3 PENGEMBANGAN MARKA SNAP BERBASIS GEN WRKY
3.3 Hasil dan Pembahasan 1 Disain Primer SNAP
3.3.5 Aplikasi Duplex PCR untuk Aksesi Kelapa Kopyor
Reaksi duplex PCR diuji menggunakan 15 individu kelapa Genjah kopyor Pati dan kelapa Dalam kopyor Jember dengan pasangan primer WRKY6#3 (352 pb) dan WRKY19#1 (211 pb); WRKY6#1 (107 pb) dan WRKY2#2 (260 pb). Fragmen DNA dinilai berdasarkan ada atau tidak ada pita pada dua reaksi PCR dari setiap pasang primer. Marka SNAP bersifat heterozigot bila kedua pasang primer mengamplifikasi fragmen DNA, tetapi bersifat homozigot bila hanya sepasang primer yang mengamplifikasi fragmen DNA. Jika kedua pasang primer tidak mengamplifikasi fragmen DNA, maka marka SNAP tidak bersifat bi-alel.
Amplifikasi DNA kelapa kopyor Pati dengan primer WRKY6#3 (352 pb) dan WRKY19#1 (211 pb) menghasilkan fragmen yang jelas untuk semua sampel yang diuji, hal ini menyatakan bahwa lima belas sampel tersebut memiliki alel heterozigot (Gambar 3.6ab). Pada kelapa kopyor Jember terdapat dua sampel yaitu nomor 1 dan 6 yang memiliki alel homozigot, untuk sampel nomor 1 pada lokus WRKY19#1 sedangkan sampel nomor 6 berada pada lokus WRKY6#3. Sampel nomor 2-5 dan 7-15 memiliki alel heterozigot karena alel reference dan alel alternate dapat teramplifikasi dengan baik (Gambar 3.6cd).
319 pb 272; 260 107 1000 pb 500 100 M M2-1 M2-2 M2-3 M2-4 M3-1 M3-2 M3-3 M3-4 Duplex Triplex
Gambar 3.6 Variabilitas kelapa kopyor Genjah Pati (A dan B) dan kelapa kopyor Dalam Jember (C and D) berdasarkan duplex PCR dari dua lokus marka SNAP. Gambar A dan C menggunakan primer WRKY6#3Ref [352 pb] dan WRKY19#1Ref [211 pb], sedangkan B dan D menggunakan primer WRKY6#3Alt [353 pb] dan WRKY19#1Alt [210 pb]. No.1-15: nomor sampel kelapa Kopyor yang digunakan. M: 100 pb DNA ladder
Fragmen DNA yang dihasilkan dari primer WRKY6#1 (107 pb) dan WRKY2#2 (260 pb) menggunakan DNA kelapa kopyor Pati dan Jember menunjukkan hasil yang berbeda. Untuk kelapa kopyor Pati terdapat tiga sampel yang memiliki alel homozigot yaitu sampel nomor 3, 5 dan 7. Ketiga sampel tersebut memiliki alel homozigot pada lokus WRKY6#1, sedangkan sampel yang lain memiliki alel heterozigot. DNA kelapa kopyor Jember yang diamplifikasi dengan primer WRKY6#1 (107 pb) dan WRKY2#2 (260 pb) menghasilkan fragmen yang sama, hal ini berarti bahwa lima belas sampel yang digunakan memiliki alel heterozigot (Gambar 3.7). Validasi primer SNAP pada tanaman pisang Klutuk Wulung dan Barangan juga menunjukkan adanya alel homozigot dan heterozigot (Sutanto et al. 2013).
353 pb 210 1000 pb 500 100 352 pb 211 1000 pb 500 100 1000 pb 500 100 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 352 pb 211 353 pb 210 1000 pb 500 100 A B C D Ref Alt Ref Alt
Gambar 3.7 Variabilitas kelapa Kopyor Genjah Pati (A dan B) dan kelapa Kopyor Dalam Jember (C and D) berdasarkan duplex PCR dari dua lokus marka SNAP. Gambar A dan C menggunakan primer WRKY6#1Ref (107 pb) dan WRKY2#2Ref (260 pb), B dan D menggunakan primer WRKY6#1Alt (107 pb) dan WRKY2#2Alt (260 pb). No.1-15: nomor sampel kelapa Kopyor. M: 100 pb DNA ladder
3.4 Simpulan
Berdasarkan 35 data sekuens gen WRKY di GenBank NCBI, dapat mendisain 8 primer SNAP gen WRKY untuk gen WRKY2, WRKY6, WRKY7, WRKY19 dan WRKY21. Kedelapan primer berhasil diuji dengan reaksi singleplex PCR, yang hasilnya menjadi acuan untuk validasi reaksi multiplex PCR. Reaksi multiplex PCR yang berhasil diperoleh adalah reaksi duplex PCR dan telah diaplikasikan untuk kelapa kopyor Pati dan Jember.
