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의학박사 학위논문
생쥐의 수술 후 복강내 유착형성에서
Transglutaminase 2 의 역할
2014 년 2 월
서울대학교 대학원
의학과 외과학 전공
라 환 도
생쥐의 수술 후 복강내 유착형성에서
Transglutaminase 2 의 역할
지도 교수 민 승 기
이 논문을 의학박사 학위논문으로 제출함
2013 년 10 월
서울대학교 대학원
의학과 외과학 전공
라 환 도
라환도의 의학박사 학위논문을 인준함
2013 년 12월
위 원 장 (인)
부위원장 (인)
위 원 (인)
위 원 (인)
위 원 (인)
i
The causal role of transglutaminase 2 in a mouse model of
postoperative intraabdominal adhesion
by
Hwando Ra, M.D.
A thesis submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of
Doctor of Philosophy in Surgery at the Seoul National University
College of Medicine
December 2013
Doctoral Committee:
Professor Chairman
Professor Vice Chairman Professor
Professor
Professor
ii
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논문제목: 생쥐의 수술 후 복강내 유착형성에서 Transglutaminase 2 의 역할
학위구분 : 박 사 학 과 : 의학과 학 번 : 2007 - 30495
연 락 처 :
저 작 자 : 라 환 도 (인)
제 출 일 : 2014 년 1 월 23 일 서울대학교총장 귀하
iii
국문 초록
복부 및 골반 내 장기의 수술 뒤에 생기는 유착은 정상적 창상 치유과정의 결과로 발생하나 그 정도가 심한 경우 여러 가지 합병증, 즉 소장폐색, 여성 불임, 만성 골반통 및 복통 등의 원인이 될 수 있다. Transglutaminase 2(TG2)는 단백질간의 교차결합에 관여하는 효소로 생체 내에서 지혈과정, 창상치유 과정, 세포 외 기질의 생성 및 리모델링, 세포 신호전달체계, 세포자멸사 등에서 중요한 기능을 담당한다. 특히 창상치유과정에서 섬유화 및 염증반응에 TG2 가 중요한 역할을 하나, 이 과정에서 TG2 의 정확한 작용기전은 밝혀지지 않았다. 본 연구의 목적은 복막유착을 재현할 수 있는, 정량적인 마우스 동물 실험모델을 만들고, 복강 내 수술 후 발생하는 유착과정에서 TG2 의 효과를 규명하는데 있다.
Wild type(WT)과 TG knockout(KO)마우스를 대상으로 개복하여 좌측복막을 5x5 mm 크기로 제거한 후 맹장을 수술칼등으로 30 회 긁어 열상을 유발한 후 복막제거창과 맹장열상부위를 봉합하여 유착을 유발시켰다. 마우스의 우측 복막을 같은 크기로 제거한 후 복막제거창에 5x5x0.2 mm 의 실리콘패치를 봉합하였다. 수술 후 35 일째 손상된 부위의 상처회복과 유착정도를 알아보기 위하여 검체를 획득하였다. 유착을 분석하기 위해 맹장열상 군은 유착 개수, 유착 강도 비교, 유착된 조직 양, 콜라겐 분석을 하였고, 실리콘패치군은 유착강도와 유착면적 비교, 콜라겐 양의 비교 및 혈관신생 정도를 비교하였다. 맹장열상 군에서 손상된 부위와 다른 정상부위 사이의 유착개수와 유착강도가 통계학적으로 유의하게
iv
낮았다. 실리콘패치군에서 KO 군의 복벽과 실리콘패치사이의 유착강도가 유의하게 낮았다. 맹장열상 군과 실리콘패치군에서 모두
콜라겐 분석에서는 차이가 없었으며, 실리콘패치군에서
혈관신생분석에서도 차이가 없었다. 결론적으로 본 동물실험 모델은 유착비교분석에 이용할 수 있고, TG2 가 수술 후 복강 내 유착형성 과정에 관여하는 것을 확인하였으며. 그 기전에 대한 추가적인 연구는 계속 필요할 것으로 사료된다.
______________________________________________________
주요어: 복강내 유착, transglutaminase 2, 마우스 동물 실험모델, 맹장열상, 실리콘패치.
