耐熱化酵素を好熱菌細胞内で創る - J-Stage

今日の話題

428

化学と生物 Vol. 52, No. 7, 2014

耐熱化酵素を好熱菌細胞内で創る

好熱菌適応進化の使い道

筆者らは「耐熱性酵素を好熱菌細胞内で作る」研究を 行っているが^（1）

，近年では「耐熱化酵素を好熱菌細胞内

で創る」ことにも興味をもっている．本稿では，好熱菌 を利用した耐熱化変異酵素の創出法について話題を提供 したい．

酵素はタンパク質性の触媒で，生命活動におけるさま ざまな化学反応を担う．これらは触媒条件が温和で，反 応選択性が高く，種類も豊富であることから，幅広い分 野で応用利用されており，その世界市場は四千億円以上 と言われる．しかしながら，酵素はタンパク質であるが ゆえに容易に変性し，その機能を失う．この不安定性と いう弱点は，酵素触媒の実用性を低める大きな原因にも なりうる．この点については，優れた物理化学的安定性 を示す高度（超）好熱菌由来の耐熱性酵素が有利である が，このような酵素は常温での活性が概して低く，化成 品生産や臨床検査など常温領域での酵素反応を必要とす る分野では利用しにくい．そこで期待されるのが「任意 酵素を適度に耐熱化し，常温高活性を維持したまま，常 温での保存性と触媒寿命を飛躍的に向上させる技術」と なる．

このような技術を考えるうえで，好熱菌を用いたカナ マイシンヌクレオチド転移酵素（KNT）の耐熱化研究 は興味深い．KNTは宿主にカナマイシン耐性を付与す る酵素で，pUB110（黄色ブドウ球菌プラスミド）由来

のKNT^pUB110遺伝子は薬剤選択マーカーとして広く用い

られている．その細胞内機能温度は約55℃が上限であ る が，そ の 一 方 で 好 熱 菌 プ ラ ス ミ ドpTB19由 来 の

KNT^pTB19遺伝子は，その発現産物の熱安定性を理由に

65℃でも機能する^（2）

．KNT

^pTB19はKNT^pUB110のT130K アミノ酸置換体に相当し，その遺伝子は好熱菌に取り込 まれたKNT^pUB110遺伝子から細胞内自発的変異により発 生したと想像できる．同様な現象は実験室内においても 再現されており，KNT^pUB110遺伝子を有する好熱菌

 1174をカナマイシン存在下 で高温培養すると，耐熱化したKNT^TK1（D80Y置換体，

機能温度上限63℃）とKNT^TK101（D80Y/T130K二重置 換体，機能温度上限69℃）の遺伝子が得られる^（3）

．ま

たKNT^pUB110遺伝子の化学変異ライブラリを

CU21を宿主として構築し，カナマイシン 存 在 下 で 高 温 培 養 し た 場 合 も，類 似 の 耐 熱 化KNT

（D80Y置換体とT130K置換体）の遺伝子が得られる^（4）

．

さらに高度好熱菌  HB27を宿主 としたKNT^TK101遺伝子のランダム変異ライブラリから は，81℃でも機能する耐熱化KNTの遺伝子が得られて いる^（5）

．以上の結果は，①アミノ酸一置換でも十分な酵

素耐熱化が起こりうること，②好熱菌は酵素耐熱化のス クリーニング宿主として有用であること，および③化学 変異原処理と同様に好熱菌細胞内の自発的変異もDNA 変異導入法として有用であること，を示している．

上記①〜③を動機に，筆者らは好熱菌を利用した耐熱 化変異酵素の創出法を研究している．本手法では，好熱 菌宿主に対象遺伝子を導入し，細胞内の自発的変異を利 用しながら変異遺伝子を発生させる（図

1

_）

_{．その際，}

対象遺伝子発現産物（酵素）の活性に依存した生育選択 圧をかけられれば，高温培養下でも活性を示す（すなわ ち耐熱化された）酵素ならびにその遺伝子を容易に選別 できる．つまりKNT^TK101遺伝子の創出過程（上記参照）

を，進化工学として体系化しようという考えだ．宿主に は  HTA426を 使 用 し て い る．

本好熱菌はマリアナ海溝深海から単離された好気性のグ ラム陽性桿菌で，遺伝子組換えが可能であり^{（1, 6〜8）}

，全

ゲノム配列も公開されている^（9）

．42℃から74℃という

幅広い温度範囲で生育することから，中温から高温にか けての段階的な酵素耐熱化選択が可能だ．実際には DNA修復系遺伝子を破壊した高変異性株MK480を宿主 と し て 利 用 し て い る．MK480株 中 で は，そ の 親 株 MK242中よりも10⁴倍ほど高い確率で自発的変異が起こ り，あらゆる塩基置換が起こりうる．

本手法を用いて，中温菌 由来の 遺伝子 （ ） の高温機能化を試みた．本遺伝子は ピリミジン塩基の生合成に必須で，MK242株とMK480 株は内在性 遺伝子を欠失しているためウラシル要 求性を示す． 遺伝子をMK242株に導入したとこ ろ，得られた株は65℃ではウラシル原栄養性を，70℃

