METODE PENELITIAN
3.8. Bahan dan Cara Kerja
Prosedur Penelitian
Penelitian dilaksanakan di RSUP. H. Adam Malik Medan. Subjek yang dimasukkan ke dalam penelitian ini adalah kasus-kasus Glaukoma Sudut Terbuka Primer yang datang ke RSUP.H. Adam Malik Medan. Pertama sekali dilakukan pemeriksaan tajam penglihatan, kemudian diukur tekanan intra okuli dengan menggunakan tonometri applanasi goldmann. Apabila tekanan intra okuli > 21 mmHg, maka dilanjutkan dengan pemeriksaan optik disk dengan oftalmoskop direk merk Heinz. Apabila dari pemeriksaan direk oftalmoskop dijumpai tanda-tanda glaukoma seperti cupping disc ratio > 0,3, nasalisasi, temporal pallor, bayonet, kemudian dilanjutkan dengan pemeriksaan lapang pandangan
dengan menggunakan perimetrik automatik Optopol 910 dan pemeriksaan LSSR dan optic nerve head dengan Stratus OCT. Setelah itu dilanjutkan dengan pengambilan darah untuk melihat kadar MDA dan GPx dan hasil pengambilan darah dibawa ke laboratorium untuk dilakukan pemeriksaan. Penderita dijadikan dua kelompok dengan cara consecutif sampling.
Pemeriksaan tekanan intraokuli, optik disk, lapang pandangan, LSSR dan optic nerve head , plasma MDA dan sel darah merah GPx diperiksa pada saat pertama kali datang, bulan ketiga dan bulan keenam.
1. Prosedur Kerja Pemeriksaan Tekanan Intraokuli
- Alat yang digunakan untuk mengukur tekanan intraokuli adalah dengan menggunakan tonometer applanasi goldmann
- Mata pasien ditetesi dengan pantokain 0,5 %, tunggu selama 5 menit
- Ujung tonometer applanasi dibersihkan dengan air bersih, dan tombol skala tonometer diletakkan pada angka nol (dikalibrasi) dan ujung tonometer applanasi disinari sinar biru
- Pasien didudukkan di depan slitlamp dan mata pasien ditetesi dengan fluorescent tetes 1 tetes kemudian dahi pasien rapat pada plastik slit lamp
- Mata pasien melihat lurus ke depan dan ujung tonometer applanasi ditempelkan pada kornea pasien
- Tangan kiri peneliti memegang tombol pengukur slit lamp dan tangan kanan memegang skala tonometer dan mata peneliti melihat adanya ½ lingkaran melalui okular slit lamp
- Kemudian kita memutar tombol applanasi sehingga pinggir ½ lingkaran atas dan ½ lingkaran bawah bertemu di garis horizontal.
- Sesudah skala tonometer applanasi dibaca dan hasilnya dikalikan sepuluh, maka kan diperoleh nilai tekanan bola mata pasien.
2. Prosedur Kerja Pemeriksaan Optik Disk
- Optik disk diperiksa dengan menggunakan oftalmoskop direk merk Heinz
- Oftalmoskop direk sebaiknya diperiksa dalam ruangan gelap - Pasien duduk melihat lurus ke depan, ketika pemeriksa berdiri
atau duduk lebih tinggi di samping daripada mata yang akan diperiksa.
- Tangan kanan pemeriksa memegang gagang oftalmoskop dan mata kanan pemeriksa memeriksa mata kanan, begitu juga sebaliknya tangan kiri pemeriksa memegang gagang oftalmoskop dan mata kiri pemeriksa memeriksa mata kiri pasien. - Pemeriksaan dilakukan lebih optimal dengan memegang
- Titik fokus diubah dengan memakai roda lensa yang kekuatannya semakin bertambah besar. Pemeriksa dapat memilihnya dengan memutar roda tersebut di depan mata. Lensa-lensa ini disusun berurutan dan diberi nomor sesuai kekuatannya dalam satuan ‘dioptri’.
3. Prosedur Kerja Pemeriksaan Lapang Pandangan Pengujian Target dan Strategi
- Perimetri proyeksi memunyai sensitivitas dan spesifisitas yang sangat bagus.
- Memberikan strategi pengujian yang sangat fleksibel dan model penyajian target.
- Ukuran target yang standar untuk perimetri otomatis sama dengan goldman ukuran III (4 mm ) berupa target putih.
