METODE PENELITIAN
2. Aktivitas Antioksidan 1 Uji LD50 1 Uji LD50 1 Uji LD50
Studi pendahuluan pada pengujian LD50 menggunakan dosis 15 g ekstrak/kg bb (bobot badan) bertujuan untuk mencari efek toksik. Pemberian ekstrak Selaginella dilakukan secara oral sebanyak satu kali. Mencit yang digunakan adalah mencit jantan, strain DDY (Deutch Danken Yolken) dengan bobot badan berkisar 28.5–34.5 g yang berumur 2.5−3 bulan. Jumlah mencit untuk setiap kelompok ekstrak S. ornata, S. plana, dan S. willdenovii masing-masing sebanyak 5 ekor. Pengamatan bobot badan dan kematian (mortalitas) dilakukan selama 7 hari (Harmita & Radji 2008).
Pengujian LD50 selanjutnya pada ketiga jenis ekstrak Selaginella dilakukan dengan menggunakan metode Weil (1952). Pemberian ekstrak pada hewan mencit diberikan secara oral dengan empat taraf dosis yang berbeda.
Pemilihan dosis mengikuti progresi geometris (Harmita & Radji 2008). Rumus yang digunakan sebagai berikut:
YN = Y1 RN-1 Keterangan: YN = dosis ke-N
Y1 = dosis pertama R = faktor pemacu N = deret dosis
Mencit yang digunakan adalah mencit betina, strain DDY dengan bobot badan berkisar 21.7–40.8 g yang berumur 2.5−3 bulan. Jumlah mencit untuk setiap jenis ekstrak S. ornata, S. plana, dan S. willdenovii masing-masing sebanyak 4 ekor. Selanjutnya efek toksik ekstrak dievaluasi selama 7 hari (Harmita & Radji 2008) dan dihitung dosis letal median (LD50). Rumus yang digunakan pada metode Weil (1952) sebagai berikut:
Log m = log D + d(f+1)
Keterangan: m = nilai LD50
D = Dosis terkecil yang diberikan d = log dari kelipatan dosis (log R) f = suatu faktor dalam tabel Weil
2.2 Pemberian Ekstrak Selaginella dan Cekaman Oksidatif
Metode pemberian ekstrak dan cekaman oksidatif merupakan modifikasi dari metode yang digunakan oleh Gayathri et al. 2005 dan Wresdiyati et al. (2007). Cekaman oksidatif diberikan dengan cara puasa (tidak diberi pakan) dan berenang selama lima menit setiap hari dengan pemberian air minum secara ad libitum selama 3 hari. Untuk menganalisis pengaruh ekstrak Selaginella terhadap aktivitas antioksidan secara in vivo digunakan mencit jantan dengan bobot badan
berkisar 21.3–43 g yang berumur 2.5−3 bulan. Kontrol terdiri dari: (1) kontrol negatif yaitu mencit yang tidak mendapat ekstrak, namun mendapat cekaman oksidatif, (2) kontrol positif yaitu mencit yang mendapat ekstrak (dosis 0.6 g ekstrak/kg bb), tetapi tanpa cekaman oksidatif, dan (3) kontrol netral yaitu mencit yang tetap mendapatkan pakan dan tidak mendapat cekaman maupun ekstrak. Pada setiap ekor mencit percobaan diberi 0.5 ml ekstrak dengan dosis sesuai perlakuan. Pada hari kelima mencit-mencit tersebut dimatikan dan contoh hati diambil.
2.3 Persiapan Homogenat Hati
Hati yang telah diperoleh dari hasil pembedahan direndam dengan NaCl 0.9% dan selanjutnya disimpan dalam larutan KCl 1.15% (Ohkawa et al. 1979). Dari larutan KCl 1.15%, dicuci dengan aquabides dan dibuat homogenat 25% menggunakan aquabides (Gayathri et al. 2005 dan Lampiran 9). Pembuatan homogenat dengan cara dihaluskan, disaring, dan disimpan pada suhu –20ºC untuk pengujian selanjutnya (Hasani et al. 2007). Dari bahan homogenat tersebut, diambil masing-masing 0.1–1 ml untuk analisis peroksidasi lipid dan analisis Superoksida Dismutase.
2.4 Analisis Peroksidasi Lipid
Analisis peroksidasi lipid untuk penentuan konsentrasi MDA (malondialdehyde) dalam nmol/µg protein dimulai dengan analisis protein. Analisis protein pada homogenat hati mencit menggunakan metode biuret. Metode biuret merupakan salah satu cara yang terbaik untuk menentukan kadar protein suatu larutan (Apriyantono et al. 1989).
Pereaksi biuret terdiri dari larutan 3 g CuSO4.5H2O dan 9 g Na-K-Tartrat dalam 500 ml NaOH 0.2 N. Selanjutnya larutan ditambah 5 g KI kemudian diencerkan sampai 1000 ml dengan menggunakan NaOH 0.2 N. Larutan protein standar merupakan larutan bovine serum albumin (BSA) dalam aquades dengan konsentrasi 5 mg/ml.
Kurva standar dibuat dengan menggunakan larutan BSA dengan konsentrasi 5 mg/ml pada 7 macam volume yang berbeda yaitu 0 (blanko), 0.1,
0.2, 0.4, 0.6, 0.8 dan 1 ml larutan protein standar dengan menambahkan aquades sampai volume total masing-masing 4 ml. Selanjutnya larutan ditambah dengan 6 ml pereaksi Biuret dan dicampur dengan menggunakan vortex. Larutan tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama 10 menit sampai pembentukan warna biru sempurna dan pengukuran absorbansinya dilakukan pada panjang gelombang 520 nm.