ではウラシル要求性を示した．つまり 遺伝子の 細 胞 内 機 能 温 度 は65

℃が 上 限 と 言 え る．

と こ ろ が

今日の話題

429

化学と生物 Vol. 52, No. 7, 2014

遺伝子を有するMK480株を，ウラシルを含まな い最少培地中70℃で培養すると，二日後に生育してき た．得られた細胞が有する 遺伝子を解析したと ころ，C497T変異（A166 Vアミノ酸変異）が見いださ れた．本変異遺伝子 （ ） をMK242株に再導入 しても，得られた株は70℃でウラシル原栄養性を示し た．組換えタンパク質を用いた実験からも，BSpyrF^e1 酵素はBSpyrF酵素よりも熱安定であることが確認でき た．KNT^TK101遺伝子が 細胞内で 発生したように，どうやら 細胞内でも 耐熱化酵素遺伝子が発生するようだ．なおMK242株中 で は 遺 伝 子 が 発 生 し な か っ た こ と か ら，

MK480株はMK242株よりも変異遺伝子の発生に有用と 考えられる．

さらに同手法によって， 由来チ

オストレプトン耐性遺伝子 （ ） と

由来クロラムフェニコール耐性遺伝子 （ ）  から，各々の変異遺伝子 （C772T変異，H258P コドン変異）と （G412A変異，A138Tコドン 変異）を取得した．これら変異遺伝子をMK242株に再 導入して細胞内機能温度を調べたところ， 遺 伝子は 遺伝子よりも上限温度が5℃ほど高かっ た． 遺伝子と 遺伝子の上限温度は同等 であったものの， 遺伝子は 遺伝子より も高温領域での機能性に優れていた．これら両変異遺伝 子の発現産物（酵素）は，試験管内での熱安定性も向上 していた．以上の結果は，本手法が耐熱化変異酵素遺伝 子の創出に有用であることを示唆している．

上述したモデル実験における酵素耐熱化は決して大幅 なものではなかったが，見いだされた変異を飽和変異法

などにより追及すればさらなる耐熱化も可能であろう．

また，これら変異酵素の耐熱化は酵素活性に基づく生育 選択圧を 細胞にかけることで容易に選 別できたが，多くの酵素については作業が煩雑な試験管 内スクリーニングによって耐熱化変異を選別する必要が ある．この課題については，対象酵素とレポーター酵素 を融合させることで対象酵素の熱変性を評価する手法が 提案されているほか^（10）

，筆者らも新たな耐熱化スク

リーニング手法を検討している．このような方法が確立 されれば，好熱菌を用いた「耐熱化変異酵素の創出法」

は，さまざまな有用酵素を産業界に導出できる技術へ発 展すると期待している．

謝辞：本稿で紹介した研究は，生研センターイノベーション創出事業の 支援を受けて行った．

  1） H. Suzuki, K. Yoshida & T. Ohshima : , 79, 5151 （2013）.

  2） T. Imanaka, M. Fujii, I. Aramori & S. Aiba : ,  149, 824 （1982）.

  3） H. Liao, T. McKenzie & R. Hageman : , 83, 576 （1986）.

  4） M.  Matsumura  &  S.  Aiba : , 260,  15298 

（1985）.

  5） J.  Hoseki,  T.  Yano,  Y.  Koyama,  S.  Kuramitsu  &  H. 

Kagamiyama : , 126, 951 （1999）.

  6） H.  Suzuki  &  K.  Yoshida : , 22,  1279 （2012）.

  7） H.  Suzuki,  A.  Murakami  &  K.  Yoshida : , 78, 7376 （2012）.

  8） H. Suzuki, K. Wada, M. Furukawa, K. Doi & T. Ohshima :   , 77, 2316 （2013）.

  9） H. Takami, Y. Takaki, G. J. Chee, S. Nishi, S. Shimamura,  H. Suzuki, S. Matsui & I. Uchiyama : ,  32, 6292 （2004）.

10） H. Chautard, E. Blas-Galindo, T. Menguy, L. GrandʼMour- sel, F. Cava, J. Berenguer & M. Delcourt : ,  4, 919 （2007）.

（鈴木宏和，小林淳平，九州大学大学院農学研究院）

図1^■好熱菌を利用した耐熱化変異酵素の創出

好熱菌に対象遺伝子を導入し，変異遺伝子ライブラリを発生させる．その中から耐熱化変異酵素の遺伝子を，酵素活性に基づいた生育選択 圧もしくは活性スクリーニングにより選別する．培養温度が高温であるため，耐熱化していない酵素は熱変性により活性を示さない．

今日の話題

430

化学と生物 Vol. 52, No. 7, 2014

プロフィル

鈴木 宏和（Hirokazu SUZUKI）    

＜略歴＞1999年東北大学工学部生物化学 工学科卒業／2004年同大学大学院工学研 究科生物工学専攻博士課程修了，博士（工 学）／同年東京大学大学院農学研究科博士 研究員／2007年理化学研究所基礎科学特 別研究員／2008年神戸大学自然科学系先 端融合研究環特命助教／2011年九州大学 大学院農学研究院客員准教授／2014年鳥 取大学大学院工学研究科准教授＜興味を もっていること＞有用微生物群の遺伝子改 変技術をいかに迅速に確立するか＜趣味＞

温泉，逍遥

小林 淳平（Jyumpei KOBAYASHI）  

＜略歴＞2006年日本大学生産工学部応用 分子化学科卒業／2012年同大学生産工学 研究科応用分子化学専攻博士後期課程修 了／同年九州大学農学研究院学術研究員／

2014年鳥取大学大学院工学研究科プロ ジェクト研究員＜研究テーマと抱負＞有用 な酵素を創出し，バイオマスのエネルギー 変換や医療へ応用したい＜趣味＞読書，猫 の世話