ASAL NTT
3.2 Bahan dan Metode 1 Tempat dan Waktu
Penelitian tahap ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan 1, Departemen Agronomi dan Hortikultura (AGH), Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (IPB). Pengamatan analisis secara mikroskopis dilaksanakan di Laboratorium Mikroteknik Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakultas Pertanian IPB, Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Hewan (FKH). Penelitian dilaksanakan mulai bulan Mei 2013 sampai April 2016.
3.2.2 Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan sebagai eksplan adalah biji matang kupas (mature seed) jeruk keprok SoE. Buah jeruk SoE diperoleh dari Kecamatan SoE, Kabupaten Timur Tengah Selatan (TTS), Propinsi Nusa Tenggara Timur (NTT). Bahan media untuk kultur in vitro adalah media dasar Murashige and Skoog (MS) yang dimodifikasi dengan penambahan vitamin Morel and Weitmore (MW) (Lampiran 2) yang disebut media MW (Husni 2010), 2,4-Dichlorophenoxy acid (2.4-D), Benzilamino Purin (BAP), Asam Absisat (ABA), Asam Giberelin (GA3), air kelapa (AK), bahan pemadat media Phytagel (Sigma). Otoklaf, Laminar Air Flow, timbangan digital, mikroskop cahaya.
3.2.3 Metode Percobaan
Penelitian pada Bab ini dilakukan dalam beberapa tahap kegiatan, yaitu: (1) Induksi kalus embriogenik; (2) Proliferasi dan Sinkronisasi kalus embriogenik membentuk late globular; (3) Pendewasaan pro-embrio membentuk embrio somatik fase kotiledon; (4) Perkecambahan embrio somatik dewasa membentuk planlet; (5) Pembesaran dan aklimatisasi planlet; dan (6) Studi embriogenesis somatik jeruk keprok SoE.
3.2.3.1 Percobaan 1. Induksi Kalus Embriogenik Jeruk Keprok SoE
Percobaan dilakukan untuk mendapatkan formulasi media in vitro yang sesuai dengan penambahan BAP yang dikombinasikan dengan 2.4-D untuk induksi kalus embriogenik dari eksplan biji matang kupas (mature seed) jeruk keprok SoE. Percobaan dilaksanakan menggunakan rancangan lingkungan rancangan acak lengkap (RAL) satu faktor dengan 4 perlakuan media induksi yang terdiri dari empat taraf 2.4-D (0, 0.1, 0.3 dan 0.5 mg L-1) yang
dikombinasikan dengan BAP 3 mg L-1. Setiap perlakuan terdiri atas 4 ulangan,
yang mana setiap ulangan adalah satu botol sebagai unit percobaan dengan satu eksplan.
Biji jeruk keprok SoE dicuci dengan deterjen dan dibilas dengan air bersih. Selanjutnya, biji jeruk disterilkan dengan larutan 50% bayclean 5% dalam Laminar Air Flow Cabinet, kemudian dibilas tiga kali dengan aquades steril. Setelah dibilas, biji diletakkan di atas kertas tisu steril untuk menyerap sisa-sisa air yang masih melekat pada biji. Kulit biji dikupas dengan menggunakan pinset dan skalpel. Biji yang telah dikupas kemudian diinokulasikan di atas media sesuai perlakuan. Kultur diinkubasikan pada suhu 25 oC dengan penyinaran lampu TL 20 W, periode 24 jam.
Pengamatan dilakukan terhadap kalus embriogenik yang terbentuk pada setiap eksplan sesuai perlakuan, jumlah embrio somatik yang terbentuk pada setiap perlakuan, proses pembentukan ES fase globular transisi (late globular), dan fase-fase pertumbuhan embrio somatik.
Data pengamatan kalus embriogenik dihitung berdasarkan persentase. Data embrio somatik yang diperoleh dianalisis menggunakan software Statistical Tool for Agricultural Research (STAR) untuk analisis varian (Anova). Hasil Anova yang berbeda nyata dilakukan analisis lanjut menggunakan Duncan Multiple Rate Test (DMRT) 5%.
Kalus embriogenik hasil dari Percobaan 1, diambil satu buah embrio transisi (late globular) dan dipindahkan ke media MW tanpa penambahan zat pengatur tumbuh untuk proliferasi kalus embriogenik dan embrio somatik true-to-type, optimasi proliferasi dan supaya terhindar dari habituasi BAP dan untuk digunakan pada tahap selanjutnya.
3.2.3.2 Percobaan 2 dan 3. Proliferasi dan Sinkronisasi Kalus Embriogenik Jeruk Keprok SoE
Percobaan dilakukan untuk mendapatkan formulasi media in vitro yang sesuai untuk proliferasi dan sinkronisasi kalus embriogenik (KE) membentuk late globular. Percobaan dilaksanakan menggunakan rancangan lingkungan rancangan acak lengkap (RAL) satu faktor. Media perlakuan yang ditambahkan adalah ABA yang terdiri atas lima taraf (0, 0.5, 1, 2 dan 4 mg L-1), dan media perlakuan yang
ditambahkan air kelapa dengan lima taraf konsentrasi (0, 5, 10, 15 dan 20%). Untuk proliferasi dan sinkronisasi KE membentuk late globular, setiap perlakuan terdiri atas 10 ulangan, yang mana setiap ulangan adalah satu botol sebagai satu unit percobaan dengan dua gumpalan KE. Setiap gumpalan KE yang diambil berukuran ±0.5 cm atau setara dengan (rata-rata) 300 mg dan diletakkan di atas media perlakuan.