학 번 : 2007 - 30495
v
목 차
초록... iii
목차... v
List of figures ... vi
서론...1
연구대상 및 방법 ...5
결과...20
고찰...29
참고문헌 ...34
Abstract ...44
vi
List of Figures
Figure 1. . Peritoneal defect in a cecal abrasion model ---- 5
Figure 2. Appearances of cecal abrasion model --- 6
Figure 3. Appearances of Silicone patch model--- 8
Figure 4. Appearance of postoperative adhesion--- 11
Figure 5. Analysis of adhesion tissue amount ---12
Figure 6. Collagen staining of the adhesion tissue ---13
Figure 7. Collagen staining of the adhesion tissue in Patch model --- 15
Figure 8. Image of neovascularization analysis ---17
Figure 9. Analysis of adhesion in cecal abrasion model ---20
Figure 10. Analysis of category II adhesion ---21
Figure 11. Analysis of patch adhesion model---24
Figure 12. Collagen volume assays --- 25
Figure 13. Analysis of neovascularization in silicone patch model --- 26
1
서 론
복강 내 유착은 복부수술 후 발생하는 흔한 합병증으로 복부수술 후 67-93%에서 발생한다.1 수술 후 복막의 유착과정은 복막의 손상 후 창상치유의 병적인 반응으로 고려되고 있다. 복막에 외상이나 상처를 입은 후 손상된 부위를 공급하는 혈관의 투과성이 증가되어 염증세포의 삼출물이 증가하며 2-3 이어서 혈액응고 시스템이 활성화되어 트롬빈이 형성되고 이 트롬빈이 피브리노겐을 피브린으로 변환시킨다. 피브린은 대식세포, 거대세포와 섬유모세포가 포함되는 조직에 의해서 점차 기질화되며 이 피브린 기질은 손상된 복막표면에 피브린 띠를 형성한다. 반면에 섬유용해 시스템이 정상적으로 활성화되면 플라스미노겐에서 변환된 플라스민이 피브린을 피브린 분해산물로 분해하여 비정상적인 피브린 침착이 발생하지 않게 한다. 이러한 피브린 침착과 분해 사이의 균형은 정상적으로 복막의 치유 또는 유착형성을 결정하는 결정적인 부분이다. 만약 피브린이 완전히 분해되면 정상적인 복막치유과정이 일어나는 반면 피브린이 불완전 분해되면 섬유모세포의 증식과 모세혈관의 성장에 대한 골격으로 작용하여 복막유착으로 진행하게 된다. 하지만 많은 임상 연구 및 실험 연구에도 불구하고 수술 후 복막의 유착에 대한 정확한 병태생리학적인 기전에 대해서는 아직까지 충분히 밝혀지지 않았다.
복부 및 골반 내 장기의 수술 후 발생한 유착은 정상적 창상 치유과정의 결과이나 그 정도가 심한 경우 여러 가지 합병증, 즉
2
소장폐색, 여성 불임, 만성 골반통 및 복통 등을 유발할 수 있다.4 재입원환자의 5.7%는 유착과 직접 연관되어 있고, 3.8%는 유착으로 인하여 추가적인 수술이 필요하다.5 수술적 조작, 수술기구의 접촉 등의 손상과 봉합사나 수술장갑의 파우더 등 이물질에 대한 반응 등으로 중피의 손상에 의해 복막 유착이 발생한다. 외국에서도 소장유착의 높은 재발률, 유착과 관련된 합병증의 높은 의료비 등으로 인해 수술 후 유착은 심각한 문제가 되고 있다.6-7 1997 년 수술 후 유착의 병리학적 기전과 예방에 대해 패널토의에서 유착형성 기전에 대한 연구의 필요성을 강조하였고,8 수년 동안 유착 방지제 개발이 진행되어 왔다.9-12 최근 수술 후 유착형성방지를 위한 3 가지 방법이 이용되고 있다.
첫째, 최소침습수술방법을 사용하여 복막외상을 줄이는 방법, 둘째, 헤파린, 조직 플라스미노젠 활성제 등의 약제를 이용하여 피브린 형성을 줄이는 방법, 셋째, 생체 분해 가능한 막을 사용하여 장기와 복막내의 내용물들의 접촉을 줄이는 방법 등이 있다.13-15 현재 널리 상용적으로 사용되는 유착방지제는 Sepranfilm®(Genzyme Co., Cambridge, MA, USA), Interceed® (Ethicon, Somerville, NJ, USA)과 Adept®(Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA)가 있다.
하지만 한가지 방법으로 완전히 안전하게 복강 내 유착을 줄이는 방법은 없으며,14-15 따라서 유착방지 약제의 안정성과 효과를 비교하는 많은 연구들이 있어왔다.16-17 비록 여러 가지 약제와 방어막이 유착을 예방할 것이라고 발표되지만 완벽한 억제 효과를 보이는 것은 없다.16-18
3
Transglutaminase 2(TG2)는 Rglutaminylpeptide, amine
γglutamyl transferase 반응을 통하여 단백질의 후전사 변환을 촉매하며, 이 반응을 통해 단백질다중결합사슬 사이에 γ
glutamylεlysine isopeptide 결합을 형성한다. TG2 의 이 반응은 결론적으로 단백질의 교차결합을 하게 한다.19-20 TG2 의 교차결합은 세포외기질의 분해에 저항을 증가시켜서 병리학적 상태의 임상양상에 영향을 끼쳐 복강 질환, 퇴행성 신경 질환, 조직섬유화 질환, 동맥경화증과 폐, 간 및 신장 섬유화증을 포함한 질환의 섬유화 과정에 관여한다.21-22 보고에 의하면 심실기능이 떨어진 미만성 심장 간질성 섬유증에서 TG2 가 심장에서 과발현되었으며,23 신장질환연구 중 부분 신장 적출 수술과 단측성 요관폐쇄모델에서 TG2 의 발현이 증가 되었다.24-25 세포 외에서 TG2 는 세포의 유착을 조장하고 상처치유와 혈관신생에 직접적으로 작용한다.26 또한 TG2 는 다양한 조직에서 세포 외 기질을 안정화시키고 세포 외 기질을 분해하는데 저항하는 작용을 한다. 27 세포 외 TG2 는 피브로넥틴, 피브리노젠/피브린, 폰 빌레브란트인자, 비트로넥틴, 지단백질 a, 더마탄 설페이트, 프로테오글라이칸, 콜라겐 V, 스테오넥틴, 라미닌, 니도젠과 오스테오폰틴을 비가역적으로 교차결합 하는 기능이 있으며 단백분해효소의 침착과 분해능력에 대해 저항하여 세포 외 기질을 증가시킨다.27-28 특히 창상치유과정 중 섬유화 및 염증반응에서 TG2 가 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 하지만 이 과정에서 이 효소의 정확한 작용기전이 밝혀지지는 않았다.
