BAB II. TINJAUAN PUSTAKA
2.10 Pengamatan Kromosom
Tujuan utama analisis kromosom adalah untuk mengetahui karakteristik dan morfologi dari kromosom, seperti jumlah kromosom, struktur kromosom dan aktivitas kromosom selama pembelahan sel berlangsung. Pengamatan kromosom dilakukan dengan memfiksasi sel tanaman yang merupakan tahap awal untuk mempersiapkan bahan segar untuk pengamatan mikroskopis. Tujuan dari fiksasi adalah untuk mematikan sel tanpa merusak organel-organel yang menyusun sel tersebut yaitu kromosom, untuk mengawetkan organel-organel sel dan memudahkan jaringan untuk diwarnai. Metode yang digunakan untuk menganalisis kromosom adalah metode squash atau sediaan tekan (Nurwanti, 2010).
Menurut Jurcak (1999) untuk mendapatkan hasil yang baik pada pengamatan kromosom, diperlukan waktu dan teknik yang tepat. Teknik
Universitas Sumatera Utara
pewarnaan atau disebut juga dengan squashing merupakan metode yang digunakan untuk pengamatan kromosom dengan menggunakan aceto carmine sebagai pewarna. Larutan aceto carmine dibuat dari asam asetat 45% dan serbuk carmine, dimana 100 ml asam asetat dipanaskan hingga mencapai suhu 90-95oC kemudian ditambahkan 1-2 gram serbuk carmine dan digoyang-goyangkan selama 10 menit kemudian disaring agar tidak terdapat gumpalan serbuk carmine pada larutan aceto carmine yang terbentuk. Pewarnaan terhadap preparat bertujuan untuk menciptakan perbedaan optikal diantara kromosom dengan struktur sel lainnya sehingga dapat dibedakan di bawah mikroskop. Selain serbuk carmine, pewarna yang digunakan untuk pengamatan kromosom dapat diganti dengan serbuk orcein yang dibuat dengan proses yang sama dengan larutan aceto carmine (Sastrosumarjo, 2006).
Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi antara lain pemilihan bahan fiksasi yang tepat, besar kecilnya organisme yang akan menentukan cepat dan seragamnya penetrasi bahan fiksasi, rasio volume bahan fiksasi dengan jaringan yang difiksasi pada umumnya 10-12 kali, serta karakter jaringan yang difiksasi karena ada beberapa jaringan tertentu lambat dalam penetrasi, misalnya pada tumbuhan yang memiliki epidermis yang dilapisi dengan lapisan kutikula yang bersifat hidrofobik. Perlakuan fiksasi dibedakan atas perlakuan fisik dan kimiawi. Perlakuan secara fisik dapat dilakukan dengan pendinginan jaringan dalam nitrogen cair, cara ini telah banyak digunakan untuk sel atau jaringan hewan. Pendinginan jaringan dengan nitrogen cair ini efektif untuk menjaga struktur sel karena proses difusi yang sangat kecil dan tidak terjadi perubahan enzim secara signifikan, tetapi kelemahan dari perlakuan ini dapat
Universitas Sumatera Utara
24
menyebabkan terputusnya kromosom karena adanya kristal es dalam sel atau jaringan. Perlakuan secara kimiawi dapat dilakukan dengan menggunakan bahan kimia seperti larutan carnoy. Perlakuan secara kimiawi membutuhkan keseimbangan dan ketepatan bahan-bahan yang dipakai, misalnya pencampuran larutan asam dan alkohol pada kondisi seimbang dapat menjaga struktur sel pada kondisi yang stabil dan memungkinkan untuk diamati, tetapi reaksi beberapa asam yang berlebihan dapat menyebabkan struktur sel menyusut (Melky, 2006).
