BAB III. BAHAN DAN METODE
3.4 Pelaksanaan Penelitian
Dalam pelaksanaan penelitian ini dilakukan beberapa tahapan. Adapun tahapan-tahapan kegiatan yang akan dilaksanakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :
1. Sterilisasi dan Pembuatan Media
Peralatan yang digunakan seperti pinset, gunting, scalpel, pisau, botol kultur, cawan petri dan botol kultur berisi aquadest disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121oC, tekanan 17,5 psi selama 60 menit.
Media kultur yang digunakan adalah media dasar MS. Media tanam untuk perbanyakan tunas dari komposisi media MS dibuat dengan cara memipet larutan stok sesuai dengan konsentrasi yang dibutuhkan untuk membuat 1L media kedalam beaker gelas yang kemudian dimasukkan kedalam labu ukur. Gula sebanyak 30 gr/l dilarutkan dengan aquadest terlebih dahulu kemudian di masukkan kedalam labu ukur yang telah berisi larutan stock. Kemudian larutan media tadi ditambahkan CaP 1 mg/l dan aquadest sampai tanda tera pada labu ukur (satu liter). CaP digunakan sebagai hara tambahan yang mempunyai kemampuan untuk mencegah kerusakan sel dengan mencegah oksidasi pada sel.
Dwiyantono (2017) menggunakan CaP 4 ml/l sebagai hara tambahan untuk induksi mutasi dengan colchicine pada kentang kultivar Granola. Rai et al. (2015) juga menggunakan CaP sebagai hara tambahan pada kentang kultivar granola untuk optimasi produksi bibit dengan teknik fotoautotrofik.
Universitas Sumatera Utara
31
Kemasaman media (pH) diatur dan diukur agar sesuai dengan kondisi tumbuh eksplan. pH media yang digunakan dalam penelitian ini adalah 5,9, didapat dengan penambahan HCL 1 N jika pH larutan di atas 5,9 dan KOH 1 N bila pH larutan di bawah 5,9. Setelah pH diatur, larutan media dituang ke dalam panci dan ditambahkan agar-agar sebanyak 6,5 gr/l. Larutan media dipanaskan sambil diaduk untuk melarutkan agar-agar hingga mendidih. Selanjutnya media yang sudah mendidih di tuang kedalam botol kultur sebanyak 25 ml per botol (volume botol 330 ml), kemudian ditutup dengan plastik transparan tahan panas dan diikat dengan karet gelang. Media disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 17,5 Psi selama 20 menit. Media kemudian disimpan pada ruang kultur pada suhu 20oC dan diinkubasi selama 7 hari sebelum penggunaan. Hal ini bertujuan untuk menghindari jika terdapat kontaminasi pada media yang akan digunakan.
Media untuk induksi umbi mikro juga dibuat menggunakan media dasar MS. Penggunaan media dasar MS banyak digunakan untuk induksi umbi mikro (Kanwal et al., 2006). Pada media induksi umbi mikro, penambahan gula dilakukan dalam jumlah yang lebih besar yaitu 120 gr/l dan penambahan BAP sebanyak 5 mg/l. Menurut Saha et al. (2013) pembentukan umbi mikro juga dipengaruhi oleh kandungan gula dalam media, dimana pembentukan umbi mikro meningkat dengan penambahan konsentrasi gula. Pada media induksi umbi mikro ini tidak menggunakan agar-agar sebagai pemadat, jadi media yang digunakan dalam bentuk cair. Setelah semua komposisi media di campur kedalam labu ukur, kemudian ditambahkan aquadest sampai batas tera (satu liter). Kemasaman media (pH) dikur pada nilai 5,9, setelah itu larutan media di tuang kedalam botol kultur
Universitas Sumatera Utara
sebanyak 25 ml per botol dan botol ditutup dengan plastik transparan tahan panas serta diikat dengan karet gelang. Kemudian media di sterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 17.5 psi selama 20 menit.