4
복강 내 유착을 방지하고 원인을 제거하기 위한 많은 실험이 있었으나 성공하지 못한 이유는 동물실험 모델이 정립되어 있지 않고, 유착을 일으키는 방법의 다양성, 그리고 객관적인 평가기준이 없는 것으로 기인되고 있다.13,29
이에 본 연구는 복막유착을 재현할 수 있는 정량적인 동물실험모델을 만들고 복강 내 수술 후 발생하는 유착과정에서 TG2 의 역할과 그 효과를 규명하고자 하였다.
5
연구 대상 및 방법
1. 동물수술 및 동물관리
TG2 WT 모델로 30 g 내외의 12~16 주령의 수컷 C57BL/6 (OrientBio Inc., Seongnam, Korea)마우스를 이용하였고, TG2 KO 마우스는 서울대학교 의과대학 생화학교실로부터 제공받았다.
KO 마우스는 B6 마우스(Jackson Laboratory, Sacramento, CA, USA)를 12 세대동안 역교잡하여 획득했다. 마우스는 두 군 각각 20 마리씩 실험대상으로 삼았다. 본 실험은 서울대학교병원 동물실험윤리위원회 (SNUH-IACUC 11-0113)의 심의를 거쳤으며 실험동물의 관리와 사용에 관한 지침을 준수하였다.
마취제로 zoletil (10mg/kg, Virbac Korea, Inc., Seoul, Korea)와 rompun (10mg/kg, Bayer Korea Inc., Seoul, Korea) 을 혼합한 용액을 마우스의 복강 내로 주사하여 마취한 후 해부 실험대에 고정한 다음 꼬리를 실험자 쪽으로 향하도록 위치하였다. 멸균소독 하에서 복부에 2cm 의 정중앙절개를 가하여 복막을 노출시켰다.
1.1. 맹장열상 모델
복막의 제거와 맹장열상은 다른 연구에서 사용한 방법들을 취합하여 시행하였다. 22,29-30 간단히 설명하면, 중앙부위에서 좌측 10 mm 지점에서 5 x 5 mm 크기로 복벽측 복막을 제거하여 복벽근육을 노출시켰다. (Figure 1) 맹장을 회맹판막(IC valve)상방 1 cm 까지 수술칼등(back of scalpel)으로 30 회 긁어 열상을
6
유발하였다. 긁기 전에 생리식염수를 맹장벽에 주사하여 과도한 열상으로 인한 맹장천공을 예방하였다. 열상 유발은 맹장의 전체둘레에 시행되었다. 복막제거창과 맹장열상 부위를 7-0 prolene 으로 봉합하여 고정시켰다. 봉합은 두 군데 시행하였으며 맹장의 장간막 쪽에 가장 근접한 장간막과 복막제거창의 바로 옆 정상 복막에 위치시키고 간격을 0.5 cm 으로 하였다. 매듭은 3 회로 하였다. (Figure 2) 이렇게 봉합하여 맹장의 외측 벽과 복막제거 창이 붙도록 하였다. 이때 맹장이 원래 장의 방향과 꺾이지 않도록 해서 장폐쇄로 인한 마우스의 사망을 최대한 예방하였다.
1.2. Silicone patch 군
마우스의 우측 복부에 복부 절개의 중간지점, 상복부 혈관의 외측으로 10 mm 떨어진 곳에 5 x 5 mm 크기로 복벽측 복막을 제거하여 복벽근육을 노출시켰다. 5x5x0.2 mm 의 실리콘패치 (Silastic®, Dow Corning Inc., Midland, MI, USA)를 제거된 복막의 위치에 7-0 prolene 봉합사 2 개로 고정시켰다. 매듭은 3 회 만들고 매듭 위에 남은 봉합사의 길이는 1 mm 미만으로 하였다.
