Hsp70の酸性複合糖質結合活性の発見 - J-Stage

典型的なシグナル配列をもたないタンパク質が細胞外に輸送 さ れ る こ と が し ば し ば あ る．細 胞 質 分 子 シ ャ ペ ロ ン で あ る 70-kDa熱 シ ョ ッ ク タ ン パ ク 質（Hsp70） も そ の 一 つ で あ る．

筆 者 ら は，ウ ニ の 受 精 に 関 す る 研 究 に 端 を 発 し，マ ウ ス

Hsp70が細胞外に局在するスルファチドやガングリオシド，

グリコサミノグリカンといった酸性複合糖質と相互作用し，

特徴的な高分子量複合体を形成することを発見した^(1〜3)．本 稿では，まずHsp70の酸性複合糖質結合活性の発見に至った 経緯を紹介し，この結合活性がHsp70の細胞外における機能 にどうかかわるのかを議論する．

ウニの受精における糖脂質の機能

ウニの受精において，先体反応後の精子細胞膜が卵の 卵膜に接着する過程が存在する（図

1

_）

_{．この過程にお}

いて，卵膜に局在する精子結合タンパク質（SBP）と精 子細胞膜脂質ラフトに濃縮して存在する主要ガングリオ

シ ド（Neu5Ac

α

2,8Neu5Ac

α

2,6GlcCerお よ びNeu5Ac

α

2,6GlcCer）とのシアル酸依存的な結合が，ウニの受精 の成立において極めて重要な役割を果たすことを筆者ら の研究グループが発見した⁽⁴⁾

．SBPはそのN末端に存在

する属非特異的精子結合ドメインを介して精子ガングリ オシドと結合する．興味深いことに，SBPのガングリオ シ ド 結 合 ド メ イ ン は70-kDa熱 シ ョ ッ ク タ ン パ ク 質

（Hsp70）ファミリータンパク質のN末端領域と40〜

60％の相同性を示す⁽⁵⁾

．このことから，Hsp70ファミ

リータンパク質もまた，シアル酸依存的にガングリオシ ドと相互作用する能力をもつのではないかという仮説を 立てるに至った．

Hsp70の糖脂質結合活性の発見

Hsp70は細胞質に局在する分子シャペロンで，変性タ ンパク質の凝集を抑制する機能をもつ．Hsp70は大きく 分けてN末端側のATPaseドメインとC末端側のペプチ ド結合ドメインから構成される（図

2

_A）

_{．この2つのド}

メインは機能的にリンクしており，ATPを加水分解す ることによってHsp70の立体構造が変化し，ペプチド

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【解説】

Binding Activity of Hsp70 toward Acidic Glycoconjugates: An  Unexpected Role of Sugars

Yoichiro HARADA, Chihiro SATO, Ken KITAJIMA, *¹ _鹿児島大 学大学院医歯学総合研究科システム血栓制御学講座，*² _名古屋大 学大学院生命農学研究科生物機能開発利用研究センター

Hsp70の酸性複合糖質結合活性の発見

糖の意外な働き

原田陽一郎 * ¹ _{，佐藤ちひろ} * ² _{，北島 健} * ²

結合ドメインを介して変性タンパク質と強固に結合する

（図2B）

．

哺乳類由来のHsp70のATPaseドメインはウニSBP のガングリオシド結合ドメインと高い相同性を示すこ とから⁽⁵⁾

，Hsp70もガングリオシドと結合することが

予想された．そこで，マウスHsp70とガングリオシド GM3（NeuAc

α

2,3Gal

β

1,4Glc-Cer）およびGD3（NeuAc

α

2,8NeuAc

α

2,3Gal

β

1,4Glc-Cer）との相互作用をenzyme-

linked immunosorbent assay（ELISA）で解析したとこ ろ，Hsp70はプレートに固相化されたGM3およびGD3 とは結合しないことがわかった⁽¹⁾