2. Sub Kultur Planlet
Planlet di sub kultur ke dalam media perbanyakan tunas dengan cara tunas aksilar dipotong-potong pada masing-masing buku dengan ukuran ± 5 mm. Semua peralatan yang digunakan untuk penanaman disemprot dengan alcohol 70%
sebelum dimasukkan kedalam laminar air flow cabinet. Kemudian eksplan di tanam kedalam botol kultur, dimana setiap botol kultur berisi 5 eksplan. Kultur diinkubasi pada ruangan dengan suhu 20oC, intensitas cahaya lampu ± 1000 lux dengan lama penyinaran 16 jam per hari. Pada umur 4 minggu setelah tanam (MST), planlet yang dihasilkan dijadikan sebagai sumber eksplan untuk perlakuan.
3. Pembuatan Larutan Colchicine
Pembuatan larutan Kolkisin dilakukan dalam Laminar Air Flow Cabinet dengan membuat larutan stok konsentrasi 5000 ppm yaitu 250 mg kolkisin dalam 50 ml aquadest steril. Pembuatan larutan stock bertujuan untuk mempermudah pengaturan konsentrasi pada media perendaman dengan metode pengenceran.
Pada saat botol berisi kolkisin dibuka, blower dimatikan sejenak agar serbuk kolkisin tidak berterbangan, serbuk kolkisin ditimbang kemudian dimasukkan kedalam aquadest steril dalam labu erlenmeyer. Botol berisi kolkisin ditutup dan blower dinyalakan kembali, Kemudian larutan kolkisin dikocok hingga larut.
Larutan stock kolkisin disterilkan dengan menggunakan microfilter. Larutan stock
Universitas Sumatera Utara
33
kolkisin kemudian dipindahkan kedalam labu Erlenmeyer tertutup dan disimpan pada refrigerator suhu 4oC.
Larutan perlakuan kolkisin dibuat dengan menggunakan teknik pengenceran. Larutan perlakuan dengan konsentrasi 0,02% sebanyak 25 ml dibuat dengan memipet larutan stok kolkisin sebanyak 1 ml dan kemudian dimasukkan kedalam botol kultur yang berisi 24 ml media perbanyakan tanpa menggunakan agar (media cair). Larutan dikocok hingga larut sempurna. Pembuatan larutan perlakuan konsentrasi 0,04% sebanyak 25 ml dilakukan dengan memipet larutan stock kolkisin sebanyak 2 ml, kemudian dimasukkan kedalam botol kultur yang berisi 23 ml media cair. Larutan perlakuan kolkisin 0,06% sebanyak 25 ml dibuat dengan memipet larutan stok kolkisin sebanyak 3 ml dan kemudian dimasukkan kedalam botol kultur yang berisi 22 ml media cair. Pembuatan larutan perlakuan 0,08% sebanyak 25 ml dilakukan dengan memipet larutan stok kolkisin sebanyak 4 ml, kemudian dimasukkan kedalam botol kultur yang berisi 21 ml media cair.
Pencampuran media cair dengan larutan stock kolkisin dilakukan di dalam laminar. Perlakuan kontrol dibuat dengan menggunakan media cair sebanyak 25 ml. Derajat kemasaman (pH) media cair diatur menjadi 5.9, kemudian botol kultur ditutup dengan plastik transparan tahan panas dan dilakukan sterilisasi dengan autoclave pada suhu 121 oC, tekanan 17.5 psi selama 20 menit.
4. Perlakuan Perendaman Larutan colchicine dan Penanaman Eksplan
Planlet yang sudah disubkultur selama 4 MST, dipotong-potong berdasarkan 1 buku tunas dengan ukuran ± 5 mm. Bagian buku yang mengandung tunas aksilar dipisahkan pada cawan petri, setelah jumlah tunas aksilar cukup
Universitas Sumatera Utara
untuk dijadikan eksplan pada perlakuan kemudian dimasukkan ke dalam larutan perendaman kolkisin sesuai konsentrasi pada perlakuan.
Sebanyak 375 tunas aksilar kentang direndam dengan larutan colchicine yang terdiri dari 15 kombinasi perlakuan yaitu lama perendaman dengan konsentrasi colchicine dan kontrol. Sebelum direndam dalam larutan colchicine, semua tunas aksilar kentang disterilisasi dengan akuades selama 5 menit. Tunas aksilar yang telah steril kemudian dimasukkan kedalam botol kultur yang berisi larutan colchicine dengan konsentrasi masing-masing 0,02% (K1), 0,04% (K2), 0,06% (K3) dan 0,08% (K4) sesuai dengan lama perendaman masing-masing yaitu 12 jam (P1), 24 jam (P2) dan 48 jam (P3), sedangkan kontrol direndam dengan media MS tanpa kolkisin.