두 봉합지점은 마우스의 머리 쪽-내측의 패치귀퉁이와 정상 복막을 고정시켰고, 대각선으로 마우스의 꼬리 쪽-외측의 패치귀퉁이와 정상 복막을 고정시켰다. (Figure 3)
7
Figure 1. Peritoneal defect in a cecal abrasion model
A 5 x 5 mm segment of the parietal peritoneum directly anterior to the cecum was excised sharply from the abdominal wall at 10 mm lateral to the midline incision
8
(A)
(B) Figure 2. Appearances of cecal abrasion model.
A: The cecum was injured by scratching with back of a scalpel for 30 times. The peritoneal defect and the abrased cecum were sutured with 7-0 prolene to induce adhesion.
B: Gross appearance after fixation
9
Figure 3. Appearance of silicone patch model
The peritoneum on the right side was also excised by 5x5 mm size and the 5x5x0.2 mm silicone patch (Silastic®, Dow Corning Inc., Midland, MI, USA) was sutured with 7-0 prolene.
10 1.3. 조직 채취
손상된 부위의 상처회복과 유착을 조사하기 위해 예비실험을 실시하여 수술 후 10 일과 35 일에 재개복을 하였다. 10 일 군에서 맹장열상 부위의 천공 등 합병증 없이 유착이 발생되는 것을 확인하였고, 35 일 군에서 유착 정도가 더 많고 강한 양상을 보였다.
따라서 유착 형성의 정도를 분석하기 위하여 조직 채취는 수술 후 35 일에 시행하였다. 마우스는 WT 군에서 9 마리, KO 군에서 8 마리를 유착 정도의 평가에 사용하였고, WT 군과 KO 군에서 각각 7 마리와 6 마리를 Mason’s trichrome 염색과 Sirius red 염색으로 콜라겐 분석 및 혈관신생 분석에 사용하였다.
2. 유착 형성의 분석(Assessment of adhesion formation) 유착 형성을 분석하기 위해 맹장열상 군에서는 유착 개수, 유착 강도 비교, 유착 양, 콜라겐 분석을 하였고, 실리콘패치군에서는 유착 강도와 유착 면적 비교, 콜라겐 분석 및 혈관신생 정도를 비교하였다.
2.1. 맹장열상군
2.1.1. 유착 개수(adhesion number)
유착의 양상에 따라 3 가지 형태로 분류하였다. 즉 손상된 복벽과 맹장열상 부위가 서로 유착된 경우는 1 형, 손상된 복벽이나 맹장열상 부위와 다른 정상부위 사이에 유착된 것은 2 형, 그리고 손상부위가 아닌 부위끼리 유착된 경우는 3 형으로 정의하였다. 각
11
형태별로 유착된 개수를 세었다. 2 형의 경우 손상부위에 유착된 다른 장기가 있을 때 각각의 장기의 개수를 세었고, 3 형의 경우 유착된 두 장기를 1 개로 개수를 세었다. 예를 들어 방광에 대망도 유착되었고 소장도 유착되었을 때는 2 개로 개수를 세었다.
2.1.2. 유착 강도 (adhesion tenacity)
각각의 유착의 강도를 총 3 점으로 점수화하여 측정하였다. 즉 유착을 박리할 때 당겨서 박리가 된 경우는 1 점, 수술겸자로 박리가 되는 경우(blunt dissection)는 2 점, 메스나 가위 등 날카로운 도구로 박리가 되는 경우(sharp dissection)는 3 점으로 하였다. (Figure 4)
2.1.3. 유착 양 (adhesion tissue volume)
손상된 복벽과 맹장열상 부위의 유착인 1 형 유착에 대해 장관의 장축에 수직으로 2 개의 봉합부위를 기준으로 하여 5 개를 균등하게 나누어 H&E 염색을 시행한 후 각 단면에서 장의 평활근과 복벽 근육 사이에 있는 모든 조직의 면적을 image analyzer(Image J, NIH)를 이용하여 면적을 구하여 합산하여 유착 양을 구하였다.
(Figure 5)
2.1.4. 콜라겐 양(Collagen volume)
유착면적을 구할 때와 같이 얻은 슬라이드에 Mason’s trichrome 염색을 하여 청색으로 염색되는 콜라겐을 image
12
analyzer(Image J, NIH)로 변환하여 붉게 변환된 면적을 측정하여 유착 양을 구하였다. (Figure 6)
13
Figure 4. Appearance of postoperative adhesion
At 35 days after surgery, a tight adhesion was formed between the abraded cecum and the abdominal wall defect site.
14
(A)
(B)
(C)
Figure 5. Analysis of adhesion tissue volume
(A) Adhesion areas were divided into 5 parts along the red transverse lines.
(B) Schematic cross sectional image of adhesion area
(C) Representative example of image analysis showing adhesive tissue between smooth muscle of cecum and muscle of abdominal wall.
15
(A)
(B) Figure 6. Collagen staining of the adhesion tissue
(A) Collagen was stained in blue with Mason’s trichrome stain.
