Роль полиморфизма гена глюкокортикоидного рецептора в предрасположенности к бронхиальной астме

А.А. Сейтак, А.Ю. Акпарова, Р.И. Берсимбай

Роль полиморфизма гена глюкокортикоидного рецептора в предрасположенности к бронхиальной астме

(Евразийский национальный университет им. Л.Н.Гумилева, г. Астана, Казахстан )

В кратком обзоре представлены современные научные знания о механизмах действия глюкокортикоидов, структуре и функционировании глюкокортикоидного рецептора, роли полиморфизма гена глюкокортикодного рецептора в формировании предрасположенности к бронхиальной астме и другим заболеваниям.

Бронхиальная астма (БА) относится к группе мультифакториальных заболеваний и имеет полигенную природу. В ее патогенез вовлечено много разных функционально взаимосвязанных генов ("генные сети"), включающих, наряду с главными структурными генами, ответственными за начало заболевания, другие, второстепенные гены, так называемые гены-модификаторы, эффект которых во многом определяется воздействием на организм факторов внешней среды [1].

Факторами, влияющими на развитие бронхиальной астмы, являются генетическая предрасположенность и окружающая среда. Генетическая основа наследуется и ассоциируется с повышенной секрецией иммуноглобулина Е (атопия), гиперреактивностью бронхов и выбросом медиаторов воспаления. Геномные исследования идентифицировали около 100 генов, экспрессируемых в разных соотношениях у больных астмой и здоровых людей. На экспрессию этих генов влияют факторы внешней среды.

Глюкокортикоиды являются самыми мощным противовоспалительными препаратами, используемыми в лечении астмы. Ингаляционные глюкокортикоиды применяются в качестве первой линии терапии взрослых и детей с персистирующей бронхиальной астмой. Однако клинические исследования показывают, что примерно от 5% до 10% всех больных БА и до 35% людей с тяжелым течением заболевания, имеют слабый ответ на глюкокортикостероидную терапию [2]. В связи с выраженным противовоспалительным эффектом глюкокортикоидных гормонов, целесообразность их использования в качестве базисной терапии больных БА считается общепризнанной.

Рисунок 1- Структура гена и белка глюкокортикостероидного рецептора, функциональное распределение GRα и образование изоформ путем альтернативного сплайсинга

Глюкокортикоиды - стероидные гормоны, продуцируемые корой надпочечников. Они играют важную роль в поддержании гомеостаза. На клеточном уровне, глюкокортикоиды связываются с внутриклеточным глюкокортикоидным рецептором (англ. glucocorticoid re- ceptor - GR), который в дальнейшем функционирует как гормоноактивированный фактор транскрипции и регулирует экспрессию генов глюкокортикоидного ответа. Эти гены составляют около 5-20% генома человека. Ген GR расположен на длинном плече хромосомы 5 (5q31) и состоит из 9 экзонов.

GR, как показано на рисунке 1, представляет собой одиночную полипептидную цепь, состоящую из 777 аминокислотных остатков. GR имеет три функционально-структурные области: первая расположена в аминотерминальном (N-концевом) участке и охватывает первые 439 аминокислот, вторая область - ДНК связывающая - в нее вовлечено 440-495 аминокислот и третья включает гормон связывающий участок, состоящий из 496-777 аминокислот.

После альтернативного сплайсинга гена GR в экзоне 9 образуется две высоко гомологичные рецепторные изоформы, называемые α и β. Они идентичны по 727 аминокислотам и различаются по дополнительным 50 аминокислотам у GRα и 15 аминокислотам у GRβ. Молекулярный вес этих рецепторных изоформ составляет, соответственно, 97 и 94кDa.

GRα экспрессируется практически во всех органах и тканях и присутствует, в основном, в цитоплазме. Он является классическим глюкокортикоидным рецептором, который функционирует как лиганд-зависимый транскрипционный фактор. GRβ так же экспрессируется повсеместно, но не связывает глюкокортикоидных агонистов и функционирует в качестве доминирующего отрицательного ингибитора транскрипционной активности GRα [3].