Bahan tanaman yang digunakan untuk pengamatan kromosom adalah ujung pucuk dan ujung akar. Bagian tanaman terbaik untuk pengamatan mitosis adalah ujung akar, hal ini disebabkan akar tidak mengandung klorofil dan mudah dalam penyerapan warna aceto carmine/aceto orcein. Waktu pemotongan akar adalah faktor yang sangat menentukan keberhasilan pengamatan mitosis untuk menghitung jumlah kromosom. Pembelahan sel pada tanaman terjadi pada waktu yang berbeda-beda dan tidak konstan, sehingga untuk mendapatkan waktu pembelahan sel yang tepat diperlukan pengamatan yang berulang pada waktu yang berbeda. Teknik pewarnaan untuk pengamatan kromosom memerlukan keahlian dan ketelitian untuk menghasilkan preparat amatan yang akan mempengaruhi hasil pengamatan. Pada pengamatan mitosis sel terdapat beberapa kasus kesalahan dan penyebabnya yang tercantum pada tabel berikut (Jurcak, 1999).
Universitas Sumatera Utara
Tabel 1. Kesalahan Dalam Pengamatan Mitosis Sel dan Penyebabnya.
Kesalahan Penyebab
Inti terwarnai dengan jelas, tetapi tahapan Pemotongan material tanaman tidak pada mitosis tidak terlihat waktu yang tepat.
Kromosom tidak jelas 1. Waktu fiksasi terlalu pendek 2. Konsentrasi pewarna terlalu rendah 3. Pewarna yang digunakan sudah rusak
atau terlalu lama disimpan
4. Suhu selama perwarnaan terlalu rendah 5. Waktu pewarnaan terlalu pendek Beberapa sel menumpuk satu sama lain
1. Waktu melunakkan jaringan terlalu pendek
2. Pembuatan larutan untuk maserasi tidak tepat
3. Kurang tenaga ketika menekan gelas objek
Sel meristem pecah, tahapan mitosis atau
1. Gelas penutup bergeser jauh ketika ditekan
kromosom tidak dapat dilihat 2. Gelas penutup ditekan terlalu keras atau berulang-ulang
Lensa mikroskop tergores atau pecah Permukaan penyangga tidak rata
Universitas Sumatera Utara
BAB III
BAHAN DAN METODE
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini di lakukan di Laboratorium Kultur Jaringan, Fakultas Pertanian, Universitas Medan Area, Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah kassa Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Jurusan Biologi, Universitas Medan. Dilaksanakan pada bulan September 2020 sampai dengan bulan April 2021.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah planlet kentang Olimpus yang diperoleh dari Laboratorium Kultur Jaringan Balai Penelitian Tanaman Sayuran (BALITSA) Lembang- Bandung yang ditumbuhkan secara in vitro. Eksplan yang digunakan adalah tunas aksilar dari planlet kentang Olimpus yang berumur 4 minggu setelah tanam. Media kultur yang digunakan yaitu media dasar Murashige and Skoog (MS) dengan komposisi lengkap media MS dapat diamati pada Lampiran 1, gula, pemadat berupa agar-agar, CaP dan BAP (media pengumbian) dengan pH larutan media 5,9. Mutagen kimia yang digunakan adalah colchicine berbentuk serbuk yang dilarutkan sesuai dengan konsentrasi pada perlakuan. Bahan yang digunakan untuk uji sitologi berupa asam asetat 45%, HCL 1 N, Aquades, Orsein 2%, Hidroksikuinolin 0,002 M dan cat kuku tidak berwarna. Bahan lainnya yaitu Alcohol 70%, aquades steril sebagai pelarut dan spirtus.
27
Universitas Sumatera Utara
Alat yang digunakan yaitu alat tulis, kertas label, kamera, labu ukur, gelas ukur, botol kultur, plastic transparan tahan panas, karet gelang, pinset, gunting, scalple, kertas saring, tissue, timbangan analitik, cawan petri, laminar air flow, autoclave, magnetic and heat stirer, beaker glass, Erlenmeyer, pH meter, sarung tangan, masker, micro filter, mikro pipet, pipet tips, tube, pengaduk, panci perebus, hand sprayer, box (container), kain hitam, thermometer digital, jangka sorong dan rak kultur. Peralatan untuk uji sitologi yaitu mikroskop dan perlengkapannya, pisau silet, lemari es, dan pemanas air.
3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan 2 faktor perlakuan.