- Keadaan terang ditunjukkan dengan desibel.
- Untuk kebanyakan instrument, decibel didefinisikan sebagai l0 x log (10.000/asb) dimana satu apostilb (asb) adalah satu unit keadaan terang per unit area (dan definisikan sebagai n-l candela/m.
Persiapan Pasien
- Sebagian besar otomatik perimeter menggunakan bentuk rnangkuk seperti pada perimeter Goldmann dengan latar belakang cahaya putih 31.5 asb
- Sesuaikan tinggi rneja dan dagu dalam posisi diam kemudian pasien menempelkan dahi mengarah ke depan.
- Luruskan pandangan ke tengah monitor dan cahaya ruangan dikurangi, biarkan pasien selama 3 menit beradaptasi dengan cahaya perimeter.
- Penglihatan pasien harus di koreksi refraksi dengan benar sebelum pengujian, dan fiksasi pasien harus dimonitor secara terus-menerus selama pengujian, berikan progam demonsrasi terlebih dahulu pada pasien yang baru menggunakan otomatik perirnetri dan pasien diajarkan tentang apa yang diharapkan dan dikerjakan.
Interprestasi hasil cetakan
- Hasil cetakan tes memberikan informasi dasar pasien seperti umur dan diameter pupil.
- Data mentah otomatik perimetri menunjukkan ukuran dan nomor plot, nilai sensitifitas masing-masing titik uji dapat dilihat pada gambar berikut ini:
- Model test yang digunakan adalah threshold atau screening test. - Screening test adalah metode yang lebih efektif untuk
mendeteksi area yang dicurigai pada lapangan pandang dan memerlukan evaluasi lebih lanjut. Threshold test menentukan sensitifitas berbagai titik di dalam lapang pandangan dan mendeteksi lebih dini perubahan sensitifitas retina.
- Dalam mengulang hasil tes, pemeriksa harus melihat pada ukuran-ukuran reliability, pengelompokan angka, peta kemungkinan, dan indeks global
- Ukuran reability merupakan bagian dari kehilangan fiksasi, false positif error dan false negative error.
- Kehilangan fiksasi merupakan bagian waktu dimana pasien berespon secara tak tepat, karena fiksasi tidak tetap terhadap suatu stimulus pada bintik buta.
- False positif error rate adalah bagian waktu dimana pasien berespon di saat tidak ada stimulus yang ditampilkan .
- False negative error rate adalah bagian waktu dimana pasien tidak berespon saat stimulus supra threshold ditampilkan.
- Hasil cetakan menunjukan parameter ini dengan xx bila dicurigai adanya reabilitas rendah.
- Pemeriksaan lapang pandangan dianggap tidak meyakinkan bila 3 atau lebih parameter berikut ditemukan :
' Total question > 400, ' fixation loss > 20 %,
' false positif responses > 33 %, ' false negative responses > 33 %, ' fluktuasi jangka pendek > 4.0 dB
- Pengelompokan angka memberikan nilai threshold yang teratur pada setiap titik yang diuji.
- Pengulangan kembali nomor yang tinggi berarti cahaya redup dan dengan demikian area penglihatan menjadi lebih sensitive. Daerah yang gelap mengalami kehilangan sensitivitas yang besar dalam target.
- Total deviation rnelihat semua defek, apakah terlokalisir atau menyeluruh.
- Pattern deviation menilai perubahan yang merata pada sensitivitas lapang pandangan sehingga dapat dilihat lokasi defek.
- Tempat yang mungkin menjadi abnormal ditunjukkan sebagai tanda hitam.
- Pada tes yang dapat dipercaya lapangan yang abnorrnal biasanya membutuhkan rangkaian paling sedikit tiga titik abnonnal, tidak terletak dipinggir, pada titik pattern deviation.
- Global indices adalah MD (nilai rata-rata deviasi dari orang yang normal dengan umur yang sesuai), PSD (Pattern standard deviatio ), SF (short-term fluctuation) dan CPSD (cooected pattem standard deviation).
- MD adalah angka rata-rata nilai desibel seluruh total deviation plot dan jika terdapat penurunan sensitivitas, apakah menyeluruh atau terlokalisir.
- PSD adalah perbedaan nilai total deviasi. Nilai SF lebih dari 7.0 dB pemeriksaan tidak dapat dipercaya. CPSD diperoleh dari PSD dan SF menunjukan perbedaan antara titik yang berdekatan.