Pengamatan proliferasi dan sinkronisasi KE membentuk globular dilakukan terhadap diameter kalus embriogenik (KE) dan jumlah globular transisi (late globular) yang terbentuk pada 4 minggu setelah perlakuan (MSPr).
Data proliferasi dan sinkronisasi ES yang diperoleh dianalisis menggunakan software Statistical Tool for Agricultural Research (STAR) untuk analisis varian (Anova). Hasil Anova yang berbeda nyata dilakukan analisis lanjut menggunakan Duncan Multiple Rate Test (DMRT) 5%.
3.2.3.3 Percobaan 4. Pendewasaan Pro-embrio Early-Globular Membentuk Embrio Somatik Dewasa Fase Kotiledon
Percobaan dilakukan untuk mendapatkan formulasi media yang sesuai untuk proses pendewasaan pro embrio membentuk embrio somatik dewasa. Pendewasaan pro-embrio membentuk ES dewasa dilakukan dalam suatu rancangan percobaan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 perlakuan, setiap perlakuan terdiri dari 3 ulangan, setiap ulangan adalah satu botol sebagai satu unit percobaan dengan 4 gumpalan KE. Untuk jumlah rata-rata massa pro- embrio (PEM) dan globular muda (early globular) diambil dari 3 titik gumpalan kecil KE. Gumpalan kecil KE diamati di bawah mikroskop terhadap PEM dan globular muda (early globular), sehingga diperoleh jumlah rata-rata untuk PEM adalah 30 buah dan jumlah rata-rata globular muda adalah 3 buah. Setiap gumpalan kecil KE diletakkan di atas media MW yang ditambahkan ZPT-ABA dan air kelapa (AK) sesuai perlakuan. Pendewasaan KE membentuk ES dewasa pada setiap fase dihitung pada 6 minggu setelah perlakuan (MSPr). Pendewasaan ES yang terbentuk dihitung berdasarkan persentase pembentukan pada setiap unit percobaan.
3.2.3.4 Percobaan 5 dan 6. Perkecambahan Embrio Somatik Jeruk Keprok SoE
Percobaan dilakukan untuk mendapatkan formulasi media in vitro yang sesuai untuk perkecambahan embrio somatik jeruk keprok SoE dengan menambahkan GA3 dan air kelapa. Percobaan dilaksanakan menggunakan rancangan lingkungan rancangan acak lengkap (RAL) satu faktor. Media perlakuan yang ditambahkan GA3 terdiri dari lima taraf (0, 0.5, 1, 2 dan 4 mg L-1),
dan media perlakuan yang ditambahkan air kelapa dengan lima taraf konsentrasi (0, 5, 10, 15 dan 20%). Setiap perlakuan terdiri atas 10 ulangan, yang mana setiap ulangan adalah satu botol sebagai unit percobaan dengan dua embrio somatik matang. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah embrio somatik yang berkecambah.
Data perkecambahan ES yang diperoleh dianalisis menggunakan software Statistical Tool for Agricultural Research (STAR) untuk analisis varian (Anova). Hasil Anova yang berbeda nyata dilakukan analisis lanjut menggunakan Duncan Multiple Rate Test (DMRT) 5%.
3.2.3.5 Pembesaran dan Aklimatisasi Planlet Jeruk Keprok SoE
Pembesaran planlet dilakukan dengan cara: kecambah yang masih memiliki dua daun pertama yang telah terbuka dipindahkan ke medium pembesaran planlet yaitu medium MW tanpa ada penambahan zat pengatur tumbuh (MW0). Kecambah/tunas disubkultur setiap bulan ke medium MW yang baru hingga empat kali selama empat bulan atau hingga terbentuk planlet yang telah memiliki empat atau lima daun yang telah terbuka.
Planlet yang telah berumur 4 bulan atau telah memiliki daun sebanyak 4-5 buah daun, dikeluarkan dari dalam botol kultur dan dibersihkan dari sisa bahan pemadat Phytagel yang masih melekat. Planlet direndam dalam larutan yang mengandung fungisida dan bakterisida selama 20 menit. Media tanam untuk proses aklimatisasi planlet digunakan campuran tanah:kokofit:arang sekam dengan perbandingan 1:1:1. Media dimasukkan ke dalam gelas-gelas plastik.
Planlet kemudian ditanam pada media tersebut di atas dan ditutup rapat dengan plastik dan ditempatkan di bawah naungan paranet yang dapat mengurangi intensitas cahaya hingga 40%.
3.2.3.6 Studi Embriogenesis Somatik Jeruk Keprok SoE
Massa pro-embrio (PEM) diambil dan diletakkan di atas kaca preparat. Preparat ditempatkan di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran lensa obyektif 40 kali dan difoto. Jaringan late globular dianalisis menggunakan metode pewarnaan hematoxylin dan eosin. Sampel jaringan tersebut difoto menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran lensa obyektif 4, 10 dan 40 kali. Embrio somatik jeruk keprok SoE diletakkan di atas petridish, dilihat di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 10-20 kali dan difoto. Untuk sampel yang berukuran lebih dari 0.5 cm dapat difoto secara langsung tanpa menggunakan mikroskop. Pengamatan dilakukan terhadap: fase-fase pertumbuhan massa pro-embrio (PEM/early globular) dan fase-fase pertumbuhan embrio somatik.