Faktor I : Konsentrasi Kolkisin (K) K0 : Kontrol (Media MS)
K1 : Konsentrasi Kolkisin 0,02%
K2 : Konsentrasi Kolkisin 0,04%
K3 : Konsentrasi Kolkisin 0,06%
K4 : Konsentrasi Kolkisin 0,08%
Faktor II : Lama Perendaman (P) P1 : 12 Jam
P2 : 24 Jam P3 : 48 Jam
Universitas Sumatera Utara
29
Maka diperoleh kombinasi sebagai berikut :
K0P1 K1P1 K2P1 K3P1 K4P1
K0P2 K1P2 K2P2 K3P2 K4P2
K0P3 K1P3 K2P3 K3P3 K4P3
Jumlah perlakuan : 15
Jumlah Ulangan : 5
Jumlah eksplan tiap tabung uji : 5
Jumlah Sample : 75
Jumlah eksplan : 375
Data hasil pengamatan dianalisis dengan menggunakan sidik ragam dengan model linier sebagai berikut :
Yijk = µ + αi + βj + γk + (αβ)ij + εijk
i = 1, 2, …a j = 1, 2, …b k = 1, 2, …c
Yijk : Nilai pengamatan pada blok ke-k akibat, faktor konsentrsi Kolkisin (K) taraf ke-i dan faktor lama perendaman (P) taraf ke-j dan ulangan ke-k µ : Nilai rata-rata umum
αi : Pengaruh faktor konsentrasi Kolkisin (K) pada taraf ke-i βj : Pengaruh faktor lama perendaman (P) pada taraf ke-j
(αβ)ij : Pengaruh interaksi faktor konsentrasi Kolkisin pada taraf ke-i dan faktor lama perendaman pada taraf ke-j
εijk : Pengaruh galat dari blok-k akibat faktor dari konsentrasi Kolkisin taraf ke-i dan faktor lama perendaman pada taraf ke-j dan ulangan ke-k.
Universitas Sumatera Utara
Jika hasil sidik ragam menunjukkan pengaruh nyata maka analisis dilanjutkan dengan menggunakan Uji jarak berganda Duncan (Duncan‟s Multiple Range Test) pada taraf α = 5%.
3.4 Pelaksanaan Penelitian
Dalam pelaksanaan penelitian ini dilakukan beberapa tahapan. Adapun tahapan-tahapan kegiatan yang akan dilaksanakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :
1. Sterilisasi dan Pembuatan Media
Peralatan yang digunakan seperti pinset, gunting, scalpel, pisau, botol kultur, cawan petri dan botol kultur berisi aquadest disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121oC, tekanan 17,5 psi selama 60 menit.
Media kultur yang digunakan adalah media dasar MS. Media tanam untuk perbanyakan tunas dari komposisi media MS dibuat dengan cara memipet larutan stok sesuai dengan konsentrasi yang dibutuhkan untuk membuat 1L media kedalam beaker gelas yang kemudian dimasukkan kedalam labu ukur. Gula sebanyak 30 gr/l dilarutkan dengan aquadest terlebih dahulu kemudian di masukkan kedalam labu ukur yang telah berisi larutan stock. Kemudian larutan media tadi ditambahkan CaP 1 mg/l dan aquadest sampai tanda tera pada labu ukur (satu liter). CaP digunakan sebagai hara tambahan yang mempunyai kemampuan untuk mencegah kerusakan sel dengan mencegah oksidasi pada sel.
Dwiyantono (2017) menggunakan CaP 4 ml/l sebagai hara tambahan untuk induksi mutasi dengan colchicine pada kentang kultivar Granola. Rai et al. (2015) juga menggunakan CaP sebagai hara tambahan pada kentang kultivar granola untuk optimasi produksi bibit dengan teknik fotoautotrofik.
Universitas Sumatera Utara
31
Kemasaman media (pH) diatur dan diukur agar sesuai dengan kondisi tumbuh eksplan. pH media yang digunakan dalam penelitian ini adalah 5,9, didapat dengan penambahan HCL 1 N jika pH larutan di atas 5,9 dan KOH 1 N bila pH larutan di bawah 5,9. Setelah pH diatur, larutan media dituang ke dalam panci dan ditambahkan agar-agar sebanyak 6,5 gr/l. Larutan media dipanaskan sambil diaduk untuk melarutkan agar-agar hingga mendidih. Selanjutnya media yang sudah mendidih di tuang kedalam botol kultur sebanyak 25 ml per botol (volume botol 330 ml), kemudian ditutup dengan plastik transparan tahan panas dan diikat dengan karet gelang. Media disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 17,5 Psi selama 20 menit. Media kemudian disimpan pada ruang kultur pada suhu 20oC dan diinkubasi selama 7 hari sebelum penggunaan. Hal ini bertujuan untuk menghindari jika terdapat kontaminasi pada media yang akan digunakan.