Tunas aksilar yang telah direndam dalam colchicine kemudian dibilas dengan akuades steril untuk menghilangkan sisa-sisa mutagen. Tunas yang sudah dibilas tersebut ditanam dalam botol kultur yang berisi media pertunasan, dengan pH 5,9. Botol-botol kultur tersebut disimpan di ruang kultur dan diinkubasi pada suhu 20 oC dengan intensitas cahaya 1000 lux dan lama penyinaran 16 jam selama 4 minggu. Pada tahap ini planlet yang terbentuk (MV0) dilakukan pengamatan terhadap parameter jumlah daun, tinggi tunas, jumlah tunas dan jumlah akar.
Kemudian planlet yang mengalami mutasi pada masing-masing perlakuan, di subkultur kembali kedalam media perbanyakan tunas. Planlet yang terbentuk (M1V1) akan digunakan untuk perlakuan induksi umbi mikro, analisa karakteristik stomata dan jumlah kloroplas dan uji sitologi untuk melihat perubahan jumlah kromosom yang terbentuk.
Universitas Sumatera Utara
35
5. Karakteristik Stomata dan Jumlah Kloroplas
Sample yang digunakan untuk pengamatan stomata dan kloroplas adalah potongan daun yang cukup dewasa yang diambil dari tiga daun dari tiga planlet.
Preparat daun dibuat dengan cara menempelkan selotip pada bagian permukaan bawah daun sambil ditekan perlahan hingga menempel. Kemudian bagian atas daun dikikis menggunakan scalpel hingga menyisakan bagian epidermis bagian bawah daun tanpa merusak organel. Selotip pada daun yang telah dikikis tadi direkatkan di atas gelas objek lalu diamati di bawah mikroskop cahaya. Parameter yang diamati adalah jumlah stomata per luas amatan, ukuran stomata, dan jumlah kloroplas (Dwiyantono, 2017).
Pendugaan tingkat ploidi dapat dilakukan secara tidak langsung melalui pengamatan kuantitatif pada karakteristik sel seperti pengukuran ukuran stomata yaitu dengan melihat ukuran sel penjaga pada stomata, jumlah stomata per satuan area daun dan jumlah kloroplas yang merupakan variabel yang digunakan sebagai indikator penambahan ploidi (Sybenga, 1992).
6. Induksi Umbi Mikro
Eksplan yang digunakan adalah planlet hasil dari subkultur pada tahap perbanyakan tunas setelah perlakuan perendaman colchicine yang berumur 6 minggu. Botol kultur yang berisi planlet berumur 6 minggu tadi ditambahkan media pengumbian sebanyak 25 ml. Setelah itu botol kultur yang berisi planlet diinkubasi dalam kotak tertutup yang dilapisi kain hitam (kondisi gelap) yang diletakkan di rumah kassa (simulasi suhu tinggi di dataran rendah) selama 40 hari untuk pembentukan umbi mikro. Hal yang sama dilakukan oleh Suharjo et al.
(2017) eksplan kentang diinkubasi pada kondisi gelap total, dimana efek gelap
Universitas Sumatera Utara
total diciptakan dengan menempatkan botol kultur di dalam kardus yang dibungkus rapat dengan kain hitam.
Efisiensi mikrotuberisasi meningkat ketika tanaman sumber yang diperbanyak ditanam di bawah hari yang panjang (16/8 siang/malam) dibandingkan dengan hari pendek (8/16 siang/malam), dan selanjutnya dibandingkan dengan induksi umbi mikro dibawah kondisi gelap terus menerus (Seabrook et al., 1993). Menurut Slimmon et al. (1989) perubahan baik dari hari panjang atau hari pendek (Dobranszki dan Mandi, 1993) hingga kondisi gelap terus menerus mempercepat induksi umbi mikro di beberapa kultivar.
Suhu rumah kassa diukur dengan menggunakan thermometer digital untuk mengetahui suhu maksimum dan minimumnya. Setelah umbi mikro terbentuk, jumlah umbi dihitung (total umbi per botol). Diameter umbi diukur dan bobot umbi ditimbang.
3.5 Pengamatan Parameter