．一方，native-PAGE

によってHsp70‒ガングリオシド間の相互作用を解析し たところ，いずれのガングリオシドの存在下においても Hsp70が高分子量側にシフトした．この結果は，Hsp70 がガングリオシドと高分子量複合体を形成することを示 し て い る．し か し，Hsp70は シ ア ル 酸 を も た な い LacCer（Gal

β

1,4Glc-Cer）とは高分子量複合体を形成し なかったことから，Hsp70はガングリオシドとシアル酸 依存的に相互作用し，高分子量複合体を形成することが 図1■先体反応後のウニ精子と卵との相互作用のモデル

図2^■Hsp70のドメイン構造（A）と基質ペプチドとの相互作

用（B）

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シャペロンとは，女性が社交界デビューするとき に付き添う年上の女性のことを指す．われわれの細 胞の中で活躍している分子シャペロンは，エネルギー 通貨であるATPを利用しながら生まれたてほやほや のタンパク質に結合し，それらが正常な立体構造を形 成するのを助ける分子である．この分子シャペロン の一つであるHsp70は普段，細胞質と呼ばれる細胞 内の領域でタンパク質の立体構造形成の手助けをし ている．しかし，ひとたび細胞が熱などのストレスに さらされると，Hsp70は付き添っているタンパク質と 一緒に細胞外に放出される．細胞外Hsp70は，この 基質タンパク質を抗原提示細胞などの免疫細胞に受 け渡し，免疫システムを活性化する．すなわち，細 胞外に存在するHsp70は生体にとって危険信号なの である．このように，Hsp70には細胞の内と外で異な る重要な任務があるのだが，その中心となるHsp70 のシャペロン機能が本来の基質（タンパク質やATP）

ではない酸性複合糖質によって調節されるとは驚き である．

複合糖質とは，鎖状に連なった糖（糖鎖）がタンパ ク質や脂質に共有結合した物質であり，食品などに

含まれる糖質とは構造も役割も違う．細胞の外側に 目を向けてみると，多種多様な複合糖質が細胞やタ ンパク質の働きを調節している．そのなかで，酸性 を示す複合糖質の一つであるスルファチドはHsp70 のオリゴマー化を誘導するユニークな性質をもつ．

Hsp70はATPを加水分解するATPaseドメインと，

タンパク質に結合するペプチドドメインをもつ．ス ルファチドはこの両方のドメインに結合するが，

Hsp70のオリゴマー化の誘導にはATPaseドメインと の相互作用が必須である．このHsp70のオリゴマー 化は生物学的に何か意味をもつのだろうか？ 興味 深いことに，Hsp70オリゴマーは基質タンパク質と強 く結合する．これは，Hsp70のオリゴマー化によって ペプチド結合ドメインが密集するためであると考え られる．では，なぜHsp70はオリゴマー化してまで 基質タンパク質と強固に結合しなければならないの か？ その答えはまだわからない．しかし，細胞外 Hsp70が基質タンパク質を免疫細胞に受け渡すことが 免疫の活性化に重要であるならば，細胞外という無 限希釈の環境では，あらかじめHsp70と基質タンパ ク質との結合を安定化させておくのも合目的的であ ると言えよう．

コ ラ ム

明らかとなった．次に，Hsp70のガングリオシド結合ド メインを同定するため，部位欠失変異体を調製し，

GM3およびGD3との相互作用を解析した．その結果，

Hsp70はATPaseドメインおよびペプチド結合ドメイン の両方でガングリオシドと相互作用し，高分子量複合体 を形成することがわかった．

Hsp70はガングリオシドのシアル酸残基を認識するこ とから，ほかの酸性糖脂質とも相互作用する可能性が考 えられた．この点に関して，病原性微生物や哺乳類の精 子表面に発現するHsp70がTLCプレートに固相化され たスルファチド（3- -sulfogalactosylceramide）と結合 することが知られていた^(6〜8)