Media untuk induksi umbi mikro juga dibuat menggunakan media dasar MS. Penggunaan media dasar MS banyak digunakan untuk induksi umbi mikro (Kanwal et al., 2006). Pada media induksi umbi mikro, penambahan gula dilakukan dalam jumlah yang lebih besar yaitu 120 gr/l dan penambahan BAP sebanyak 5 mg/l. Menurut Saha et al. (2013) pembentukan umbi mikro juga dipengaruhi oleh kandungan gula dalam media, dimana pembentukan umbi mikro meningkat dengan penambahan konsentrasi gula. Pada media induksi umbi mikro ini tidak menggunakan agar-agar sebagai pemadat, jadi media yang digunakan dalam bentuk cair. Setelah semua komposisi media di campur kedalam labu ukur, kemudian ditambahkan aquadest sampai batas tera (satu liter). Kemasaman media (pH) dikur pada nilai 5,9, setelah itu larutan media di tuang kedalam botol kultur
Universitas Sumatera Utara
sebanyak 25 ml per botol dan botol ditutup dengan plastik transparan tahan panas serta diikat dengan karet gelang. Kemudian media di sterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 17.5 psi selama 20 menit.
2. Sub Kultur Planlet
Planlet di sub kultur ke dalam media perbanyakan tunas dengan cara tunas aksilar dipotong-potong pada masing-masing buku dengan ukuran ± 5 mm. Semua peralatan yang digunakan untuk penanaman disemprot dengan alcohol 70%
sebelum dimasukkan kedalam laminar air flow cabinet. Kemudian eksplan di tanam kedalam botol kultur, dimana setiap botol kultur berisi 5 eksplan. Kultur diinkubasi pada ruangan dengan suhu 20oC, intensitas cahaya lampu ± 1000 lux dengan lama penyinaran 16 jam per hari. Pada umur 4 minggu setelah tanam (MST), planlet yang dihasilkan dijadikan sebagai sumber eksplan untuk perlakuan.
3. Pembuatan Larutan Colchicine
Pembuatan larutan Kolkisin dilakukan dalam Laminar Air Flow Cabinet dengan membuat larutan stok konsentrasi 5000 ppm yaitu 250 mg kolkisin dalam 50 ml aquadest steril. Pembuatan larutan stock bertujuan untuk mempermudah pengaturan konsentrasi pada media perendaman dengan metode pengenceran.
Pada saat botol berisi kolkisin dibuka, blower dimatikan sejenak agar serbuk kolkisin tidak berterbangan, serbuk kolkisin ditimbang kemudian dimasukkan kedalam aquadest steril dalam labu erlenmeyer. Botol berisi kolkisin ditutup dan blower dinyalakan kembali, Kemudian larutan kolkisin dikocok hingga larut.
Larutan stock kolkisin disterilkan dengan menggunakan microfilter. Larutan stock
Universitas Sumatera Utara
33
kolkisin kemudian dipindahkan kedalam labu Erlenmeyer tertutup dan disimpan pada refrigerator suhu 4oC.
Larutan perlakuan kolkisin dibuat dengan menggunakan teknik pengenceran. Larutan perlakuan dengan konsentrasi 0,02% sebanyak 25 ml dibuat dengan memipet larutan stok kolkisin sebanyak 1 ml dan kemudian dimasukkan kedalam botol kultur yang berisi 24 ml media perbanyakan tanpa menggunakan agar (media cair). Larutan dikocok hingga larut sempurna. Pembuatan larutan perlakuan konsentrasi 0,04% sebanyak 25 ml dilakukan dengan memipet larutan stock kolkisin sebanyak 2 ml, kemudian dimasukkan kedalam botol kultur yang berisi 23 ml media cair. Larutan perlakuan kolkisin 0,06% sebanyak 25 ml dibuat dengan memipet larutan stok kolkisin sebanyak 3 ml dan kemudian dimasukkan kedalam botol kultur yang berisi 22 ml media cair. Pembuatan larutan perlakuan 0,08% sebanyak 25 ml dilakukan dengan memipet larutan stok kolkisin sebanyak 4 ml, kemudian dimasukkan kedalam botol kultur yang berisi 21 ml media cair.
