PENGECATAN DAN MORFOLOGI MIKROBA
PENGECATAN DAN IDENTIFIKASI MIKROBA
I.TUJUAN
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat : 1. Mengetahui tujuan dari pengecatan
2. Melakukan pengecatan terhadap mikroba
II. ALAT DAN BAHAN
1. Pengecatan Sederhana A. Alat 1) Objek gelas 2) Lampu spiritus 3) Ose B. Bahan
1) Biakan murni B. subtilis dalam medium nutrien cair berumur 24 jam 2) Biakan murni Escherichia coli dalam medium nutrien cair berumur 24 jam 3) Larutan cat safranin atau cryistal violet
2. Pengecatan Gram A. Alat 1) Objek gelas 2) Lampu spiritus 3) Ose B. Bahan
1) Biakan murni Bacillus subtilis dalam medium nutrien cair berumur 24 jam.
2) Biakan murni Escherichia coli dalam medium nutrien cair berumur 24 jam.
3) Larutan cat Kristal violet (gram A). 4) Larutan lugol iodine (gram B).
5) Larutan alcohol atau aseton (gram C). 6) Larutan cat safranin (gram D).
III. CARA KERJA
A. Pengecatan Sederhana
Bersihkan gelas objek dengan alcohol sampai bebas lemak, kemudian dipanggang sebentar dalam lampu spiritus
↓
Ambil secara aseptic 1 ose suspensi biakan Bacillus subtilis dan diratakan di atas permukaan gelas objek kira-kira 1 cm
↓
Keringanginkan preparat kemudian difiksasi dengan cara melewatkannya di atas nyala lampu spiritus
↓
Didinginkan kemudian teteskan cat safranin atau kristal violet secukupnya dan dibiarkan 1-2 menit
↓
Cuci dengan air mengalir sampai sisa cat habis kemudian dikeringanginkan ↓
Amati dengan mikroskop dengan perbesaran kuat dan gambar morfologi selnya B. Pengecatan Gram
Bersihkan gelas objek dengan alcohol sampai bebas lemak, kemudian dipanggang sebentar dalam lampu spiritus
↓
Ambil secara aseptic 1 ose suspensi biakan Bacillus subtilis dan diratakan di atas permukaan gelas objek kira-kira 1 cm
↓
Keringanginkan preparat kemudian difiksasi dengan cara melewatkannya di atas nyala lampu spiritus
↓
Didinginkan kemudian ditetesi cat gram A sebanyak 2-3 tetes dan diamkan selama 1 menit
↓
Cuci dengan air mengalir, kemudian dikeringanginkan ↓
Teteskan cat Gram B, biarkan selama 1 menit, cuci dengan air mengalir dan keringkan
Cuci dengan larutan peluntur ( Gram C ) selama 30 deti, kemudian cuci dengan air mengalir dan keringkan
↓
Beri larutan cat penutup (gram D) selama 1 menit, cuci dengan air mengalir, dan keringanginkan
↓
Amati dengan mikroskop dengan minyak emersi kemudian gambar preparat yang diamati IV. HASIL A. Pengecatan Sederhana Escherichia coli Bacillus subtilis B. Pengecatan Gram
Escherichia coli Bacillus subtilis
V. PEMBAHASAN
Praktikum kali ini berjudul ” Pengecatan dan Identifikasi Mikroba “, yang bertujuan agar setelah dilakukannya praktikum mahasiswa diharapkan dapat mengetahui tujuan dari pengecatan, serta melakukan pengecatan terhadap mikroba.
Pengecatan atau pewarnaan merupakan salah satu cara yang digunakan untuk mengamati sel-sel bakteri. Tujuan dari pengecatan adalah untuk mempermudah melihat
mikroba, baik bakteri, yeast ataupun kapang, memperjelas ukuran dan bentuk mikroba, untuk melihat struktur luar, apabila memungkinkan struktur dalam, dari mikroba, dan untuk melihat reaksi mikroba terhadap cat yang diberikan, sehingga sifat-sifat fisik dan kimia yang ada bisa dideteksi.
Pewarnaan merupakan prosedur mewarnai mikroorganisme untuk menonjolkan struktur tertentu dari mikroorganisme. Sebelum diwarnai mikroorganisme difiksasi agar terikat atau menempel pada kaca. Fiksasi merupakan proses dimana struktur internal dan eksternal dari mikroorganisme disimpan dan diikatkan pada suatu benda.