1000 pb 500 100 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 260 pb 107 1000 pb 500 100 1000 pb 500 100 1000 pb 500 100 260 pb 107 260 pb 107 260 pb 107 A B C D Ref Alt Ref Alt
Daftar Pustaka
Bakooie M, Pourjam E, Mahmoudi SB, Safaie N, Naderpour M. 2015. Development of an SNP marker for sugar beet resistance/susceptible genotyping to root-knot nematode. J Agr Sci Tech 17:443-454.
Bru D, Martin-Laurent F, Philippot L. 2008. Quantification of the detrimental effect of a single primer-template mismatch by real-time PCR using the 16s rRNA gene as an example. App Env Microbiol. 74(5):1660-1663.
Chaerani, Hidayatun N, Utami DW. 2009. Pengembangan set multipleks penanda DNA mikrosatelit untuk analisis variasi genetik padi dan kedelai [Development of a set of microsatellite DNA markers present in genetic variation of the rice and soybean] [in Indonesia]. J AgroBiogen. 5(2):57-64.
Chagné D, Gasic K, Crowhurst RN, Han Y, Bassett HC, Bowatte DR, Lawrence TJ, Rikkerink EHA, Gardiner SE, Korban SS. 2008. Development of a set of SNP markers present in expressed genes of the apple. Genomics. 92(5):353-358. doi: 10.1016/j.ygeno.2008.07.008.
Ching A, Caldwell KS, Jung M, Dolan M, Smith OSH, Tingey S, Morgante M, Rafalski AJ. 2002. SNP frequency, haplotype structure and linkage disequilibrium in elite maize inbred lines. BMC Genetics. 19(3):1-14.
Cho J, Lu C, Kohel RJ, Yu JZ. 2011. Development and mapping of gene-tagged SNP markers for gland morphogenesis in cotton. J Cotton Sci. 15:22–32.
Culley TM, Stamper TI, Stokes RL, Brzyski JR, Hardiman NA, Klooster MR, Merritt BJ. 2013. An efficient technique for primer development and application that integrates fluorescent labeling and multiplex pcr. Applications Plant Sci. 1(10). doi: doi:10.3732/apps.1300027.
Eulgem T, Rushton PJ, Robatzek S, Somssich IE. 2000. The WRKY superfamily of plant transcription factors. Trends Plant Sci. 5:199-206.
Fang WP, Meinhardt LW, Tan HW, Zhou L, Mischke S, Zhang D. 2014. Varietal identification of tea (Camellia sinensis) using nanofluidic array of single nucleotide polymorphism (SNP) markers. Hortic Res. 1:2052-7276. doi: 10.1038/hortres.2014.35.
Hayden JM, Nguyen TM, Waterman A, Chalmers KJ. 2008. Multiplex-ready PCR: a new method for multiplexed SSR and SNP genotyping. BMC Genomics. 80(9):1-12. doi: 10.1186/1471-2164-9-80.
Kim JS, Jang HW, Kim JS, Kim HJ, Kim JH. 2012. Molecular identification of Schisandra chinensis and its allied species using multiplex PCR based on SNPs. Genes Genomics. 2012(34):283-290.
Le TH, Nguyen KT, Nguyen NTB, Doan HTT, Le XTK, Hoang CTM, Van De N. 2012. Development and Evaluation of a Single-Step Duplex PCR for Simultaneous Detection of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica (Family Fasciolidae, Class Trematoda, Phylum Platyhelminthes). Journal of Clinical Microbiology. 50(8):2720-2726.
Li X, Gao W, Guo H, Zhang X, Fang DD, Lin Z. 2014. Development of EST-based SNP and InDel markers and their utilization in tetraploid cotton genetic mapping. BMC Genomics. 15(1):1-11.
Liu L, Wu Y. 2012. Development of a genome-wide multiple duplex-SSR protocol and its applications for the identification of selfed progeny in switchgrass. BMC Genomics. 13(522):1-13.