Pencampuran media cair dengan larutan stock kolkisin dilakukan di dalam laminar. Perlakuan kontrol dibuat dengan menggunakan media cair sebanyak 25 ml. Derajat kemasaman (pH) media cair diatur menjadi 5.9, kemudian botol kultur ditutup dengan plastik transparan tahan panas dan dilakukan sterilisasi dengan autoclave pada suhu 121 oC, tekanan 17.5 psi selama 20 menit.
4. Perlakuan Perendaman Larutan colchicine dan Penanaman Eksplan
Planlet yang sudah disubkultur selama 4 MST, dipotong-potong berdasarkan 1 buku tunas dengan ukuran ± 5 mm. Bagian buku yang mengandung tunas aksilar dipisahkan pada cawan petri, setelah jumlah tunas aksilar cukup
Universitas Sumatera Utara
untuk dijadikan eksplan pada perlakuan kemudian dimasukkan ke dalam larutan perendaman kolkisin sesuai konsentrasi pada perlakuan.
Sebanyak 375 tunas aksilar kentang direndam dengan larutan colchicine yang terdiri dari 15 kombinasi perlakuan yaitu lama perendaman dengan konsentrasi colchicine dan kontrol. Sebelum direndam dalam larutan colchicine, semua tunas aksilar kentang disterilisasi dengan akuades selama 5 menit. Tunas aksilar yang telah steril kemudian dimasukkan kedalam botol kultur yang berisi larutan colchicine dengan konsentrasi masing-masing 0,02% (K1), 0,04% (K2), 0,06% (K3) dan 0,08% (K4) sesuai dengan lama perendaman masing-masing yaitu 12 jam (P1), 24 jam (P2) dan 48 jam (P3), sedangkan kontrol direndam dengan media MS tanpa kolkisin.
Tunas aksilar yang telah direndam dalam colchicine kemudian dibilas dengan akuades steril untuk menghilangkan sisa-sisa mutagen. Tunas yang sudah dibilas tersebut ditanam dalam botol kultur yang berisi media pertunasan, dengan pH 5,9. Botol-botol kultur tersebut disimpan di ruang kultur dan diinkubasi pada suhu 20 oC dengan intensitas cahaya 1000 lux dan lama penyinaran 16 jam selama 4 minggu. Pada tahap ini planlet yang terbentuk (MV0) dilakukan pengamatan terhadap parameter jumlah daun, tinggi tunas, jumlah tunas dan jumlah akar.
Kemudian planlet yang mengalami mutasi pada masing-masing perlakuan, di subkultur kembali kedalam media perbanyakan tunas. Planlet yang terbentuk (M1V1) akan digunakan untuk perlakuan induksi umbi mikro, analisa karakteristik stomata dan jumlah kloroplas dan uji sitologi untuk melihat perubahan jumlah kromosom yang terbentuk.
Universitas Sumatera Utara
35
5. Karakteristik Stomata dan Jumlah Kloroplas
Sample yang digunakan untuk pengamatan stomata dan kloroplas adalah potongan daun yang cukup dewasa yang diambil dari tiga daun dari tiga planlet.
Preparat daun dibuat dengan cara menempelkan selotip pada bagian permukaan bawah daun sambil ditekan perlahan hingga menempel. Kemudian bagian atas daun dikikis menggunakan scalpel hingga menyisakan bagian epidermis bagian bawah daun tanpa merusak organel. Selotip pada daun yang telah dikikis tadi direkatkan di atas gelas objek lalu diamati di bawah mikroskop cahaya. Parameter yang diamati adalah jumlah stomata per luas amatan, ukuran stomata, dan jumlah kloroplas (Dwiyantono, 2017).
Pendugaan tingkat ploidi dapat dilakukan secara tidak langsung melalui pengamatan kuantitatif pada karakteristik sel seperti pengukuran ukuran stomata yaitu dengan melihat ukuran sel penjaga pada stomata, jumlah stomata per satuan area daun dan jumlah kloroplas yang merupakan variabel yang digunakan sebagai indikator penambahan ploidi (Sybenga, 1992).