- CPSD adalah jumlah deviasi bukit penglihatan pasien pada populasi normal dengan umur yang sesuai.
4. Pemeriksaan Sudut Bilik Mata dengan Gonioskopi - Pemeriksaan dilakukan pada ruangan yang gelap
- Pasien duduk menghadap slit lamp dengan meletakkan dahi pada headrest.
- Pemeriksaan dilakukan dengan menggunakan lensa Three Mirror Goldmann yang terlebih dahulu ditetesi methylcellulosa 1%
- Pasien diinstruksikan untuk melihat ke atas untuk meletakkan tepi gonioskopi pada forniks bawah
- Kemudian pasien melihat ke arah depan untuk pemeriksaan sudut bilik mata
Tingkat atau grade sudut bilik mata berdasarkan Shaeffer System (Lisegang, et al., 2010).
Grade 4 : sudut yang dibentuk antara iris dan permukaan jala-jala trabekula adalah 45 derajat
Grade 3 : sudut yang dibentuk antara iris dan permukaan jala-jala trabekula diantara 20 derajat sampai 45 derajat
Grade 2 : sudut yang dibentuk antara iris dan permukaan jala-jala trabekula kurang dari 20 derajat, kemungkinan adalah sudut tertutup
trabekula adalah 10 derajat, sudut tertutup
Slit : sudut yang dibentuk antara iris dan permukaan jala-jala trabekula kurang dari 10 derajat.
0 : iris melekat pada jala-jala trabekula
5. Pemeriksaan Lapisan Serabut Syaraf retina dan Optic Nerve Head dengan STRATUS OCT Carl Zeiss
- Posisikan tubuh pasien sesuai dengan tinggi mejanya sehingga pasien merasa nyaman, kemudian instruksikan pasien untuk meletakkan dagu di salah satu bagian kanan atau kiri, pastikan bahwa dagu pasien menempel pada 2 sensor (berwarna hitam) dan dahi pasien menempel pada chin rest. Komputer akan otomatis mengenali mata kanan atau kiri yang akan diperiksa. - Setelah pasien merasa nyaman instruksikan untuk melihat ke
tengah dan posisikan pupil mata supaya berada di tengah dengan menekan tombol mouse sehingga pupil tepat berada di tengah layar. Kemudian instruksikan pasien untuk melihat ke dalam dan fokus di tengah melihat tanda silang hijau.
- Setelah pupil tepat berada di tengah tekan tombol chinrest ke kiri atau ke kanan sehingga gambar pupil terlihat fokus
- Setelah semua parameter pemeriksaan tepat maka pastikan pasien tetap fokus pada titik fiksasi.
6. Pengukuran Kadar Plasma MDA
Conjugated atau polymerazed MDA dapat terhidrolisa dalam medium asam dan labil dalam pemanasan. Metode TBARS menggunakan teknik kalorimetri dengan melihat perubahan warna, tetapi memunyai hasil yang tidak spesifik, oleh karena juga terukur aldehid yang lain. Hasil TBA- MDA memunyai hasil yang lebih baik dengan memakai teknik fluorometri. Pemeriksaan yang lebih spesifik menggunakan metode high performance liquid chromatography (HPLC)/mass spektrofotometri, dan memenuhi kriteria akurasi, spesifisitas dan sensitivitas dan metode ini sebagai pilihan untuk evaluasi status stress oksidatif . Nilai normal MDA tergantung
metode yang digunakan, lebih dari 4 μmol/l dengan mengukur
TBAR dengan metode kalorimetri, kadar normal hingga 2,5 μmol/ dengan
metode fluorometri, dan kadar 0,60 – 1 μmol/l dengan metode HPLC (high performance liquid chromatography)/mass spektrofotometri dan metode ini yang saat ini menjadi pilihan sebagai petanda biologis stress oksidatif. Dengan metode spektrofotometri dapat ditentukan kadar plasma MDA yang menunjukkan secara spesifik kadar plasma total dan memberikan hasil yang serupa dengan kadar yang didapat menggunakan HPLC dengan koefisien variasi 1,2-3,4%. Nilai kadar MDA dengan metode spektrofotometri 1,04 ± 0,43 μmol/l.
