッキングシミュレーションが行われ，ブラゼインはT1R2のNTDにも結合しうることが示された^（44）．さらに「より甘い」ブラゼイン変異体の作製も試みられている^（44）．甘味が強くなった変異体（E41A, D50K, D29A/E41K, D29N/E41K, D29K/E41K）ではそれらアミノ酸残基の側鎖は受容体モデル上では酸性アミノ酸と相互作用すると考えられるため，電荷の反発を減少させる変異により甘味が強くなる．またY54Wの変異により甘味が強くなるのは，54 番目の側鎖が受容体の疎水ポケットと相互作用する環境下にあり，より疎水性が増加する変異が甘味増加に適していると考えている．しかしながら，D40AやD40Kの変異体では，結果として甘味が増加したが，この残基は受容体と直接相互作用しているとは考えられておらず，

変異を行うことでブラゼイン自身の局所構造を安定化させることにより甘味が増加したとの見解をしている．近年，ブラゼイン変異体と甘味受容体との相互作用については，ブラゼイン，受容体双方の部位特異的変異体による解析も試みられており，甘味タンパク質のなかでは最も構造活性相関の情報が多いタンパク質である^（45）．ソーマチンの場合も，同様にドッキングシミュレーションがなされたが，モネリン，ブラゼインに比べ変異体の情報がまだ少なく，精度高い相互作用解析は困難な状況下にある^（46）．多くの甘味物質はT1R2のNTD領域と相互作用する一方で，ソーマチン，ブラゼインの応答にはヒトT1R3のCRD領域，ネオクリンはT1R3のNTD領域が重要であると報告されており（図7），T1R3は新規甘味料創出のターゲットとなり得る可能性を秘めている．

受容体モデルから予想される結果と受容体発現細胞を用いた応答実験の結果との間には，検討を要する点が

(9)

多々ある．たとえば分子量の大きいタンパク質が，本当に細胞膜に近いCRD領域と相互作用しているのか，単に情報伝達過程に影響を与え応答性を変化させているのではないかという点である．また，受容体モデルで用いられるmGluRがホモ二量体であるのに対して，甘味受容体がヘテロ二量体であり，かつそれらの配列の相同性が26%程度であることを鑑みると，現行のモデルが実際の構造を厳密に反映しているかという点である．いずれにせよ甘味受容体の構造が明らかになり，各甘味物質に対する受容認識機構が明らかになることが待たれる．

おわりに

本稿では甘味タンパク質ソーマチンを中心に甘味タンパク質の構造，甘味活性相関を中心に述べてきた．ソーマチンは単に甘味を呈するだけでなく，苦味や渋味を抑制する作用や，風味を増強する作用をもつことも知られ，非常に興味深いタンパク質であり，これら多彩な機能についても筆者らは研究を開始している．甘味受容体の発見以降，甘味物質がどのように受容体を活性化し，

「甘い」という情報を伝達しているかについて多くの研究がなされているが，甘味受容体をはじめとする味覚受容体が舌上だけでなく，消化管などにも発現しており，

消化管ホルモンの分泌制御，トランスポーターの発現にも深く関与していると報告されている^{（47〜49）}．今後甘味タンパク質の詳細な構造情報をもとに受容体の活性化機構を精査することで，新規な甘味料のデザインも可能になるかもしれない．さらにタンパク質は糖類に比べ低カロリーであり，ショ糖代替甘味料の可能性をも有している．しかしながら，ショ糖特有の味質や物性をもつ甘味料は，再現されておらず，今後新規な甘味料をデザインするうえで重要な検討課題であると言えよう．

謝辞：本総説で紹介したソーマチンの構造解析の一部は大型放射光施設 SPring-8 （BL26B1, BL38B1）で行われた（課題番号：2009A1096, 2009B1379, 2010B1064, 2011B1073, 2012A1048, 2012B1067）.

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プロフィル

桝田哲哉（Tetsuya MASUDA）

＜略歴＞1994年京都大学農学部食品工学科卒業／1996年同大学院農学研究科食品工学専攻修士課程修了／1998年同大学食糧科学研究所助手／2001年同大学大学院農学研究科食品生物科学専攻助手／2006

〜 2007年カリフォルニア大学ロスアンゼルス校医学部客員研究員／2007年京都大学大学院地球環境学堂助教（併任）／2012 年同大学大学院農学研究科食品生物科学専攻助教＜研究テーマと抱負＞味覚関連タンパク質の構造生物学的解析，食品（タンパク質，糖類）の受諾性，構造特性を明らかにしたいと思っていますが甘くないです＜趣味＞迷酒と珍味を楽しむ（健康に気をつけながら）．寺社探訪（健康祈願）．熱帯魚飼育（飼い主に似て小太りです）