．またわれわれの研究グ

ループは，ウニSBPもELISAプレートに固相化された スルファチドに結合することを明らかにしていた⁽⁴⁾

．さ

らに筆者らは，マウスHsp70とスルファチドとの相互 作用をnative-PAGEで解析したところ，スルファチド の存在化においてHsp70高分子量複合体が形成される ことが明らかとなった⁽¹⁾

．興味深いことに，この複合体

の分子量はガングリオシドの存在下で形成されるものよ りはるかに巨大で，ATPaseドメインだけが複合体形成 に関与することがわかった．以上の結果から，マウス Hsp70はガングリオシドやスルファチドを認識し，その 相互作用は特徴的なHsp70の高分子量複合体の形成を 誘導することが明らかとなった．

Hsp70‒スルファチド間の相互作用によるHsp70の 機能調節

次に，Hsp70の酸性糖脂質結合活性がHsp70の機能に どうかかわるのかを明らかにするため，スルファチドに よって誘導されるHsp70高分子量複合体の性質を詳細 に調べた⁽³⁾

．スルファチドは細胞表面に局在するため，

Hsp70との相互作用は細胞外で起こるはずである．そこ で，イオン環境が細胞内外で異なることに着目し，スル ファチド誘導性のHsp70高分子量複合体の形成におけ るK^＋およびNa^＋の効果を調べた．その結果，いずれの イオン環境下においてもスルファチドはHsp70高分子 量複合体の形成を誘導した．しかし，細胞内に豊富に存 在するヌクレオチド（ATPまたはADP）が共存する と，K^＋存在下においてのみHsp70高分子量複合体の形 成が完全に阻害された．これらの結果は，Hsp70‒スル ファチド間の相互作用による高分子量複合体の形成が細 胞外で起こりうることを支持している．

Native-PAGEによる解析から，スルファチド誘導性の Hsp70高分子量複合体の分子量が非常に大きいことが示 唆された．そこで，Hsp70高分子量複合体の分子量をゲ

ルろ過クロマトグラフィーで推定したところ，440〜

669 kDa以上の幅広い分布を示した．一方，水溶液中で ミセルを形成するスルファチドは669 kDa以上の画分だ けに検出された．このことから，Hsp70はスルファチド ミセルと会合して見かけ上の分子量が大きくなるのに加 え，スルファチドがHsp70自身のオリゴマー化を誘導 する可能性が考えられた．そこで，Hsp70高分子量複合 体を化学架橋後，SDS-PAGEを行ったところ，スル ファチドの存在下においてHsp70のラダーが観察され たことから，スルファチドはHsp70のオリゴマー化を 誘導することが明らかとなった．さらに，部位欠失変異 体を用いて解析した結果，スルファチド誘導性のHsp70 オリゴマー化はATPaseドメインを介して起こり，ペプ チド結合ドメインは必要ないことがわかった．このこと から，スルファチド誘導性のHsp70オリゴマーはペプ チド結合活性を有していると考えられた．そこで，

Hsp70と変性タンパク質との相互作用をゲルろ過クロマ トグラフィーで解析したところ，スルファチドによって 形成されたHsp70高分子量複合体は変性タンパク質と 安定な複合体を形成する一方，Hsp70モノマーは複合体 を形成しないことがわかった．この結果から，スルファ チドがHsp70のオリゴマー化を誘導することによって 機能的なペプチド結合ドメインがクラスター化され，

Hsp70と変性タンパク質との親和性が高まることが示唆 された．以上の結果から，スルファチドはHsp70のシャ ペロン機能を調節することが明らかとなった．

がん細胞から放出されるHsp70は抗がん作用を示す ことが知られている^(9, 10)