Pada praktikum kali ini dilakukan pengecatan sederhana dan pengecatan gram. Peengecatan sederhana adalah pengecatan yang dilakukan menggunakan satu macam cat saja, cat yang bisa digunakan adalah metilen blue, gentiana violet, basic fuschin atau safranin. Sedangkan pengecatan gram adalah pengecatan yang menggunakan 2 macam cat warna dan merupakan yang paling banyak digunakan dan sangat populer. Pada pengecatan gram ini melalui 4 tahap yaitu :
a) Pemberian cat utama (larutan kristal violet), pewarna ungu.
b) Pengintensifan warna dengan menambahkan warna larutan Mordan. c) Pencucian (dekolorisasi) dengan menggunakan alkohol / aseton.
d) Penambahan cat penutup (counter stain), yaitu dengan larunan safranin yg berwarna merah.
Alat-alat yang digunakan untuk praktikum ini adalah objek gelas sebagai tempat sampel yang akan diamati, kaca penutup yang digunakan untuk menutup sampel yang telah diletakkan pada objek gelas, lampu spiritus sebagai alat yang digunakan untuk proses pemfikasian, ose yang digunakan untuk mengambil bakteri yang akan diamati strukturnya ( yang digunakan adalah ose tumpul ), mikorskop sebagai alat yang digunakan untuk mengamati bakteri yang akan diuji. Sementara bahan-bahan yang digunakan pada pengecetan sederhana adalah biakan murni Bacillus subtilis dalam medium nutrien cair berumur 24 jam, Escherichia coli dalam medium nutrient cair berumur 24 jam, larutan safranin atau Kristal violet. Dan bahan-bahan yang digunakan pada pengecatan gram adalah biakan murni Bacillus subtilis dalam medium nutrient cair berumur 24 jam, biakan murni Escherichia coli dalam medium nutrient cair berumur 24 jam, larutan cat kristal violet (gram A) sebagai larutan cat utama, larutan lugol iodine (gram B) digunakan untuk mengintensifkan warna, larutan alkohol atau aseton (gram C)
digunakan sebagai larutan pencuci, larutan cat safranin (gram D) digunakan sebagai cat penutup.
Langkah pertama yang lakukan adalah melakukan pengecatan sederhana. Hal pertama yang dilakukan adalah mengambil gelas objek, kemudian bersihkan dengan alkohol hingga bebas dari bebas lemak, kemudian dipanggang sebentar di atas api spiritus, ambil secara aseptic 1 ose suspensi biakan Bacillus subtilis dan ratakan di atas permukaan gelas ojek kira-kira 1 cm, diratakan dengan luas 1 cm bertujuan agar larutan tidak keluar dari gelas objek dan dikarenakan menyesuaikan dari luas kaca penutupnya, kemudian keringanginkan preparat tersebut setelah itu dilakukan fiksasi dengan cara melewatkannya di atas api spiritus, yang bertujuan untuk melekatkan biakan Bacillus subtilis tadi di atas gelas objek. Kemudian dinginkan, lalu teteskan Kristal violet secukupnya dan biarkan selama 1-2 menit. Cuci dengan air mengalir sampai sisa cat habis, kemudian keringanginkan. Kemudian amati menggunakan mikroskop dan gambarkan morfologi selnya. Pengecatan sederhana ini juga dilakukan pada Escherichia coli serta dilakukan dengan cara yang sama seperti pada Bacillus subtilis.