N-концевая область (англ. - N-terminal domain, NTD) GRα содержит основной участок трансактивации, называемый активационной функцией (англ. - activation function, AF), которая находится между аминокислотами 77 и 262. AF-1 принадлежит к группе кислых активаторов, таких как VP16, NF-kB, p65, p53 и гепатоцитарный ядерный фактор (англ.

- hepatocyte nuclear factor, HNF), содержит четыре α-спирали и играет важную роль в связывании этой области с молекулами, необходимыми для инициации транскрипции, такими как коактиваторы, модуляторы хроматина, РНК-полимераза II, ТАТА-связывающий белок (англ. - TATA-binding protein, TBP) и множество ТВР-ассоциированных белков. AF-1 GRα находится в сравнительно развернутом состоянии, также образует спиральную структуру в ответ на связывание с кофакторами, такими как ТBP [4].

ДНК-связывающая область (англ. DNA-binding domain, DBD) GRα содержит 420-480 аминокислот и имеет два цинковых пальцевых мотива, с помощью которых происходит связывание GRα со специфическими последовательностями ДНК, глюкокортикочувствительными элементами (англ. - glucocorticoid responsive element, GREs).

ДНК-связывающая область (DBD) является наиболее консервативной областью всего семейства стероидных рецепторов. Она имеет два схожих цинковых пальцевидных модуля, каждый образуется с помощью иона Zn в виде координаторного центра, который крепится с помощью четырех остатков цистеина и последовательностей α-спирали. Первый, на N- конце α-спирали лежит в основе большой бороздки двухцепочечной ДНК, в то время как C-концевая часть каждого модуля располагается на малой бороздке. Недавние исследования показали, что GREs с разными последовательностями влияют на трехмерную структуру DBD и дифференцированно индуцируют транскрипционную активность. Это говорит о том, что ДНК является специфической последовательностью аллостерных модуляторов GR-индуцированной транскрипционной активности, что может частично объяснить ген- специфический транскрипционный эффект этого рецептора.

Лиганд-связывающая область (англ. ligand-binding domain, LBD) соответствует аминокислотам 481-777 GRα, связывается с глюкокортикоидами и играет важную роль в лиганд-индуцированной активации GRα. Кристаллическая структура GRα LBD состоит из 12 α-спиралей и 4 малых β-нитей, которые сворачиваются в три слоя спиральной

области. Спирали 1 и 3 образуют одну сторону спирального сэндвича, в то время как спирали 7 и 10 - другую сторону. Средний слой спиралей (спирали 4, 5, 8 и 9) присутствует в верхней половине белка. Такое расположение спиралей создают полость в нижней половине LBD, который окружен спиралями 3, 4, 11, 12 и функционирует как лиганд-связывающая область [5]. Взаимодействие LBD с белками теплового шока (англ. - heat shock protein, HSP) 90 способствует поддержанию структуры белка, что позволяет LBD связаться с лигандом.

Лиганд-связывание индуцирует изменения конформации в LBD и позволяет GRα связываться с несколькими молекулами, такими как импортин α ядерной системы импорта, компонентами инициации транскрипционных комплексов и другими факторами транскрипции, которые обуславливаются GRα лиганд-зависимыми действиями.

GR экспрессирует две мРНК путем альтернативного сплайсинга экзонов 9α и 9β и продуцирует два сплайс варианта. мРНК GRα способствует экспрессии множественных изоформ, используя 8 альтернативных инициаторных сайтов трансляции. GRβ является частью области общей мРНК, которая содержит общие с GRα сайты инициации трансляции, GRβ вариант мРНК возможно так же транслируется с активацией тех же сайтов инициации соответствующих β изоформам. Транслируемые GRα изоформы по-разному экспрессируются в различных клеточных линиях. Они продуцируется при рибосомном сканировании и/или рибосомном параллельном включении других альтернативных инициаторных участков трансляции, локализующихся на 27 аминокислотах (GRα-B), 86 (GRα-C1), 90 (GRα-C2), 98 (GRα-C3), 316 (GRα-D1), 331 (GRα-D2) и 336 (GRα-D3) на C-конце классической трансляции со старт сайтом (1: для GRα-A). Таким образом, они имеют различную протяженность NTDs, но одинаковые DBDs и LBDs. По сравнению с GRα -A, -C2 и -C3 изоформы имеют выраженную транскрипционную активность на искусственном GRE-регуляторном промоторе, в то время как GRα-D1, D2- и D3- показали слабую активность. GRα-B и -C1, однако, обладают транскрипционными активностями, похожими на GRα-A. Все GRα изоформы перемещаются в ядро в ответ на лиганды. В отсутствие лиганд дифференцированно распределяются в цитоплазме и/или в ядре и отображают различные трансактивационные или трансрепрессионные модели глобальной генной экспрессии, исследованные анализом кДНК микрочипов. Таким образом, N-концевые изоформы GR дифференцированно могут изменять сигналы глюкокортикоидных гормонов в тканях, в зависимости от их селективной экспрессии [6].