6. Induksi Umbi Mikro
Eksplan yang digunakan adalah planlet hasil dari subkultur pada tahap perbanyakan tunas setelah perlakuan perendaman colchicine yang berumur 6 minggu. Botol kultur yang berisi planlet berumur 6 minggu tadi ditambahkan media pengumbian sebanyak 25 ml. Setelah itu botol kultur yang berisi planlet diinkubasi dalam kotak tertutup yang dilapisi kain hitam (kondisi gelap) yang diletakkan di rumah kassa (simulasi suhu tinggi di dataran rendah) selama 40 hari untuk pembentukan umbi mikro. Hal yang sama dilakukan oleh Suharjo et al.
(2017) eksplan kentang diinkubasi pada kondisi gelap total, dimana efek gelap
Universitas Sumatera Utara
total diciptakan dengan menempatkan botol kultur di dalam kardus yang dibungkus rapat dengan kain hitam.
Efisiensi mikrotuberisasi meningkat ketika tanaman sumber yang diperbanyak ditanam di bawah hari yang panjang (16/8 siang/malam) dibandingkan dengan hari pendek (8/16 siang/malam), dan selanjutnya dibandingkan dengan induksi umbi mikro dibawah kondisi gelap terus menerus (Seabrook et al., 1993). Menurut Slimmon et al. (1989) perubahan baik dari hari panjang atau hari pendek (Dobranszki dan Mandi, 1993) hingga kondisi gelap terus menerus mempercepat induksi umbi mikro di beberapa kultivar.
Suhu rumah kassa diukur dengan menggunakan thermometer digital untuk mengetahui suhu maksimum dan minimumnya. Setelah umbi mikro terbentuk, jumlah umbi dihitung (total umbi per botol). Diameter umbi diukur dan bobot umbi ditimbang.
3.5 Pengamatan Parameter 3.5.1. Jumlah daun (helai)
Pengamatan dilakukan pada minggu pertama sampai dengan minggu ke empat setelah perlakuan terhadap daun yang telah terbuka sempurna. Perhitungan jumlah daun dilakukan diluar botol kultur.
3.5.2. Tinggi tunas
Pengamatan dilakukan pada minggu pertama sampai dengan minggu ke empat setelah perlakuan terhadap pertumbuhan tinggi tunas. Pengamatan dilakukan di luar botol kultur dengan penggaris. Pengukuran dimulai dari permukaan media hingga titik tumbuh daun tertinggi.
Universitas Sumatera Utara
37
3.5.3. Jumlah tunas
Pengamatan dilakukan pada minggu pertama sampai dengan minggu ke empat setelah perlakuan dengan menghitung banyaknya tunas baru yang terbentuk dari setiap eksplan. Perhitungan jumlah tunas dilakukan diluar botol kultur terhadap tunas yang tumbuh sempurna (memiliki daun dan batang) pada 1 eksplan.
3.5.4. Jumlah Akar
Pengamatan dilakukan pada minggu pertama sampai dengan minggu ke empat setelah perlakuan terhadap akar yang muncul pada pangkal tunas dan akar yang tumbuh pada buku tunas. Perhitungan jumlah akar dilakukan diluar botol kultur pada akar yang tumbuh di bawah media dan pada buku tunas.
3.5.5. Jumlah Umbi, Bobot Umbi dan Diameter Umbi
Jumlah umbi mikro yang terbentuk dihitung setiap pengamatan percobaan.
Bobot umbi dihitung dengan menimbang bobot dari umbi per tanaman dengan menggunakan timbangan analitik pada akhir pengamatan (pada saat panen).
Diameter umbi dihitung dengan cara pengukuran dengan jangka sorong pada akhir pengamatan (pada saat panen).
3.5.6. Kerapatan Stomata, Ukuran Stomata, dan Jumlah Kloroplas
Pengamatan stomata dan kloroplas dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya. Pengamatan jumlah stomata dilakukan dengan menghitung jumlah stomata pada bidang pandang mikroskop dengan pembesaran 40×10.
