UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO
III. CARA KERJA
A. Menggunakan Spektrofotometer
Ambil 1 ml suspensi bakteri dan pindahkan ke dalam kuvet plastik ↓
Diencerkan bila perlu untuk mendapatkan OD 600 kurang dari 1 ↓
Sampel dimasukkan kedalam kuvet ↓
Sampel diukur OD 600 ↓
Dihitung densitas dari sel dengan menggunakan table B. Berdasarkan Total Plate Count
Ambil 1 ml sampel ↓
1 ml sampel ditambah dengan 9 ml aquadest (tabung 1) ↓
1 ml suspense tabung 1 ditambah 9 ml aquadest (tabung 2) ↓
1 ml suspense tabung 2 ditambah 9 ml aquadest (tabung 3) dan seterusnya sampai pengenceran 10‾
Medium agar dipanaskan (diambil 10 ml) ↓
Campuran medium ditambahkan dengan suspense pengenceran dalam cawan petri ↓
Digoyangkan dengan arah angka 8 secara hati-hati ↓
Dibungkus dengan kertas lalu diinkubasi selama 24 jam ↓
Didinginkan dan dihitung koloni yang tumbuh pada masing-masing cawan petri
IV. HASIL
Berdasarkan Toyal Plate Count
Pengenceran 10-5 (rep 1) Pengenceran 10-5 (rep 2)
A. Hasil Perhitungan A = 236 + 271 = 236 x 104 + 271 x 104 10-4 10-4 2 = 507 x 104 2
= 253,5 x 10
4 B = 165 + 140 = 165 x 105 + 140 x 105 10-5 10-5 2 = 305 x 1052
= 152,5 x 10
5 B = 152,5 x 105 A 253,5 x 10-4 = 1525 x 104 253,5 x 104 Ket : B >2 = A AAir sumur
Pengenceran
Jumlahkolonipadatiapcawan
Replikasi 1
Replikasi 2
10
-410
-5236
165
271
140
= 6,01 CFU (coloning forming unit) B <atau 2 = rata - rata A
Jumlahbakteri = 253,5x 10
4=
2535000 sel/ml
V. PEMBAHASAN
Praktikum kali ini berjudul ” Perhitungan Jumlah Mikroba “, yang bertujuan agar setelah dilakukannya praktikum mahasiswa diharapkan dapat mengetahui cara – cara perhitungan jumlah mikroba, baik secara langsung maupun secara tidak langsung, serta dapat melakukan perhitungan jumlah mikroba yang ada pada suatu bahan.
Bermacam – macam cara dapat dilakukan untuk menentukan jumlah mikroba tergantung dari bahan dan jenis mikroba yang akan ditentukan. Secara umum perhitungan jumlah mikroba dibagi menjadi dua yaitu yang pertama perhitungan jumlah mikroba secara lngsung ( direct method ) yang digunakan untuk menentukan jumlah mikroba / atau mikroba keseluruhan, baik yang hidup maupun yang mati, ada beberapa cara yang terdapat dalam perhitungan jumlah mikroba secara langsung antara lain menggunakan counting camber dengan menggunakan alat haemocytometer,Petroff – Hausser Bacteria Counteratau alat- alat lain yang sejenis. Dan menggunakan filter membran yang dilakukan dengan cara menyaring mikrobanya menggunakan filter membran steril. Dan yang kedua adalahperhitungan jumlah mikroba secara tidak langsung (indirect method ) yang digunakan untuk menentukan jumlah mikroba secara keseluruhan baik yang hidup maupun yang sudah mati, atau hanya menentukan jumlah mikroba yang masih hidup saja hal tersebut tergantung pada cara yang digunakan antara lain berdasarkan kekeruahan, berdasarkan analisa kimia, berdasarkan berat kering, menggunakan cara pengenceran, menggunakan Most Probably Number ( MPN), atau berdasarkan jumlah koloni.