(x 400) (B) Collagen was converted to red color by the Image J program. (x400)
16 2.2. Silicone patch 군
2.2.1. 유착강도 (adhesion tenacity)
패치 위에 형성된 유착조직의 강도를 맹장열상군과 같은 방법으로 총 3 점으로 점수화하여 측정하였다. 즉 유착을 박리할 때 당겨서 박리가 된 경우는 1 점, 수술겸자를 이용하여 조직이 찢어지지 않고 서로 박리가 되는 경우(blunt dissection)는 2 점, 메스나 가위 등 날카로운 도구로 절단을 해야 박리가 되는 경우(sharp dissection)는 3 점으로 나누었으며, 패치의 복강 쪽 유착과 복벽쪽 유착을 각각 계산하였다.
2.2.2. 유착면적 (adhesion area)
패치 위에 형성된 유착조직이 덮고 있는 면적을 전체 패치면적에 대하여 분율을 구하였다. 이전의 보고에서처럼 5 개의 단계로 분류하였다.8-9 유착이 없는 경우는 0 점, 유착면적이 25% 미만이면 1 점, 25~50%는 2 점, 50-75%는 3 점, 그리고 유착면적이 75%
이상이면 4 점으로 하였다. 패치의 복강 쪽 유착과 복벽쪽 유착을 각각 계산하였다.
2.2.3. 콜라겐 양 (Collagen volume)
패치를 포함하여 유착조직과 복벽을 en-bloc 으로 절제하여 파라핀블록을 제작한 후 정 중앙에서 1 개, 중앙에서 좌/우 1mm 평행하게 떨어진 곳에서 각각 1 개씩 검체를 얻어 Sirius red
17
염색을 한 후 200 배율에서 8 개의 구획의 사진을 찍어 image analyzer(Image J, NIH)로 콜라겐이 염색된 구역의 분율을 구하였다. (Figure 7) 8 개의 구획은 각각 복강방향에 3 개, 복벽방향에 3 개, 양측 귀퉁이에서 1 곳씩 촬영하였으며, 복강방향과 복벽방향에서 촬영한 구획은 가장 두꺼운 곳을 촬영하고, 겹치지 않게 하여 좌/우에 1 곳씩 촬영하였다.
2.2.4. 혈관신생 정도 (amount of neovascularization)
패치가 덮고 있는 중피조직과 유착부위 중 주변
중피조직으로부터의 신생혈관이 자라 들어온 정도를 측정하였다. 즉 조직을 분리하기 전에 15 배 확대 해부현미경 사진을 찍고 이 사진의 영상을 가로, 세로 각각 10 개로 쪼개는 격자를 겹쳐서 Figure 8 과 같은 사진을 만든 다음 신생혈관이 있는 격자의 수를 합산하여 혈관신생 정도를 수치화하였다.
3. 통계 분석
결과치는 평균, 표준편차로 표기하고 Mann-Whitney U test 를 사용하였다. 통계적 계산은 SPSS for Windows version 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 사용하였으며, p 값이 0.05 이하인 경우 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 하였다.
18
(A)
(B)
Figure 7. Collagen staining of the adhesion tissue in Patch model
(A) Collagen was stained with Sirius red stain. (x 200)
(B) Collagen was converted to red color by the Image J program. (x 200)
19
(A)
(B) Figure 8. Image of neovascularization analysis
(A) Photograph containing neovascularization of mesoepithelial tissue covered by patch
(B) Patch areas were divided by 10 x 10 lattice on microscopic photo. The number of grid with revascularization was summed.
20
결 과
1. 맹장열상모델 1.1. 유착 개수
평균 유착 개수는 WT 군에서 2. 67 ± 0.471 개, KO 군에서 1.43
± 0.369 개로, 두 군간에 통계학적 유의한 차이는 보이지 않았다.
(p=0.091)(Figure 9A)
손상된 부위와 다른 정상부위 사이에 유착된 2 형의 유착 개수는 WT 군에서 평균 1.44 ± 0.294 개 이었고, KO 군에서 0.43 ± 0.297 개로 WT 군에 비하여 KO 군에서 유의하게 적었다.
(P=0.042) (Figure 10)
1.2. 유착 강도
유착 강도는 WT 군에서 6.0 ± 0.707 점이였고, KO 군에서 3.71
± 0.808 점으로 두 군간에 통계학적 유의한 차이는 보이지 않았다.
(p=0.071)(Figure 9B)
손상된 부위와 다른 정상부위 사이에 유착된 2 형의 유착 강도는 WT 군에서는 2.67 ± 0.333 점이었으나 KO 군은 0.86 ± 0.553 점으로 WT 군에 비하여 KO 군에서 유착 강도의 차이가 유의하게 적었다. (p=0.042)(Figure 10)
1.3. 유착 양
1 형 유착에 대해 장의 평활근과 복벽 근육 사이에 있는 모든 조직의 양은 WT 군에서 27.83 ± 6.70 mm3 이었고, KO 군은
21
10.10 ± 3.44 mm3 으로 WT 군에 비하여 KO 군에서 유의하게 적었다. (p=0.032)(Figure 9C)
22
Figure 9. Analysis of adhesion in cecal abrasion model
TG2 knockout (KO) mice showed a tendency of less adhesion number and tenacity. KO mice showed significantly less adhesion volume compared with wild type (WT) mice.