Jumlah sampel yang digunakan pada pengamatan jumlah stomata yaitu 3 bidang pandang pada 1 sampel daun untuk setiap ulangan. Pengukuran ukuran stomata dilakukan pada 3 stomata pada setiap sampel daun. Penghitungan jumlah
Universitas Sumatera Utara
kloroplas pada sel penjaga dilakukan pada foto yang dihasilkan dari dokumentasi pengamatan stomata melalui mikroskop, foto yang diperoleh lalu diperbesar dan diperjelas dengan menggunakan perangkat lunak Microsoft Office Picture Manager dan Photofiltre untuk dihitung jumlah kloroplasnya (Dwiyantono, 2017).
Penghitungan kerapatan stomata dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut (Suhaimi, 2017) :
Kerapatan Stomata (sel/mm2) = ∑ 𝑠𝑡𝑜𝑚𝑎𝑡𝑎 𝑦𝑎𝑛g 𝑑i𝑎𝑚𝑎𝑡i
𝐿𝑢𝑎𝑠 𝐵i𝑑𝑎𝑛g 𝑃𝑎𝑛𝑑𝑎𝑛g mm2
Keterangan :
Luas bidang pandang perbesaran 400x = ¼ π d2
= ¼ x 3,14 x (0,45)2
= 0,159 mm2 3.5.7. Analisa Kromosom
Jumlah kromosom dihitung dengan menggunakan metode squashing.
Bahan tanaman yang digunakan adalah ujung akar berukuran ± 1 cm. Untuk mendapatkan tahap mitosis yang tepat pengambilan preparat dilakukan berulang kali dengan selang waktu pengambilan preparat setiap 1 jam sekali. Setelah tahap metafase terdeteksi, semua sample di analisis pada waktu yang sama dan diambil secara acak.
Ujung akar tanaman yang dipotong ± 1 cm, kemudian di cuci dengan air untuk menghilangkan kotorannya. Potongan tersebut kemudian dimasukkan kedalam botol berisi hidroksiquinolin 0,002 M (0,32 g/l aquades) dan disimpan pada suhu 20oC selama 3-5 jam. Potongan ujung akar yang telah direndam dengan hidroksiquinolin kemudian di masukkan kedalam air bersih dan dibuang tudung
Universitas Sumatera Utara
39
akarnya. Potongan ujung akar tersebut kemudian dimasukkan kedalam larutan asam asetat 45% selama 10 menit, selanjutnya dimasukkan kedalam larutan yang berisi 1 N HCl dan asam asetat 45% dengan perbandingan 3:1 (v/v) pada suhu 80oC selama 3-5 menit. Potongan ujung akar tadi kemudian dimasukkan kedalam botol vial yang berisi pewarna orsein 2% sampai terendam yang disimpan selama 5 jam dan selanjutnya dipindahkan ke gelas preparat yang telah ditetesi orsein 2%.
Ujung akar tersebut di potong menjadi ukuran 1-2 mm dari ujung akar dan sisanya dibuang, gelas penutup kemudian dipasang, ditekan perlahan dengan pangkal pensil berkaret dan di panaskan sebentar. Selanjutnya gelas penutup ditekan dengan jempol dan pinggirnya direkat dengan cat kuku tak berwarna dan siap diamati di bawah mikroskop.
Penghitungan jumlah kromosom dilakukan setelah terlihat penyebaran kromosom, kemudian dibuat dokumentasinya. Foto kemudian diperbesar dengan menggunakan Adobe Photo Shop dan dihitung kembali jumlah kromosomnya (Rodiansah, 2007).
Universitas Sumatera Utara
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
Pengamatan terhadap sifat vegetatif tanaman kentang olimpus (MV0) dilakukan 4 kali selama 4 minggu setelah perlakuan. Pengamatan parameter dihitung dan diukur dari luar botol kultur dengan memberi tanda (penomoran) di bawah botol kultur untuk setiap planlet yang diamati agar tidak tertukar untuk
Pengamatan terhadap sifat vegetatif tanaman kentang olimpus (MV0) dilakukan 4 kali selama 4 minggu setelah perlakuan. Pengamatan parameter dihitung dan diukur dari luar botol kultur dengan memberi tanda (penomoran) di bawah botol kultur untuk setiap planlet yang diamati agar tidak tertukar untuk