．これは，Hsp70ががん抗原ペ

プチドと結合していて，それが抗原提示細胞に取り込ま れることによって免疫システムを賦活化するためである と考えられている．この性質を利用して，Hsp70を抗原 ペプチドのキャリアとして利用する試みが盛んに行われ てきている．スルファチドを用いたHsp70のオリゴ マー化は，Hsp70の抗原キャリアとしての機能を増幅さ せる手段になるかもしれない．

Hsp70と酸性複合糖質との相互作用

最後に，Hsp70が糖脂質以外の複合糖質と相互作用す るのか，という疑問点をさまざまな人工糖鎖ポリマーを 用いて検証した⁽²⁾

．予想どおり，Hsp70はスルファチド

の親水基（3-S-Gal

β

-）を有する糖鎖ポリマーの存在下に おいて高分子量複合体を形成した．この複合体は，スル ファチドによって誘導されるものより分子量が小さいこ とが示唆されたことから，アグリコン部分もHsp70高

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分子量複合体の形成に関与する可能性が考えられた．さ らに，

β

-3-S-Gal配糖体ではHsp70複合体の形成は観察さ れなかったことから，

β

-3-S-Gal構造がポリマー上にクラ スター化されることがHsp70複合体の形成に重要であ ることが示された．また，Hsp70はさまざまな硫酸化単 糖（6-S-GalNAc

β

-, 3-S-GlcNAc

β

-お よ び4-S-GlcNAc

β

-）

や分岐型ジシアリルGalNAc［NeuAc

α

2,3（NeuAc

α

2,6）

 GalNAc

α

-］をもつ糖鎖ポリマーと相互作用し，Hsp70 複合体を形成した．一方，GlcNAcやモノシアリル化 GalNAc糖 鎖 ポ リ マ ー，コ ロ ミ ン 酸（

α

2,8結 合 し た NeuAcのポリマー）の存在下ではHsp70複合体は形成 されなかった．以上の結果から，Hsp70はクラスター化 された特定の酸性糖鎖と相互作用することが明らかと なった．

グリコサミノグリカンは天然に見いだされる硫酸化糖 鎖ポリマーである．これまでの研究から，Hsp70の ATPaseドメインにはヘパリン結合配列が存在すること が知られていたが，ヘパリンアフィニティークロマトグ ラフィーではHsp70‒ヘパリン間の結合は観察されてい なかった⁽¹¹⁾

．しかしわれわれは，native-PAGEおよび

ゲルろ過クロマトグラフィー解析の結果からHsp70が ヘパリンと相互作用し，複合体を形成することを明らか にした．さらに，種々のグリコサミノグリカンのうち，

Hsp70はヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸と相互作用 した．これらのグリコサミノグリカンは，2- -硫酸化イ ズロン酸を共通して含む．このことから，2- -硫酸化イ ズロン酸がHsp70との相互作用に重要であることが示 唆された．ヘパリンやヘパラン硫酸は細胞表面や細胞外 マトリクスに普遍的に存在する．したがって，細胞外に 放出されたHsp70がこれらのグリコサミノグリカンを 介して細胞表面に濃縮される可能性が考えられた．

おわりに

われわれは，ウニの受精に関する研究に端を発し，マ ウスHsp70が酸性糖脂質やグリコサミノグリカンと いったさまざまな酸性複合糖質と特徴的な複合体を形成 することを見いだした．Hsp70複合体といっても，na- tive-PAGEで検出されるサイズやパターンは相互作用す る複合糖質によってさまざまで，スルファチドでは Hsp70のオリゴマー化を誘導することが複合体形成のメ カニズムであった．スルファチドのほか，ガングリオシ ドGM3はHsp70のオリゴマー化を誘導したのに対し，