Sampel darah untuk pengukuran kadar MDA diambil dari vena mediana cubiti sebanyak 5cc. Sampel diletakkan pada tempat pendingin dan
diputar (disentrifuge) dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit pada suhu 40 C dan supernatan disimpan pada suhu -200
Pengukuran kadar plasma MDA pada penelitian ini menggunakan MDA
OXIS dengan nomor katalog 21044 dengan metode spektrofotometri dengan panjang gelombangnya 586 nm
C.
Material Supplied ‘
- Thiobarbituric acid (4 vials/kit): berisi 0,53 gram tba - TBARS diluent 1 (4x 50 ml/kit) : berisi asam asetil - TBARS diluent 2 (4 x 50 ml/kit): berisi sodium hidrat
- MDA standart (20 ml/kit) : berisi 100 nmol/ml MDA bis (dimetil asetat)
- MDA diluent ( 100 ml/kit): berisi sterile delonized water - Marbles
- Storage
Simpan semua reagensia pada suhu 2-8 0C.
Preparation of Reagents TBA/Buffer reagensia
Gunakan 1 botol TBARS diluent 1 (50 ml), 1 botol TBARS diluent 2 (50 ml) dan 1 vial TBA. 100 ml sebanding dengan 40 tube.
Tambahkan TBA to mixing vessel yang berisi setengah dari TBARS diluent 1. Cuci vial dengan meninggalkan setengah dari TBARS diluent 1
dan tambahkan to mixing vessels. Tambahkan 1 botol TBARS diluent 2. Campurkan sampai TBA komplit.
Prosedur Pengukuran Kadar Plasma MDA
7. Pengukuran Kadar Sel Darah Merah GPx
Sampel darah untuk pengukuran kadar GPx diambil dari vena mediana cubiti sebanyak 5 cc. Pengukuran kadar GPx dengan menggunakan GPx Randox dengan metode spektrofotometri UV dengan panjang gelombang 340 nm.
Material supplied :
- GPx- Assay Buffer (120 ml) : berisi potasium fosfat dan heparin - GPx Reagen 1 (45 mg) : berisi reduced gluthation (GSH)
- GPx Reagen 2 (5 mg): berisi NADPH
- GPx Reagen 3 (10 ml): berisi cumene hydroperoksida, sodium bikarbonat
Kumpulkan EDTA Plasma
tambahkan 100 μl
sampel atau standar Tambahkan 100 μl SDS solution Tambahkan 2,5 ml TBA/buffer reagan
Tutup setiap tube dengan
glass marble, diinkubasi 950C selama 60 menit
Dipindahkan ke suhu ruangan (ice bath)
selama 10 menit
Sentrifuge sampel pada 3000 rpm selama 15
menit
Keluarkan supernatant dari sampel untuk
dianalisis
Baca absorbsi supernatant pada 586 nm
- GPx reagen 4 (1 ml): berisi potassium fosfat dan GSSG-R (Gluthathione Reductase)
- QC Material (0,5 ml) : berisi human source material
Handling and Storage
Simpan GPx reagen 1, GPx reagen 2 dan GPx reagen 3 pada suhu -700C, GPx reagen 3 dan GPx assay buffer simpan pada suhu 40 C. Semua komponen kit stabil disimpan dalam tempo 1 tahun dan QC material disimpan pada suhu -700
Preparation of Reagents and Equipment
C dan stabil disimpan dalam tempo 6 bulan.
1. Working Solution
- Gunakan aseptic handling untuk mencampur 25 ml GPx Assay buffer ke beker glass.Tambahkan 1 vial GPx reagen 1.
- Tambahkan GPx reagen 4 dan dibawa ke suhu ruangan. 2. Start Solution
- Tambahkan 2,14 ml GPx reagen 3 ke 1 vial GPx reagen 2. Bawa ke suhu ruangan.
3. QC Material
- Tambahkan 5 ml dari DI water ke QC material vial. Tunggu 5 menit, kemudian vortex gently sampai selesai. Simpan dalam es. Sample Preparation
- Ambil darah dan beri heparin sebagai antikoagulan
Prosedur Pengukuran Kadar Sel Darah Merah GPx - - - - Calculation
- Kalkulasi dengan menggunakan rumus; U/L = ^A/minute X F, F= factor
F= (TV/SV) x 10 /6,22 where TV = total volume in ml SV = sample volume in ml 10 = convert ml to L
6,22 = millimolar absorbance coefficient
Faktor ini dapat diprogram ke dalam spektrofotometri dan diubah absorbsinya pada 340 nm (^A/min) ke dalam U/L.