Tetapi metode yang dilakukan pda saat praktikum adalah perhitungan jumlah mikroba secara tidak langsung (indirect method ) yang dilakukan dengan cara berdasarkan kekeruhan dan berdasarkan jumlah koloni ( plate count ).
Syarat – syarat yang harus dipenuhi pada saat perhitungan antara lain jumlah koloni dalam tiap cawan petri antara 30-300 koloni, jika memang tidak ada yang memenuhi syarat dipilih yang jumlahnya mendekati 300, tidak ada spreader (koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas cawan petri), perbandingan jumlah bakteri dari hasil pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran sebelumnya, jika sama atau lebih kecil dari 2 hasilnya dirata-rata, tetapi bila lebih besar dari 2 yang dipakai adalah jumlah mikroba dari hasil pengenceran sebelumnya, serta jika dengan ulangan, setelah memenuhi syarat hasilnya dirata-rata.
Alat yang digunakan dalam praktikum kali ini antara lain kuvet plastik, pipet steril, spektrofotometer, cawan petri, kapas steri,l gelas ukur, dan tabung reaksi. Sementara bahan - bahan yang digunakan adalah kultur suspensi bakteri E. coli dala media NB umur 18 – 24 jam, media NB tanpa bakteri sebagai blanko, sampel bahan yaitu air sumur yang akn ditentukan jumlah bakterinya, medium nutrien agar tegak, medium tripton glukosa yeast agar tegak, dan akuadest steril.
Langkah kerja yang pertama yaitu kita membersihkan meja yang akan digunakan dalam praktikum dengan menggunakan alkohol, hal ini merupakan salah satu teknik aseptis yang dilakukan agar segala pekerjaan yang akan kita lakukan dalam keadaan yang steril dan terbebas dari zat yang kontaminan yang tidak diperlukan. Tahap pertama yang akan dilakukan adalah menghitung jumlah mikroba menggunakan spektrofotometer atau optical density 600. Pertama,dengan cara mengambil tabung berisi biakan bakteri kemudian buka tutup kapasnya dan dilakukan dalam keadaan aseptis, lalu ambil 1 ose bakteri dengan menggunakan ose tumpul dan tutup kembali tabung berisi biakan bakteri tersebut. Kemudian ambil tabung berisi NB lalu buka penutup tutup tabungnya dan dilakukan secara aseptis, setelah itu tanam bakteri yang tadi diambil dengan menggunakan ose tumpul tadi dalam medium NB tersebut. Kemudian absorbansikan bakteri tersebut yang dilakukan dengan cara memipetkan 1 ml suspensi bakteri tersebut dan menempatkannya dalam kuvet plastik kemudian diletakkan dalam spektrofotometer UV dengan prinsip kerja berdasarkan kekeruhan dari suspensi bakteri tersebut menggunakan sinar monokromatis pada panjang gelombang 600 nm. Kuvet yang
dindingnya keruh diletakkan disebelah luar, sedangkan bagian yang dindingnya transparan diletakkan menghadap sinar UV, hal ini tidak boleh terbalik, karena pada dinding yang transparan akan lebih mudah menangkap sinar UV tersebut. Dan didapatkan hasil pada kelompok kami yaitu 1,143 abs.