Mammadov J, Aggarwal R, Buyyarapu R, Kumpatla S. 2012. SNP markers and their impact on plant breeding. Intl J Plant Genomics. 2012:1-11. doi: 10.1155/2012/728398.
Masi P, Spagnoletti ZPLS, Donini P. 2003. Development and analysis of multiplex microsatellite markers sets in common bean (Phaseolus vulgaris L.). Mol Breed. 11:303-313.
Migliaro D, Morreale G, Gardiman M, Landolfo S, Crespan M. 2012. Direct multiplex PCR for grapevine genotyping and varietal identification. Plant Genet Resources. 2012:1-4. doi: 10.1017/S1479262112000433.
Mousset M, Flaven E, Justy F, Pouzadoux J, Gode C, Pauwels M, Gonneau C. 2015. Characterization and multiplexing of 21 microsatellite markers for the herb Noccaea caerulescens (Brassicaceae). Applications Plant Sci. 3(12):1-6.
Novarianto H. 2008. Perakitan kelapa unggul melalui teknik molekuler dan implikasinya terhadap peremajaan kelapa di Indonesia [Assembling of superior coconut by molecular technique and its implication to coconut renewal in Indonesia] [in Indonesia]. Pengembangan Inovasi Pertanian. 1(4):259-273.
Olmos CC, Vilanova S, Pascual L, Roselló J, Cornejo JC. 2015. SNP markers applied to the characterization of Spanish tomato (Solanum lycopersicum L.) landraces. Sci Hortic. 194:100-110.
Ren J, Sun D, Chen L, You FM, Wang J, Nevo E, Sun D, Luo MC, Peng J, Peng Y. 2013. Genetic diversity revealed by single nucleotide polymorphism markers in a worldwide germplasm collection of durum wheat. Intl J Mol Sci. 14:7061-7088. doi: 10.3390/ijms14047061.
Shahinnia F, Sayed-Tabatabaei. 2009. Conversion of barley SNPs into PCR-based marker using dCAPS method. Gen Mol Biol. 32(3):564-567.
Sheng ZL, Becquet V, Hua LS, Zhang D. 2003. Optimization of multiplex PCR and multiplex gel electrophoresis in sunflower SSR analysis using infrared flourescence and tailed primers. Acta Botanica Sinica. 45(11):1312-1318.
Simko I, Eujayl I, Hintum TJL. 2012. Empirical evaluation of DArT, SNP, and SSR marker-systems for genotyping, clustering, and assigning sugar beet hybrid varieties into populations. Plant Sci. 184:54-62. doi: 10.1016/j.plantsci.2011.12.009.
Singh N, Choudhury DR, Singh AK, Kumar S, Srinivasan K, Tyagi RK, Singh NK, Singh K. 2013. Comparison of SSR and SNP markers in estimation of genetic diversity and population structure of Indian rice varieties. Plos One. 8(12):1-14. doi: 10.1371/journal.pone.0084136.
Sint D, Raso L, Traugott M. 2012. Advances in multiplex PCR: balancing primer efficiencies and improving detection success. Methods Ecol Evol. 2012(3):898– 905 doi: 10.1111/j.2041-210X.2012.00215.x.
Sutanto A, Hermanto C, Sukma D, Sudarsono. 2013. Development of SNAP marker based on resistance gene analogue genomic sequences in banana (Musa spp.) [In Indonesia]. J Hortic. 23(4):300-309.
Wang B, Tan HW, Fang W, Meinhardt LW, Mischke S, Matsumoto T, Zhang D. 2015. Developing single nucleotide polymorphism (SNP) markers from transcriptome sequences for identification of longan (Dimocarpus longan) germplasm. Hortic Research. 65:1-10. doi: 10.1038/hortres.2014.65.
Wen D, Zang C. 2012. Universal multiplex PCR: a novel method of simultaneous amplification of multiple DNA fragments. Plant Methods. 32(8):2-9.
Xu W, Zhai Z, Huang K, Zhang N, Yuan Y, Shang Y, Luo Y. 2012. A novel universal primer-Multiplex-PCR method with sequencing gel electrophoresis analysis. Plos One. 7(1):1-10. doi: 10.1371/journal.pone.0022900.
Zhang Y, Wang L. 2005. The WRKY transcription factor superfamily: its origin in eukaryotes and expansion in plants. BMC Evol Biol. 5(1):1-12.