Вероятно, что продукция дифференцированных специфических клеток может также быть обусловлена трансляционными изоформами GRβ.

Ген GR имеет одиннадцать различных промоторов со своими альтернативными первыми экзонами (1A1, 1A2, 1A3, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1H, 1I и 1J). Таким образом, GR может продуцировать одиннадцать различных транскриптов с разными промоторами, которые кодируют одни и те же белки GR, разделенные с экзоном 2, который содержит транслируемый ATG кодон. 1A1, 1A2, 1A3 и 1I расположены в дистальной области промотора, охватывающего более 32 000-36 000 н.п. перед сайтом инициации трансляции, в то время как 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1H и 1J расположены в проксимальной области промотора на расстоянии до 5 000 н.п. от сайта начала трансляции. Таким образом, сплайсинг и трансляция изоформ GR происходит в результате активации различных промоторов и возникающие формы имеют до 256 различных комбинаций гомо- и гетеродимеров с вариабельными экспрессионными уровнями и транскрипционной активностью (рисунок 2). Перечисленные сложные механизмы транскрипции / трансляции гена GR позволяют клеткам/тканям реагировать соответственно на изменяющиеся концентрации глюкокортикоидов[7].

Рисунок 2- Схематичное изображение гена GR. (Показаны полиморфизмы (белые треугольники), с которыми связывают изменение глюкокортикоидной чувствительности и различия показателей организма, а также мутации

(черные треугольники), приводящие к синдрому глюкокортикостероидной резистентности)

Главное действие глюкокортикоидов заключается в подавлении большого количества генов - активаторов воспаления, кодирующих цитокины, хемокины, молекулы адгезии, воспалительные ферменты и рецепторы. Эти гены включают в дыхательных путях провоспалительные транскрипционные факторы, такие как ядерный фактор κB (NFκB) и белок активации 1 (AP1), которые взаимодействуют с транскрипционными коактиваторными молекулами и запускают генную транскрипцию [8].

Активированные глюкокортикоидные рецепторы, взаимодействуя с корепрессорными молекулами, ослабляют NFκB-ассоциированную коактиваторную активность, таким образом, ослабляется ацетилирование гистонов, ремоделирование хроматина и снижается активность РНК полимеразы II. Снижение ацетилирования гистонов происходит через специфическое воздействие деацетилазы гистонов (HDAC)2, активированной глюкокортикоидным рецептором, блокирующий комплекс генов воспаления, таким образом, происходит эффективная супрессия активных воспалительных генов в ядре. Этот механизм может объяснить, почему глюкокортикоиды эффективны и безопасны в контроле воспаления и не действуют на другие гены [9].

Глюкокортикоидные рецепторы ацетилируются после лиганд-связывания, это позволяет им ассоциироваться с GREs и быть представленными HDAC2, таким образом, способствуя взаимодействию с NF?B комплексом [10]. Кроме того, HDAC6 также действует на глюкокортикоидную рецепторную функцию, так как может контролировать HSP90 ацетилированный статус и ингибировать ядерную транслокацию глюкокортикоидного рецептора [11].