Adhesion Tenacity
CecalAbrasion Model
p=0.071 6.00±0.707
3.71±0.808
Adhesion Number
CecalAbrasion Model
p=0.091 2.67±0.471
1.43±0.369
Adhesion Volume
CecalAbrasion Model
p=0.032 27.83±6.70
10.10±3.44
23 CategoryⅡAdhesion Tenacity
Cecal Abrasion Model
p=0.042 2.67±0.333
0.86±0.553
CategoryⅡAdhesion Number
Cecal Abrasion Model
p=0.042 1.44±0.294
0.43±0.297
Figure 10. Analysis of category II adhesion
Adhesion between abraded areas and other normal part was considered as category II. The adhesion number and adhesion tenacity was significantly lower in KO mice than WT mice.
24 2. Silicone patch 모델
2.1. 복강 쪽 유착 분석
실리콘 패치와 복강 쪽 유착을 유착개수와 유착 강도로 분석한 결과, 유착 개수는 WT 군이 0.78 ± 0.47 개이고 KO 군이 0.14
± 0.14 개로 유의한 차이가 없었고(p=0.47), 유착 강도는 WT 군이 1.0 ± 0.50 점이고 KO 군이 0.43 ± 0.43 점으로 역시 유의한 차이가 없었으며(p=0.54), 유착 개수와 유착 강도를 합산한 총 유착 점수도 WT 군이 1.78±0.92 점이고, KO 군이 0.57±0.57 점으로 유의한 차이는 없었다. (p=0.47)
2.2. 복벽 쪽 유착 분석
실리콘 패치와 복벽 사이의 유착면적을 분석한 결과, WT 군은 2.22
± 0.40 점이고 KO 군은 1.14 ± 0.55 점으로 유의한 차이는 없었고(p=0.114), 반면에 유착강도는 WT 군에서 2.56 ± 0.338 점이었으나, KO 군에서는 1.0 ± 0.378 점으로 WT 군에 비하여 KO 군에서 유의하게 더 낮았다. (p=0.008)(Figure 11) 둘을 합산한 총 유착점수도 WT 군에서 4.78 ± 0.64 점이었으나, KO 군에서는 2.14 ± 0.80 점으로 WT 군에 비하여 KO 군에서 유의하게 더 낮았다. (p=0.012)
3. 콜라겐 분석
25
맹장열상모델에서 유착된 조직에서 콜라겐 양의 분율은 WT 군에서 31.84 ± 4.51%이고 KO 군에서 33.72 ± 4.22%으로 유의한 차이는 없었다. (p=0.69)(Figure 12A)
실리콘패치모델에서 유착조직에서 콜라겐 양의 분율은 KO 군에서 4.24 ± 3.36%, WT 군에서 3.88 ± 2.86%으로 유의한 차이는 없었다. (p=0.481)(Figure 12B)
4. 혈관신생 분석 (Neovascularization)
실리콘패치모델에서 혈관신생의 양은 WT 군은 14.38 ± 3.00 개이고 KO 군에서는 17.0 ± 2.66 개로 유의한 차이는 없었다.
(p=0.662) (Figure 13)
26
Figure 11. Adhesion in patch adhesion model
Adhesion tenacity between silicone patch and abdominal wall was significantly lower in KO mice.
Adhesion tenacity-Abd. wall
Patch Adhesion Model
p=0.008 2.56±0.338
1.00±0.378
27
(A)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Area fraction in patch adhesion
Patch Adhesion Model
Collagen Assay
3.88±2.86 4.24±3.36
P=0.481 Wild type TG knockout
(B)
Figure 12. Collagen volume assays.
In both models of cecal abrasion and silicone patch(A,B), collagen volume in the adhesion tissue showed no difference between KO mice and WT mice.
Collagen Assay
Cecal Abrasion Model
p=0.690
31.84±4.51 33.72±4.22
28
Figure 13. Analysis of neovascularization in silicone patch model The degree of neovascularization showed no difference between KO mice and WT mice.
Neovascularization
Patch Adhesion Model
14.38±3.00
p=0.662 14.38±3.00
17.00±2.66
29
고 찰
복막 손상 후 복강 내 유착 형성은 복막치유과정의 병적인 과정이라고 고려되고 있다. 피브린의 침착과 분해 사이의 균형이 정상적인 복막의 치유 또는 유착 형성의 결정에 중요한 부분이다.