Untuk penetapan sampel sebanyak 0.5 ml dilakukan dengan membagi homogenat ke dalam tabung reaksi seperti pada waktu penetapan standar, kemudian ditambah air sampai volume total masing-masing 1 ml. Selanjutnya larutan ditambah 1 ml Trichloroacetic acid (TCA) 10% sehingga protein akan terdenaturasi. Selanjutnya larutan disentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit sampai protein yang terdenaturasi mengendap, dan supernatan dibuang dengan cara dekantasi. Endapan ditambah 2 ml etil eter dan dicampur merata lalu disentrifus kembali untuk menolong menghilangkan residu TCA dan dibiarkan mengering pada suhu kamar. Selanjutnya endapan kering ditambah 4 ml aquades dan dicampur merata, sampai larut seluruhnya. Larutan ditambah dengan 6 ml pereaksi Biuret, dan larutan alkali dalam pereaksi ini akan melarutkan endapan yang tersisa. Larutan tersebut dicampur dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 10 menit sampai terbentuk warna biru sempurna dan pengukuran absorbansinya dilakukan pada panjang gelombang ( ) 520 nm.
Analisis peroksidasi lipid diuji dengan sistem Fe2+ - askorbat (Gayathri et al. 2005). Campuran reaksi terdiri dari 0.1 ml homogenat hati 25%, 0.1 ml larutan penyangga Tris-HCl 1M (pH 7), 0.1 ml asam askorbat 1.5 mM, 0.1 ml Fe-ammonium sulfat 4 mM, dan 0.1 ml aquabides hingga seluruhnya mencapai volume 0.5 ml. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama 1 jam. Kandungan peroksidasi lipid diukur sebagai senyawa asam tiobarbiturat yang terukur dengan metode dari Ohkawa et al. (1979) dan Mihara et al. (1980).
Setelah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37ºC, campuran tersebut ditambah dengan 0.5 ml larutan Trichloroacetic Acid (TCA) 0.1% (w/v) yang mengandung Butylated Hydroxytoluene (BHT) 1mM pada suhu 4ºC. Homogenat tersebut kemudian ditambah 3 ml larutan H3PO4 2% (v/v) dan 1 ml TBA 0.6% (w/v) dalam TCA 20% (w/v). Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 100ºC
selama 30 menit, kemudian didinginkan sampai mencapai suhu ruang. Setelah dingin campuran ditambah 4 ml n-butanol 100% (v/v) kemudian di kocok dengan kuat menggunakan vortex. Fase butanol dan fase larutan dipisahkan dengan sentrifugasi 3000 rpm selama 30 menit (Labofuge 400R). Absorbansi kompleks TBA-MDA pada fase butanol diukur dengan spektrofotometer pada 532 nm, sedangkan untuk nilai absorban non spesifik diukur pada 520 nm. Konsentrasi MDA sebagai produk akhir peroksidasi lipid dapat dihitung dengan mengurangi nilai absorban pada 532 nm dengan nilai absorban pada 520 nm.
Tingkat peroksidasi lipid dicerminkan oleh konsentrasi MDA yang terbentuk yang dapat dihitung dengan menggunakan rumus:
MDA Ɛ x d
Keterangan: [MDA] = Konsentrasi MDA yang terbentuk (nmol) A = Selisih nilai absorban
Ɛ = Nilai ekstansi MDA (155 mM-1cm-1) d = Lebar kuvet (cm)
v = Volume sampel (ml)
Persen penghambatan dari pembentukan peroksida lipid ditentukan dengan cara membandingkan hasil dari contoh yang diberi dan tidak diberi perlakuan ekstrak Selaginella.
2.5 Analisis Superoksida Dismutase (SOD)
Analisis SOD menggunakan metode Kubo et al. (2002), Wijeratne et al. (2005), dan Prangdimurti et al. (2006) dengan sedikit modifikasi. Penggunaan metode ini untuk mengukur aktivitas menangkap radikal anion superoksida yang dihasilkan secara enzimatis oleh sistem xantin-xantin oksidase.
Sebanyak 0.06 ml homogenat hati direaksikan dengan larutan yang terdiri dari 2.7 ml bufer Natrium Karbonat 40 mM yang mengandung EDTA 0.1 mM (pH 10), 0.06 ml Xantin 10 mM, 0.03 ml BSA 0.5%, dan 0.03 ml NBT (nitroblue tetrazolium) 2.5 mM. Selanjutnya larutan ditambah dengan 100 µl (0.1 ml) Xantin
Oksidase (0.04 units). Absorbansi yang dihasilkan setelah 30 menit diukur pada panjang gelombang 560 nm. Sebagai kontrol digunakan larutan yang digunakan dalam persiapan sampel hati yaitu 11.5 g/l KCl (PBS yang mengandung 11.5 g/l KCl). Aktivitas SOD (%) dihitung dengan menggunakan persamaan berikut:
B Keterangan: A= absorbansi larutan sampel
B= absorbansi larutan kontrol
Analisis Data
Analisis data dilakukan dengan uji sidik ragam (ANOVA). Jika dari hasil analisis ragam perlakuan berpengaruh nyata terhadap peubah yang diamati maka dilanjutkan dengan uji Duncan Multi Range Test (DMRT) dengan tingkat kepercayaan 95%.