Исследования, проведенные в последние годы, предполагают, что определенные варианты гена глюкокортикоидного рецептора могут изменять глюкокортикоидную чувствительность и в связи с этим могут играть важную роль в развитии различных патологий. Были описаны мутации в генах GR половых и соматических клеток; некоторые из них были ассоциированы с синдромом глюкокортикоидной резистентности, в то время как другие, возможно, способствуют изменению глюкокортикоидной чувствительности в различных тканях [7]. Среди нескольких генных вариантов, Asn363Ser (АТТ-GTT) полиморфизм был изучен наиболее экстенсивно и его присутствие было зарегистрировано у 1,2-6.8% европейского населения.

Данный полиморфизм умеренно повышает транскрипционную активность рецептора и это ассоциировано с повышением чувствительности к глюкокортикостероидам, имеется небольшая корреляция с развитием ожирения и, таким образом, отрицательно влияет на метаболический профиль и долголетие. Кроме ассоциации данного полиморфизма с повышенной чувствительностью к ГК, также была обнаружена взаимосвязь с повышенным инсулиновым ответом на ГКС [12].

Как показано в недавних исследованиях, этот полиморфизм, возможно, связан с увеличением индекса массы тела, повышением уровня холестерина, заболеваниями коронарных артерий и с тенденцией к уменьшению минеральной плотности кости без изменения

гормонального уровня глюкокортикоидов у исследуемых больных.

Полиморфизм в гене GR, вызывающий замену аргинина на лизин в 23 аминокислоте (ER22/23EK: GAG AGG на GAA AAG), ассоциирован с относительной глюкокортикоидной резистентностью в связи с изменением уровня экспрессии трансляционных изоформ GRα. При изучении полиморфизма ER22/23EK у пожилых людей Дании была выявлена ассоциация с устойчивостью к ГК, повышением чувствительности к инсулину, а также со снижением общего уровня липопротеидов низкой плотности (ЛПНП). В другой популяции пожилых мужчин, носители полиморфизма ER22/23EK, как правило, имеют более низкий уровень общего холестерина и С-реактивного белка, которые, возможно, в большей степени отражают состояние сердечно-сосудистой системы. Кроме того, в этой популяции ER22/23EK вариант был связан с долголетием. Ранее, была описана взаимосвязь полиморфных TthIII I рестрикционных сайтов промоторной области GR гена с увеличением базальной кортизольной секрецией.

Показана взаимосвязь между G-аллелем Bcl I полиморфизма и гиперчувствительностью к ГК у пожилого населения Дании В большой группе пожилых лиц Дании был обнаружен низкий ИМТ (индекс массы тела) в гетерозиготном и гомозиготном аллелях G-носителей. У мужчин этой группы была обнаружена также тенденция к снижению мышечной массы при наличии G-аллеля, которая соответствовала повышенной чувствительности к ГКС и, возможно, этим можно объяснить понижение индекса массы тела в пожилом возрасте [13].

Одиночный нуклеотидный полиморфизм, заменяющий А на G в 3669 положении (A3669G), локализующийся на 3’ конце 9β экзона, был описан в европейской популяции. Этот полиморфизм не изменяет аминокислотную последовательность, но повышает стабильность мРНК GRβ и увеличивает экспрессию GRβ белка, что приводит к большей ингибиции GRα-индуцированной транскрипционной активности и вызывает глюкокортикоидную резистентность в тканях. Наличие A3669G аллеля связано с уменьшением ожирения и более благоприятным липидным профилем у исследуемых больных [14] (табл.1).

Таблица 1- Полиморфизмы гена GR

№ Полиморфизмы GR Описание

1 N363S Обнаружена выраженная корреляция

между тяжелой неконтролируемой астмой и контрольной группой по полиморфизму N363S гена GR.

2 ER22/23EK ER22/23EK вариант был связан с долголетием.

3 TthIII I Обнаружена взаимосвязь полиморфизма TthI-

II I с увеличением базальной кортизольной секрецией.

4 Bcl I Выявлена взаимосвязь между G-аллелем Bcl I

полиморфизма и гиперчувствительностью к ГК у пожилого населения.

5 A3669G Связан с уменьшением ожирения

Взаимодействие между генетическими вариантами GR и различных болезней в настоящее время активно изучается.