만약 피브린이 완전히 분해되면 정상 복막 치유과정이 일어나지만 불완전하게 분해되면 섬유모세포의 증식과 모세혈관의 성장을 촉진시켜 복막 유착으로 진행하게 된다. 복막 손상은 피브린이 풍부한 삼출물의 양을 증가시키고, 피브린 기질 형성을 일으키는 염증반응을 일으킨다. 피브린은 혈액응고시스템 활성화의 결과로 만들어지며 이러한 피브린 형태의 침전물은 섬유화 조직의 성장을 위한 기질이 된다. 실제로 섬유모세포는 피브린 기질에 침투하여 세포외기질을 만든다. 일반적으로 복막 손상이 일어난 지 5-7 일 이내에 섬유소융해가 일어나지 않으면 일시적인 피브린 기질은 영구화가 되고 점차적으로 콜라겐을 분비하는 섬유모세포와 함께 기질화되어 간다. 이러한 과정이 복막유착을 형성하게 하고 혈관신생인자의 매개에 의해 새로운 혈관을 신생시킨다.2,31-32 복막 유착은 개복수술 후 소장폐쇄로 재입원, 재수술을 초래하고, 만성적인 복통, 골반통 및 불임을 유발시킬 수 있다. 재수술 시에 수술시간도 길어지고, 복강의 노출도 제한되며 예기치 않은 장루형성에 대한 위험도도 올라간다.33-34 이로 인한 경제적인 손실을 최소화하고자 1997 년 수술 후 유착의 병리학적 기전과 예방에 대해 패널토의에서 유착에 대한 연구와 특히 유착형성의
30
기전에 대한 연구의 필요성을 강조하였고,8 수년 동안 유착을 방지하는 재료들의 개발이 진행되어 왔다.9,-12 현재 사용되고 있는 유착방지제의 효과는 입증되어있으나 아직까지 완벽한 방지효과를 얻을 수는 없으며 따라서 또 다른 다양한 유착촉진기전이 신체내에서 작용하고 있다고 생각할 수 있다.
TG2 는 세포 내의 다양한 위치에 존재하는 여러 생화학적인 기능을 가진 효소로서 세포 외에서는 R-glutaminyl-peptide, amine-γ-glutamyl transferase 반응을 통하여 단백질의 후전사 변환을 촉매한다. 이 반응을 통해 세포외기질의 콜라겐, 파이브로넥틴, 라미닌, 니도젠과 프로테오글라이칸을 포함하는 세포외기질 단백질을 단백질 다중결합사슬 사이에 γ-glutamyl- ε-lysine isopeptide 결합을 이룬다. TG2 의 이 반응은 결론적으로 단백질의 교차결합을 하게 하여 19-20 세포외기질의 안정화에 기여하고, 단백분해효소에 의해 세포외기질이 분해되는 것에 저항하게 해주는 역할을 한다. 20,27-28, 35-38 게다가 TG2 는 상처치유와 혈관신생에 직접적으로 작용을 한다. 26 이 효소는 복강의 질환, 퇴행성 신경질환 과 조직섬유화질환에 중요한 역할을 한다. 여러 가지 기전으로 동맥경화증, 폐, 간 및 신장 섬유화증을 포함한 질환의 섬유화 과정에도 관여한다.21-22 TG2 는 혈관내피세포에 풍부하게 있고 와류가 있는 곳에 노출된 내피세포에서 발현이 증가되며,39 대식세포의 유착,40 대식세포의
운동성,41-42 대식세포의 대식작용 39 에 영향을 주는 등 혈관
31
리모델링, 칼슘침착, 세포 유착 과 내피세포 방어기능에 중요한 역할을 한다.44-45
본 연구는 복막유착을 재연할 수 있고 유착정도를 정량적으로 측정할 수 있는 동물실험모델을 만들고, 복강 내 수술 후 발생하는 유착과정에서 TG2 의 역할을 규명하고자 하였다. 복막에 손상을 가한 후 복막의 유착에 대해 TG2 WT 군과 KO 군 사이에 유착의 정도를 비교하였다. 실제로 유착의 여부를 객관적으로 수치화 하기가 쉽지 않다. 본 실험에서는 맹장열상모델과 실리콘패치모델의 두 가지 손상 모델을 만들어 다양한 유착을 유도하였으며, 두 모델 모두에서 예상대로 유착이 잘 발생되었고, 유착 개수, 강도, 양, 그리고 콜라겐 분석과 혈관신생정도를 측정하여 유착정도를 객관적으로 정량화시킬 수 있었다.
유착의 정도는 맹장열상모델에서 유착 개수, 유착 강도와 유착범위에서 KO 군에서 유착이 적게 발생하는 양상을 보였고 손상된 복벽과 열상된 맹장사이의 유착(1 형 유착)에 대해 장 평활근과 복벽 근육 사이에 있는 유착 조직의 양이 KO 군에서 유의하게 더 적었다. 임상에서 소장폐색의 직접적 원인이 되는 손상된 부위와 다른 정상부위 사이에 유착(2 형 유착)은 유착 개수와 유착 강도에서 유의하게 WT 군에 비하여 KO 군에서 적게 발생하였다. 실리콘패치유착모델에서 패치와 복벽 사이의 유착강도는 KO 군에서 유의하게 낮았다. 결과적으로 TG2 가 억제된 상태에서는 유착이 감소하였다는 것을 알 수 있었다. 즉 TG2 가 유착 형성의 한 과정에 관여한다는 것을 의미하는 것이다.
32
TG2 가 억제된 상태에서 유착감소의 영향을 규명하기 위해 유착 부위의 콜라겐 양 분석과 혈관신생 정도를 분석하였다.