GD3の存在下ではHsp70オリゴマーは検出できなかっ た（原田，佐藤および北島，未発表）

．このことから，

Hsp70複合体の実態は相互作用する複合糖質の構造に よって異なることが予想される．このHsp70複合体の 違いがHsp70の機能調節にどのように関与するかを明 らかにしていくことが今後の課題であるが，その一端と して，スルファチドがHsp70のオリゴマー化を誘導す ることによって基質タンパク質との結合を安定化させる ことを明らかにした．このことは，Hsp70のアジュバン ト機能を考えるうえで興味深い．Hsp70と複合体を形成 した抗原ペプチドは，ペプチド単独に比べてT細胞の活 性化を強く誘導する⁽¹²⁾

．したがって，Hsp70がオリゴ

マー化することによって抗原ペプチドとの親和性が上昇 し，T細胞の活性化をより強力に誘導できるかもしれな い．また，ミエリン鞘に多く存在するスルファチドは多 発性硬化症の抗原として同定されており⁽¹³⁾

，スルファ

チドが何らかの機構でHsp70と複合体を形成すること によって免疫原性が亢進する可能性も考えられる．

本稿ではHsp70と酸性複合糖質との相互作用を中心 に紹介してきたが，筆者らはHsp70がさまざまな酸性 リン脂質とも複合体を形成することも報告している⁽¹⁾

．

これに関連して，Hsp70はホスファチジルセリン（PS）

を含む脂質二重膜中でオリゴマー化し，チャネルを形成 することが報告されている⁽¹⁴⁾

．Hsp70とPSを含む脂質

二重膜との相互作用は，細胞内に存在するHsp70が細 胞膜表面に移行するメカニズムに関係する可能性があ る．すなわち，細胞内Hsp70が細胞膜の内側に偏在す るPSと結合し，チャネルを形成することによって細胞 表面に反転する，という仮説である．今後，Hsp70の酸 性複合糖質やリン脂質結合活性に着目することによっ て，シグナル配列をもたないタンパク質の細胞外輸送機 構に関する新たな側面が見えてくるかもしれない．

文献

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プロフィール

原田 陽一郎（Yoichiro HARADA）

＜略歴＞2001年静岡大学農学部応用生物 化学科卒業／2003年同大学大学院農学研 究科修士課程修了／2007年名古屋大学大 学院生命農学研究科博士課程修了／同年同 大学生物機能開発利用研究センター研究補 助員／同年同大学博士研究員／同年De- partment of Biochemistry and Cell Biolo- gy, Stony Brook University, 博士研究員／

2010年理化学研究所糖鎖代謝学研究チー ム特別研究員／2015年鹿児島大学大学院 医歯学総合研究科システム血栓制御学講座 特任准教授＜研究テーマと抱負＞エクソ ソームの糖鎖生物学，糖鎖の生合成経路

＜趣味＞サッカー，フットサル

佐藤 ちひろ（Chihiro SATO）

＜略歴＞1992年東京大学理学部生物化学科卒業／1994年同大学大 学院理学系研究科修士課程修了／1996年日本学術振興会特別研究 員DC2／1997年東京大学大学院理学系研究科博士課程修了（理学 博士取得）／同年日本学術振興会特別研究員PD／1998年同特別研 究員PD／2001年名古屋大学生物分子応答研究センター研究機関 研究員／同年同大学大学院生命農学研究科応用分子生命化学専攻 助教／2004年同大学生物機能開発利用研究センター准教授＜研究 テーマと抱負＞酸性多糖（特にポリシアル酸）の構造と機能およ び応用展開

北 島  健（Ken KITAJIMA）

＜略歴＞1982年東京大学理学部生物化学科卒業／1984年同大学大 学院理学系研究科修士課程修了／1987年同博士課程修了／同年日 本学術振興会特別研究員PD／1989年東京大学大学院理学系研究 科助手／1996年名古屋大学農学部助教授／2004年同大学生物機能 開発利用研究センター教授＜研究テーマと抱負＞細胞膜マイクロ ドメインに着目した受精の分子機構の解明研究，シアル酸とポリ シアル酸の多様性とその意義の解明研究＜趣味＞言葉遊び

Copyright © 2017 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.55.22

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