Pada tahap yang kedua yaitu perhitungan jumlah mikroba berdasarkan total plate count yang dilakukan dengan cara mengambil 1 gram sampel pada kelompok kami mendapatkan sampel air sumur, kemudian melarutkannya dalam 9 ml aquadest (tabung 1). Setelah itu 1 ml suspensi tabung 1 ditambahkan dengan 9 ml aquadest (tabung 2 sebagai pengenceran 10-1), kemudian mengambil 1 ml suspensi tabung 2 dan
ditambahkan dengan 9 ml aquadest (tabung 3 sebagai pengeceran 10-2), kemudian
mengambil 1 ml suspensi tabung 3 dan ditambahkan 9 ml aquadest (tabung 4 sebagai pengenceran 10-3), kemudian mengambil 1 ml suspensi tabung 4 dan ditambahkan 9 ml
aquadest (tabung 5 sebagai pengenceran 10-4), kemudian ambil 1 ml suspensi tabung 5
dan ditambahkan 9 ml aquadest (tabung 6 sebagai pengenceran 10-5). Kemudian pada
tabung 5 sebagai pengenceran 10-4 dituangkan ke dalam cawan petri 1 sebagai replikasi 1
dan cawan petri 2 sebagai replikasi 2. Begitu juga dengan tabung 6 sebagai pengenceran 10-5 dituangkan ke dalam cawan petri 1 sebagai replikasi 1 dan cawan petri 2 sebagai
replikasi 2. Semua proses ini dilakukan dengan taknik aseptis yaitu dengan cara dipanaskan di atas nyala api lampu spiritus, setelah sampel-sampel tadi dimasukkan dalam cawan petri segera tutup cawan dengan penutupnya. Kemudia cairkan medium agar dalam penangas air hingga benar – benar mencair sempurna lalu mengambil 10 ml larutan yang tadi telah diencerkan dan dimasukkan dalam ke empat cawan petri berisi sampel tadi kemudian digoyangkan dengan membentuk arah angka 8, hal ini dilakukan dengan tujuan agar campuran medium dengan bakteri tersebut homogen. Lalu diamkan medium tersebut hinggadingin dan memadat, setelah medium padat bungkus masing- masing cawan dengan mengunakan kertas kemudian diberi etiket. Setelah itu inkubasikan medium pada suhu pada suhu 37⁰C selama 24 jam, hal ini dilakukan karena suhu tersebut sama dengan suhu tubuh sehingga memungkinkan bakteri untuk tumbuh karena suhunya yang sesuai atau sama dengan suhu tubuh manusia. Setelah diinkubasikan hitung koloni bakteri yang terbentuk dan untuk mempermudah dalam perhitungan cawan petri dibagi menjadi empat bagian. Tetapi pada kelompok kami tidak ada bakteri yang tumbuh dalam medium yang kami buat hal itu mungkin dikarenakan pada saat penuangan bakteri medium dalam cawan petri masih terlalu panas sehingga bakteri yang dicampurkan mati. Sehingga hanya dilakukan perhitungan dengan data
simulasi yaitu untuk cawan petri replikasi 1 dengan pengenceran 10-4 didapat bakteri
sebanyak 236 dan pada replikasi 2 sebanyak 271 sementara untuk cawan petri replikasi 1 dengan pengenceran 10-5 didapat bakteri sebanyak 165 dan pada replikasi 2 sebanyak
140.
VI. KESIMPULAN
Kesimpulan yang dapat diambil dari praktikum yang telah dilakukan adalah :
1. Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa dapat :
a) Mengetahui cara – cara perhitungan jumlah mikroba, baik secara langsung maupun secara tidak langsung.
b) Melakukan perhitungan jumlah mikroba yang ada pada suatu bahan.
2. Perhitungan jumlah mikroba pada suatu bahan bisa ditentukan dengan bermacam- macam cara tergantung pada bahan dan jenis mikroba yang akan ditentukan.
3. Secara umum metode perhitungan jumlah mikroba dibagi menjadi dua yaitu: a) Perhitungan secara langsung
b) Perhitungan secara tidak langsung
4. Perhitungan secara langsung meliputi: a) Menggunakan counting chamber b) Menggunakan filter membran
5. Perhitungan secara tidak langsung meliputi: a) Menggunakan cara pengenceran
c) Berdasarkan kekeruhan
d) Berdasarkan jumlah koloni (plate count) e) Berdasarkan analisa kimia
f) Menggunakan Most Probably Number
6. Karena bakteri tidak tumbuh pada medium yang kami buat jadi kami menggunakan data simulasi dan di dapat hasil bakteri total sebanyak 2535000 sel/ml
VII. DAFTAR PUSTAKA
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan . Gramedia Pustaka Utama : Jakarta
Michael Pelczar, dkk. 2008. Dasar – Dasar Mikrobiologi, Jakarta : Penerbit Universitas Indonesia.