복막유착의 과정은 완전히 이해되지는 않았지만 피브린 기질 안으로 섬유모세포가 침착 되어 섬유모세포의 활동으로 인해 콜라겐 합성의 양이 증가되어 유착을 일으키지만 콜라겐 간의 교차연결을 통해 섬유소융해에 저항을 하여 유착이 형성되는 것으로 설명된다. 따라서 KO 군에서 유착이 감소하는 것은 TG2 에 의해 매개되는 콜라겐 양의 감소와 혈관신생의 감소로 인해 유발되었을 것이라는 가설을 세우게 되었다. 하지만 맹장열상모델과 실리콘패치유착모델에서 콜라겐 양을 분석한 결과 두 군간의 차이가 없었고, 실리콘패치유착모델에서 혈관신생 정도 분석도 두 군간의 차이가 없었다.
본 연구의 실험은 이전 연구들을 참조하여 복막유착형성에 대한 평가를 조금 더 객관적으로 하도록 유착 개수, 유착 강도 및 유착조직양의 변수를 사용하였다. 30-32 이런 변수들은 향후 복막유착 억제 약제의 평가 및 비교를 하는데 도움이 될 것으로 생각된다.
본 연구의 한계는 여러 가지를 들 수 있다. 우선 콜라겐의 양이나 혈관신생은 두 군간에 차이가 없어 TG2 가 복막유착 형성과정 중에 어떠한 방법으로 관여하는지 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 콜라겐의 교차결합이 TG2 KO 군에서 감소하는 지 조사가 필요하겠다. 또한 피브린을 분해하는 플라스민의 발현 및 농도, 활성도가 TG2 효소에 의해 변화하는 지에 대한 연구도
33
필요하겠다. 또한 추후 TG2 억제제를 복강 내 투여한 뒤 유착 발생이 억제되는지에 대한 추가 실험이 필요하겠다. 본 실험은 수술 후 35 일 후에 조직을 채취하여 수술 후 초기에 발생하는 유착 형성 과정에 대해 살펴보지 못하였다. 추후 억제제 투여시 적절한 투여시점과 기간에 대한 연구가 있어야 할 것이다.
결론적으로 본 연구모델은 수술 후 유착의 개수, 강도, 면적 및 양 등이 감소하여 유착발생을 비교할 때 사용할 수 있는, 재현할 수 있고 정량적인 동물실험모델이라 할 수 있겠다. 또한 TG2 는 수술 후 복강 내 유착 발생에 관여하였고, 이러한 TG2 관련 기전을 향후 복강 내 유착을 방지하는 치료제 개발의 표적으로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
34
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43
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44
Abstract
The causal role of transglutaminase 2 in a mouse model of
postoperative intraabdominal adhesion
Ra, Hwando Department of Surgery The Graduate School Seoul National University
Postoperative adhesions after pelvic or abdominal operations are normal recovery process. However, adhesions often cause mild to severe complications such as bowel obstruction, infertility and pelvic pain. Tissue transglutaminase(TG2) is the enzyme involves in cross-linking of the protein and has important role in wound healing, formation and remodeling of
45
extracellular matrix, cell signaling and apoptosis. TG2 is supposed to have special role in fibrosis and inflammation during wound healing process. However, the mechanism in this process is not yet proved.
The purpose of this study was to create a standardized animal model in which a reproducible, quantitative model of postoperative peritoneal adhesion was developed, and to investigate the role of TG2 in postoperative peritoneal adhesion and the mechanism of the effect. Wild type and TG knockout mice were used and compared. After opening abdominal wall, the peritoneum was resected in the size of 5x5mm at left side.
Then, the cecum was injured by scratching with a scalpel and the peritoneal defect site and the injured cecum were suture together to induce adhesion. The right sided peritoneum was also resected by 5x5mm and the 5x5x0.2mm silicone patch (Silastic®, Dow Corning, Midland, MI, USA) was sutured. After 35 days, the number, tenacity, tissue volume of the adhesion and collagen were analyzed in cecal abrasion group (group A).
In silicone patch group (group B), surface and tenacity of adhesion, collagen and angiogenesis was analyzed. In group A, less adhesion was developed in TG2 knockout mouse in the aspect of number and the tenacity of the adhesion. Also adhesion volume was significantly smaller in TG2 knockout
46
mouse. In group B, the adhesion tenacity between abdominal wall and patch was significantly less developed in TG2 knockout mice. There were no difference in collagen volume and area of angiogenesis in both groups.
In conclusion, this mouse model can be considered reproducible and quantitative animal model of postoperative intraabdominal adhesion. The postoperative intraabdominal adhesion was less developed in TG2 knockout mice, which suggests important role of TG2 in the process of adhesion. But there were no difference in collagen analysis and angiogenesis.
Further research is needed to find out the mechanism of TG2 role in the adhesion process.
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Keywords: intraabdominal adhesion, transglutaminase 2, mouse model, cecal abrasion, silicone patch, Student Number: 2007 – 30495
