SKRINING PRIMER UNTUK MENDAPATKAN MIKROBA RESISTEN ANTIBIOTIK

Disusun Oleh:

Nama

: Zitta Afrida

NIM

: 1308010125

Golongan

: II

Kelompok : 3 B

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO

2013

P – 6

SKRINING PRIMER UNTUK MENDAPATKAN MIKROBA RESISTEN ANTIBIOTIK

I.TUJUAN

1. Melakukan berbagai teknik mikrobiologi dalam skrining (menanam, mengisolasi, dan memurnikan biakan, melakukan tes terhadap kemampuan biakan terhadap antibiotik). 2. Mendapatkan mikroorganisme yang resisten terhadap antibiotik.

II. ALAT DAN BAHAN

1. Tahap I A. Alat

1) Cawan petri 2) Tabung reaksi

3) Mikropipet dan yellow tip 4) Glass spreader

B. Bahan

1) Media selektif ( Czapex dox dan antibiotik ) 2) Larutan salin ( NaCL 0,9 % )

3) Sampel tanah 2. Tahap II

A. Alat

1) Cawan petri 2) Ose tumpul

3) Labu erlenmeyer 50 cc untuk wadah mensterilkan media B. Bahan

1) Media pertumbuhan ( Czapex dox )

3. Tahap III A. Alat

1) Cawan petri 2) Jangka sorong

3) Erlenmeyer 50 cc untuk wadah sterilisasi 4) Paper disk

B. Bahan

1) Media nutrien agar

2) Kultur E. coli dan B. Subtilis dalam media nutrien cair berumur 24 jam 3) Antibiotik

III. CARA KERJA

A. Tahap I

Suspensikan 1 gram sampel tanah dengan 10 ml larutan salin dalam tabung steril ↓

Encerkan hingga konsentrasi 10‾5

↓

Tuangkan 0,5 ml suspensi tersebut dalam cawan petri steril yang telah dituangi media selektif padat

↓

Ratakan dengan spreader ↓

Diinkubasikan pada suhu kamar sampai praktikum selanjutnya B. Tahap II

Pilih salah satu koloni yang dominan dan ambil dengan menggunakan ose, tanam dalam media pertumbuhan ( pada praktikum yang dilakukan menggunakan agar

darah ) ↓

Diinkubasikan pada suhu kamar sampai praktikum selanjutnya C. Tahap III

Siapkan dan sterilisasikan 10 ml media dalam erlenmeyer ↓

Setelah agak dingin, dicampurkan dengan suspensi isolate bakteri, dihomogenkan ↓

Tuangkan dalam cawan petri, dan ditunggu sampai membeku ↓

Pasang paper disk di atas permukaan agar ↓

Tetesi dengan 10 µl antibiotik menggunakan mikropipet ↓

Diinkubasi pada suhu 37⁰C selama 18-24 jam ↓

Ukur diameter hambatan untuk masing-masing antibiotik dengan mikroba uji ↓

Hasil diinterpretasikandengan antibiogram

IV. HASIL

B. Tahap II

C. Tahap III

Hasil perhitungan tahap 3

Penicillium = D1 = 7,9 mm D2 = 8 mm D3 = 7,9 mm D4 = 7,9 mm  D = 31,7 4 = 7,925 Diameter total = 7, 925 – 6 = 1, 925

Sampel tanah resisten terhadap antibiotik penicillium karena zona hambat kurang dari 20 mm sehingga resisten.

Vancomicin = D1 = 6,5 mm D2 = 6,6 mm D3 = 6,5 mm D4 = 6,6 mm  D = 26, 2 4 = 6,5 Diameter total = 65 – 5 = 0, 5 mm

Sampel tanah yang terdapat bakteri,bakteri tersebut resisten terhadap vancomycin karena kurang dari 9

Praktikum kali ini berjudul ” Skrining Primer Untuk Mendapatkan Mikroba Resisten Antibiotik “, yang bertujuan agar setelah dilakukannya praktikum mahasiswa diharapkan dapat melakukan berbagai teknik mikrobiologi dalam skrining (menanam, mengisolasi, dan memurnikan biakan, melakukan tes terhadap kemampuan biakan terhadap antibiotik), serta mendapatkan mikroorganisme yang resisten terhadap antibiotik.

Skrining digunakan untuk menemukan mikroorganisme penghasil antibiotik, sampel yang digunakan dapat berasal dari berbagai sumber termasuk tanah dari berbagai tempat diuji kemampuan potensialnya dalam menghasilkan antibiotik. Proses penapisan ini terdiri dari dua tahap yaitu skrining primer dan skrining sekunder.