Полиморфизмы гена GR связывают с изменением чувствительности к ГК. N363S и ER22/23EK полиморфизмы гена глюкокортикоидного рецептора (GR) могут играть важную роль в развитии бронхиальной астмы. При изучении роли данных полиморфизмов в возникновении бронхиальной астмы у польского населения была обнаружена выраженная корреляция между умеренной и тяжелой неконтролируемой астмой и контрольной группой по полиморфизму N363S GR гена. Такой корреляции не наблюдалось со вторым проанализированным полиморфизмом - ER22/23EK [15].

Впервые были проанализированы критерии терапевтической резистентности больных БА российской популяции [16]. Охарактеризована частота полиморфных вариантов гена MDR1

(С3435Т) и гена GR (Ile559Asn, Val729Ile, Ile747Met, N363S, R23K) больных БА и контрольной группы славянской популяции (жителей Санкт-Петербурга).

Во многих случаях глюкокортикоидная резистентность при БА может быть связана с мутациями или полиморфизмами гена глюкокортикоидного рецептора (GR). Четыре из этих мутаций являются миссенс мутациями (D641V, G679S, V729I и I747M), которые приводят к снижению сродства к стероидам и нарушению способности активировать транскрипцию генов.

Полиморфизм N363S (rs6195), как предполагается, связан с повышенной чувствительностью к глюкокортикоидам.

Частота носителя гетерозиготного G200A гена GR в контрольной группе составила 2,9% и достоверно не отличалась от частот в других популяциях, приведенных в литературе. Выявлен один случай гомозиготного носительства 200АА гена GR в контрольной группе, в отличии от других источников. Несмотря на то, что частота носителя гетерозиготного G200A гена GR в группе БА достоверно ниже приведенных в литературе данных, комментировать данный результат крайне сложно ввиду наличия лишь одного наблюдения. Требуются дальнейшие исследования на большом контингенте больных.

Частота гетерозиготного носительства A1220T гена GR в контрольной группе и среди больных БА славянской популяции составили 10% и 4,95% соответственно и достоверно не отличались от приводимых в литературе. Все пациенты были женщинами среднего возраста с БА смешанного генеза, дебютировавшей во второй половине жизни [17].

Установление молекулярных механизмов глюкокортикоидной резистентности будет способствовать определению генетических маркеров прогноза формирования медикаментозной устойчивости и разработке новых терапевтических подходов в лечении бронхиальной астмы и многих других воспалительных заболеваний.

ЛИТЕРАТУРА

1. Берсимбай Р.И., Акпарова А.Ю., Ещжанов Т.Е. Бронхиальная астма. Молекулярно- генетические и иммунологические методы диагностики (Методические рекомендации) // ЕНУ им.Л.Н.Гумилева, 2012. - C.6-10

2. Ito K., Chung K.F., Adcock I.M. Update on glucocorticoid action and resistance // J. Allergy Clin. Immunol., 2006. №117. - P. 522-543.

3. Galon J., Franchimont D., Hiroi N., Frey G., Boettner A., Ehrhart-Bornstein M., O’Shea J.J., Chrousos G.P., Bornstein S.R., Gene profiling reveals unknown enhancing and suppressive actions of glucocorticoids on immune cells // FASEB J, 2002. №16(1). - P.61-71.

4. Almlof T., Gustafsson J.A., Wright A.P. Role of hydrophobic amino acid clusters in the transactivation activity of the human glucocorticoid receptor // Mol. Cell Biol., 1997. №17(2). - P.

934-945.

5. Meijsing S.H., Pufall M.A., So A.Y., Bates D.L., Chen L., Yamamoto K.R. DNA binding site sequence directs glucocorticoid receptor structure and activity // Science, 2009. №324(5925). - P.

407-410.

6. Lu N.Z., Cidlowski J.A. Translational regulatory mechanisms generate N-terminal glucocor- ticoid receptor isoforms with unique transcriptional target genes // Mol. Cell, 2005. №18(3). - P.

331-342.