Langkah kedua yang dilakukan adalah melakukan pengecatan gram. Pengecatan gram ini dilakukan untuk mengetahui bakteri yang diamati tersebut termasuk ke dalam kelompok gram positif atau gram negatif, dengan melihat pada hasil pewarnaan akhirnya, apabila terlihat pada mikroskop strukturnya berwarna ungu maka bakteri yang diamati termasuk dalam kelompok bakteri gram positif, dan apabila yang terlihat pada mikroskop strukturnya berwarna merah maka bakteri yang diamati termasuk dalam kelompok bakteri gram negative. Pertama ambil gelas objek, kemudian bersihkan dengan alkohol hingga bebas lemak, kemudian panggang sebentar di atas api spiritus, ambil secara aseptic 1 ose suspensi biakan Bacillus subtilis dan ratakan di atas permukaan gelas ojek kira-kira 1 cm, diratakan dengan luas 1 cm bertujuan agar larutan tidak keluar dari gelas objek dan dikarenakan menyesuaikan dari luas kaca penutupnya kemudian keringanginkan preparat tersebut dan fiksasi dengan cara melewatkannya di atas api spiritus yang bertujuan untuk melekatkan biakan Bacillus subtilis tadi di atas gelas objek. Setelah dingin, tetesi dengan cat gram A ( larutan cat kristal violet) yang berfungsi sebagai cat utama sebanyak 2 hingga 3 tetes, kemudian diamkan selama 1 menit, kemudian cuci dengan air mengalir, dan keringanginkan lalu teteskan cat gram B (lugol iodine) sebanyak 1 tetes yang berfungsi sebagai larutan yang digunakan untuk mengintensifkan warna, biarkan selama 1 menit, kemudian cuci dengan air mengalir dan
keringanginkan, lalu cuci dengan larutan peluntur ( gram C yaitu alkohol ) selam 30 detik kemudian cuci dengan air mengalir dan keringanginkan, lalu beri larutan cat penutup ( gram D yaitu safranin) selama 1 menit lalu cuci dengan air mengalir dan keringanginkan. Kemudian amati dengan mikroskop, dan terlihat warna ungu dari struktur bakterinya hal ini dikarenakan adanya peptidoglikan yang kokoh pada dinding selnya sehingga larutan kristal violet yang masuk ke dalam bakteri tidak dapat tercuci oleh alkohol dan menunjukan bahwa bakteri tersebut termasuk dalam kelompok bakteri gram positif. Pengecatan gram ini juga dilakukan pada bakteri Escherichia coli serta dilakukan dengan menggunakan cara yang sama yang dilakukan pada bakteri Bacillus subtilis. Pada bakteri Escherichia coli terlihat warna merah pada struktur bakterinya hal ini dikarenakan larutan kristal violet iodine yang masuk kedalam bakteri gram positif dapat tercuci oleh alkohol serta merusak lapisan lipopolisakarida sehingga sel bakterinya transparan hal ini menunjukan bahwa bakteri tersebut termasuk dalam kelompok bakteri gram negatif.
VI. KESIMPULAN
Kesimpulan yang dapat diambil dari praktikum yang telah dilakukan adalah :
1. Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat mengetahui tujuan dari pengecatan serta dapat melakukan pengecatan terhadap mikroba
2. Pengecatan atau pewarnaan merupakan salah satu cara yang digunakan untuk mengamati sel-sel bakteri dan merupakan prosedur mewarnai mikroorganisme untuk menonjolkan struktur tertentu dari mikroorganisme.
3. Tujuan dari pengecatan adalah untuk mempermudah melihat mikroba, baik bakteri, yeast ataupun kapang, memperjelas ukuran dan bentuk mikroba, untuk melihat
struktur luar, apabila memungkinkan struktur dalam, dari mikroba, dan untuk melihat reaksi mikroba terhadap cat yang diberikan, sehingga sifat-sifat fisik dan kimia yang ada bisa dideteksi.
4. Tekhnik pengecatan yang dilakukan ada 2 yaitu pengecatan sederhana yang merupakan pengecatan yang dilakukan menggunakan satu macam cat saja, cat yang bisa digunakan adalah metilen blue, gentiana violet, basic fuschin atau safranin. Dan pengecatan gram yang merupakan pengecatan yang menggunakan 2 macam cat warna dan merupakan yang paling banyak digunakan dan sangat populer.
5. Tahap – tahap yang dilakukan pada pengecatan gram :
a) Pemberian cat utama (larutan kristal violet), pewarna ungu.
b) Pengintensifan warna dengan menambahkan warna larutan Mordan. c) Pencucian (dekolorisasi) dengan menggunakan alkohol / aseton.
d) Penambahan cat penutup (counter stain), yaitu dengan larunan safranin yg berwarna merah.
6. Bacillus subtilis termasuk dalam kelompok bakteri gram positif karena larutan kristal violet iodine yang masuk kedalam bakteri gram positif tidak dapat tercuci oleh alkohol dikarena adanya peptidoglikan yang kokoh pada dinding selnya sehingga bakterinya berwarna ungu.
7. Escherichia coli termasuk dalam kelompok bakteri gram negatif karena larutan kristal violet iodine yang masuk kedalam bakteri gram negatif tersebut dapat tercuci oleh alkohol dan alkohol tersebut merusak lapisan lipopolisakarida sel bakterinya transparan, dan berwarna merah setelah diberi safranin.
VII. DAFTAR PUSTAKA
Dwijoseputro, D. 2010. Dasar-dasar mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.
Hadioetama, Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek, Jakarta : PT Gramedia, 1990 Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Erlangga.