Tahap skrining primer meliputi : 1) Mencari sumber penghasil

2) Menumbuhkan mikroorganisme yang didapat 3) Mengisolasi dan mengoleksi mikroorganisme 4) Uji kemampuan isolat

Tahap skrining sekunder meliputi :

1) Mendapatkan koloni mikroorganisme terpilih

2) Mencari kondisi optimal untuk pertumbuhan ( temperatur, pH, lama inkubasi, media, dll )

3) Identifikasi mikroorganisme ( secara morfologi, kimiawi, ataupun genetik, media, dll).

4) Identifikasi substansi

Pada praktikum kali ini digunakan skrining primer.

Telah disebutkan bahwa sampel yang popular untuk skrining ini yaitu tanah.Tanah yang dijadikan sampel juga biasanya tanah yang memang belum pernah terjamah seperti dihutan, rawa, lereng gunung, sawah, kebun dan lain sebagainya. Pengambilan tanahnya pun dilakukan reaseptis mungkin karana bertujuan supaya kita mendapatkan tanah yang masih murni dalam arti tidak terkontaminasi dengan bakteri yang telah menempel pada tangan kita. Selain itu, tanah diambil didalam kedalaman tanah tersebut kita akan dapatkan tanah yang murni dan tidak terkontaminasi seperti pada bagian permukaan tanah. Tanah juga memiliki unsur-unsur hara yang terkandung didalamnya, selain itu pula terdapat bakteri-bakteri seperti jenis bakteri streptomyces yang termasuk golongan atau anggota dari autinomycetes. Autinomycetes ini merupakan kelompok bakteri yang mempu manghasilkan antibiotik. Tanah merupakan sumber yang kaya akan mikroba. Banyak mikroba yang diisolasi dari tanah yang ternyata telah resisten terhadap antibiotik. Isolasi bakteri resisten antibiotik dilakukan sebagai upaya untuk menyediakan bakteri

resisten untuk keperluan penemuan mekanisme resistensi sehingga dapat ditelusuri mekanisme pencegahan dan penanggulangan resisten. Jika obat digunakan dengan dosis yang terlalu rendah, atau waktu terapi kurang lama, maka hal ini dapat menyebabkan terjadinya resistensi artinya bakteri tidak peka lagi terhadap obat yang bersangkutan

Alat - alat yang digunakan pada praktikum ini antara lain cawan petri yang digunakan untuk tempat media, tabung reaksi yang digunakan untuk tempat mencampurkan bakteri dan bahan yang lain, mikropipet dan yellow tip yang digunakan untuk membantu meneteskan suspense antibiotik ke dalam paper disk, ose tumpul yang digunakan untuk mengambil koloni pada hasil praktikum mikroskopik kapang, labu erlenmeyer yang digunakan untuk wadah mensterilkan media, jangka sorong yang digunakan untuk mengukur diameter daerah hambatan yang terbentuk du sekitar paper disk. Sementara bahan – bahan yang digunakan antara lain media selektif ( Czapec dox dan antibiotik ), larutan salin ( NaCL 0,9 % ), sampel tanah, medium nutrien agar, kultur E. coli dan B. subtilis dalam media nutrien cair berumur 24 jam, serta antibiotik.

Pada praktikum kali ini dilakukan 3 tahap, pertama dilakukan tahap pertama yang dilakukan dengan cara pertama mensuspensikan 1 gram sampel yang diambil dari tanah dengan kedalaman 30 cm dari permukaan dengan 10 ml larutan salin dalam tabung steril (larutan A), kemudian ambil 1 ml larutan A dan tambahkan dengan 9 ml aquadest (replikasi 1), ambil 1 ml larutan replikasi 1 dan tambahkan dengan 9 ml aquadest (replikasi 2), tuangkan ke dalam dua cawan petri masing-masing sama rata, tambahkan 10 µl antibotik ( penicilin ) dan medium selektif Czapec dox ke dalam masing-masing cawan petri tersebut, kemudian ratakan dengan cara menggojognya dengan arah membentuk angka delapan hingga homogen, bungkus cawan petri tersebut dengan menggunakan kertas dan inkubasi pada suhu kamar selama 1 minggu, inkubasi tidak dilakukan pada suhu 37⁰C melainkan pada suhu kamar hal ini dilakukan dengan tujuan untuk menghambat pertumbuhan dari bakteri dalam sampel tanah tersebut.