7. Turner J.D., Muller C.P. Structure of the glucocorticoid receptor (NR3C1) gene 5’ untranslated region: identification, and tissue distribution of multiple new human exon 1 // J. Mol. Endocrinol., 2005. №35(2). - P. 283-292.

8. Ito K., Yamamura S., Essilfi e-Quaye S., et al. Histone deacetylase 2-mediated deacetylation of the glucocorticoid receptor enables NF-κB suppression // J. Exp. Med., 2006. №203.- P.7-13.

9. Barnes P.J., Adcock I.M., Ito K. Histone acetylation and deacetylation: importance in infl ammatory lung diseases // J.Eur. Respir., 2005. №25.- P.552-63.

10. Bergmann M.W., Staples K.J., Smith S.J., Barnes P.J., Newton R. Glucocorticoid inhibition of GM-CSF from T cells is independent of control by NF-?B and CLE0 // Am J. Respir Cell Mol.

Biol., 2004. №30.- P. 555-63.

11. Kovacs J.J., Murphy P.J., Gaillard S. HDAC6 regulates HSP90 acetylation and chaperone- dependent activation of glucocorticoid receptor // Mol. Cell, 2005. №18.- P. 601-07.

12. van Rossum E.F., Koper J.W., Huizenga N.A., Uitterlinden A.G., Janssen J.A., Brinkmann A.O., Grobbee D.E., de Jong F.H., van Duyn C.M., Pols H.A. & Lamberts S.W. A polymorphism in the glucocorticoid receptor gene, which decreases sensitivity to glucocorticoids in vivo, is associated with low insulin and cholesterol levels // Diabetes, 2002. №51.- P.3128-3134.

13. Echwald S.M., Sorensen T.I., Andersen T., Pedersen O. The Asn363Ser variant of the gluco- corticoid receptor gene is not associated with obesity or weight gain in Danish men // Int. J. Obes.

Relat. Metab. Disord, 2001. №25.- P.1563-1565.

14. Syed A.A., Irving J.A., Redfern C.P., Hall A.G., Unwin N.C., White M., Bhopal R.S., Weaver J.U. Association of glucocorticoid receptor polymorphism A3669G in exon 9 with reduced central adiposity in women // Obesity, 2006. №14(5).- P.759-764.

15. Panek M., Pietras T., Antczak A., Go?rski P., Kuna P., Szemraj J. The role of functional single nucleotide polymorphisms of the human glucocorticoid receptor gene NR3C1 in Polish patients with bronchial asthma // Mol. Biol. Rep., 2012. №39.- P.4749-4757

16. Симакова М.А. Ассоциация полиморфизма генов NR3C1 и MDR1 с терапевтической резистентностью и глюкокортикоидной терапией у больных бронхиальной астмой //

Пульмонология, 2011. №118(3).- C.

17. Bray P.J., Cotton R.G. Variations of the human glucocorticoid receptor gene (NR3C1):

pathological and in vitro mutations and polymorphisms // Hum. Mutat., 2003. №21.- P. 557-568.

Сейтак А.А., Акпарова А.Ю., Берсимбай Р.И.

Глюкокортикоид рецептор генi полиморфизмiнiң бронх демiкпесiне бейiмдiлiктегi рөлi

Қысқа әдебиет шолуда глюкокортикоидтардың әсер ету механизмi, глюкокортикоид рецепторының құрылымы мен атқаратын қызметтерi, бронх демiкпесi және басқа да ауруларға бейiмдiлiктiң қалыптасуында глюкокортикоид рецепторы генi полиморфизмiнiң рөлi туралы қазiргi ғылыми зерттеулер жинақталып көрсетiлген.

Seitak A.A., Akparova A. Yu., Bersimbay R. E.

The role of polymorphisms of the glucocorticoid receptor gene in susceptibility to bronchial asthma This short review presents the current scientific knowledge of the action mechanisms of glucocorticoids, the structure and functions of the glucocorticoid receptor, the role of the gene polymorphism of the glucocorticoid receptor in forming a susceptibility to asthma and some diseases.

Поступила в редакцию 15.10.12 Рекомендована к печати 30.10.12