Tahap yang kedua dilakukan dengan cara pertama mengambil 1 koloni yang dominan dengan menggunakan ose kemudian ditanam dalam media pertumbuhan Czapec dox ( tapi pada praktikum yang kami lakukan menggunakan medium agar darah ), setelah agak dingin tuangkan dalam cawan petri steril dan digojog dengan arah membentukangka delapan untuk menghomogenkan keduanya. Setelah itu diinkubasi pada suhu kamar selama 1 minggu, inkubasi tidak dilakukan pada suhu 37⁰C melainkan pada suhu kamar hal ini dilakukan dengan tujuan untuk menghambat pertumbuhan dari kapang Rhizopus. sp.

Pada tahap kedua digunakan medium nutrien agar darah yang berfungsi untuk membedakan bakteri berdasarkan sifatnya bisa atau tidaknya bakteri tersebut menghemolisis darah, membunuh bakteri heterotrof, serta menumbuhkan bakteri Neiserria dan Streptococcus. Yang dapat dibagi menjadi tiga golongan yaitu :

1. Alpha hemolisis, bakteri yang tergolong Alpha hemolitik adalah bakteri yang memiliki kemampuan parsial menghemolisis media agar darah dan mengekspresikan zona kehijauan di sekitar koloni. Contoh bakterinya adalah S. salivarius, S. constellatus dan lain- lain.

2. Beta hemolisis, bakteri beta hemolitik adalah bakteri yang mengekspresikan zona bening di sekitar koloni. Beta hemolisis juga merupakan lisis lengkap sel darah merah dan hemoglobin, darah secara lengkap digunakan oleh mikroba sehingga media yang ada koloninya menjadi tidak berwarna. Contoh bakterinya adalah S. agalactiae, Streptococcus parauberis dan lain- lain.

3. Gamma hemolisis ( non hemolitik ), adalah bakteri yang tidak mampu melisis darah pada media agar, bakteri non hemolitik lebih bersifat virulen dibandingkan beta hemolitik, dan pada gamma hemolisis tidak terjadi perubahan warna pada medium darhnya dan tetap berwarna merah. Contohnya Enterococcus, E. faecalls, dan E. faecium.

Tahap terakhir yang dilakukan adalah tahap tiga dan dilakukan dengan cara menyiapkan dan mensterilkan 10 ml media dalam erlenmeyer, kemudian setelah agak dingin campurkan dengan suspensi isolat bakteri dan homogenkan. Setelah itu tuangkan dalam cawan petri tunggu hingga dingin dan membeku. Setelah itu pasang paper disk ( dipasangi dua paper disk penicillin dan vancomycin ), kemudian diinkubasikan pada suhu 370 _{C selama 18 – 24 jam, setelah diinkubasikan ukur diameter hambatannya}

menggunakan jangka sorong untuk masing – masing antibiotik dengan mikroba uji dan kemudian interpretasikan hasil dengan antibiogram.

VI. KESIMPULAN

Kesimpulan yang dapat diambil dari praktikum yang telah dilakukan adalah :

1. Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat :

a) Mengetahui cara – cara perhitungan jumlah mikroba, baik secara langsung maupun secara tidak langsung.

b) Melakukan perhitungan jumlah mikroba yang ada pada suatu bahan.

2. Antibiotik merupakan substansi yang dalam jumlah kecil dapat menghambat pertumbuhan atau membunuh mikroba.

3. Isolasi bakteri resisten antibiotik dilakukan sebagai upaya untuk menyediakan bakteri resisten untuk keperluan penemuan mekanisme resistensi sehingga dapat ditelusuri mekanisme pencegahan dan penanggulangan resisten.

4. Sampel yang digunakan yaitu sampel tanah yang tidak terjamah oleh manusia, misal dari hutan, pinggir sungai, daratan rendah dan sebagainya yang diambil pada kedalaman ± 30 cm dari permukaan tanah guna untuk mengurangi kontaminasi serta diambil seaseptis mungkin.

5. Pada tahap dua medium yang digunakan adalah medium nutrien agar darah dan tidak didapatkan bakteri yang menghemolisis darah.

6. Pada paper diks penicillium didapat diameter total zona hambat sebesar 1, 925 mm yang menunjukan bahwa sampel tanah resisten terhadap antibiotik penicillium karena zona hambat kurang dari 20 mm sehingga resisten. Sementara pada paper disk vancomycin didapat diameter total zona hambat sebesar 0, 5 mm yang menunjukan bahwa sampel tanah yang terdapat bakteri,bakteri tersebut resisten terhadap vancomycin karena kurang dari 9.

VII. DAFTAR PUSTAKA

Agus Syahrurachman, dkk. 1993 Buku Ajar Mikroboilogi Kedokteran. Jakarta : Binarupa Aksara.

Michael Pelczar, dkk. 2008. Dasar – Dasar Mikrobiologi, Jakarta : Penerbit Universitas Indonesia.