Cyprinus carpio

PENDAHULUAN

Ikan mas (Cyprinus carpio) merupakan salah satu spesies ikan air tawar utama di Indonesia. Keunggulan tersebut mendorong budidaya ikan mas, khususnya di Indonesia terus meningkat. Namun, perubahan lingkungan alami dan peningkatan intensitas produksi memicu munculnya masalah penyakit yang dapat merugikan usaha budidaya ikan mas. Wabah penyakit pada ikan mas sering disebabkan oleh bakteri patogen Aeromonas hydrophila yang telah terbukti sebagai faktor pembatas utama dalam produksi dan profitabilitas dengan dampak negatif pada perkembangan ekonomi dan industri akuakultur. Bakteri ini berciri gram negatif, bentuk batang pendek, anaerob fakultatif, motil, mampu tumbuh pada kisaran suhu 11.2-40.5 ^oC, dan umumnya ditemukan di dalam usus ikan (Biradar et al. 2007). Karakter patogen ini sangat mudah beradaptasi dengan lingkungan dan memiliki kisaran yang luas terhadap turbiditas, pH, salinitas dan suhu. Suhu optimum untuk pertumbuhan terbaik patogen A. hydrophila adalah 28

o

C, relatif sama dengan suhu optimum untuk pertumbuhan terbaik ikan mas dan ikan air tawar pada umumnya, bahkan toleransi suhu adaptif maksimum pada patogen ini sampai mencapai 41 ^oC (Shayo et al. 2012). Serangan patogen ini bersifat oportunistik dengan penyebaran yang luas dan menimbulkan penyakit Motile Aeromonad Septicemia (MAS), dapat mengakibatkan mortalitas tinggi pada ikan mas, namun ikan yang mati karena infeksi patogen ini umumnya hanya terjadi saat ikan terpapar secara jangka panjang dengan faktor stres sub-akut atau jangka pendek dengan faktor stres akut (Harikrishnan dan Balasundaram 2005; Shayo et al. 2012).

Prebiotik adalah komponen nutrien berupa serat yang tidak dapat dicerna oleh ikan, namun secara selektif dapat menstimulasi peningkatan pertumbuhan dan aktivitas beberapa strain bakteri komensal menguntungkan pada saluran pencernaan ikan, selanjutnya berguna untuk memperbaiki status kesehatan ikan. Jalur metabolisme mikroflora usus berkarakter sakarolitik dan menghasilkan SCFA (short chain fatty acids = asam-asam lemak rantai pendek) yang membantu mereduksi pH lumen usus sehingga menciptakan kondisi mikroekofisiologi inhibitor bagi patogen eksternal. Oleh karena itu, berbagai jenis prebiotik

20

akuakultur seperti FOS, MOS, inulin, β-glukan disebut juga dengan istilah imunosakarida. Prebiotik secara langsung meningkatkan respons imun seluler: aktivitas fagositik, neutrofil, komplemen dan lisozim melalui interaksi dengan pattern recognition receptors (PRR) atau microbe associated molecular patterns (MAMPs) yang dipresentasikan pada aktivasi sel-sel imun seluler (Song et al. 2014). Fokus studi komparatif prebiotik pertama kali adalah pada fermentasi FOS, inulin, GOS dan IMO oleh mikroflora usus (Rycroft et al. 2001). Prebiotik yang banyak diteliti dan diaplikasikan pada berbagai spesies ikan, antara lain inulin, FOS, FOS rantai pendek (scFOS), MOS, trans-galaktooligosakarida (TOS), Bio-MOS^® yang mengandung MOS yang bersumber dari ragi, GOS, xylooligosakarida (XOS), arabinoxylooligosakarida (AXOS), isomaltooligosakarida (IMO) dan GroBiotic^®-A (GBA) (Ringo et al. 2014a). Prebiotik dibutuhkan oleh semua kelompok bakteri menguntungkan yang hidup pada saluran pencernaan ikan sebagai substrat untuk pertumbuhannya. Penggunaan 454 pyrosekuensing telah mengkonfirmasi efek positif prebiotik AXOS terhadap mikroflora usus juvenil ikan Siberian sturgeon (Acipenser baerii) (Geraylou et al. 2013).

Studi prebiotik akuakultur juga menyangkut evaluasi terhadap beberapa parameter kinerja pertumbuhan ikan, seperti efek prebiotik terhadap pertumbuhan, rasio konversi pakan, komposisi dan strain bakteri dominan di usus (Ringo et al. 2010). Sebagian besar studi atau penelitian tentang prebiotik berfokus pada fruktan yang ditemukan sebagai cadangan karbohidrat pada spesies tanaman dari famili Asteraceae, seperti inulin, fruktooligosakarida (FOS) dan galaktooligosakarida (GOS) (Carabin dan Flamm 1999; Figueiredo-Ribeiro 1993). Prebiotik ini relatif mudah proses pengolahannya dan murah, karena dapat diekstraksi dari tanaman atau diproduksi dengan cara sintesis enzimatik (Macfarlane et al. 2006; Macfarlane et al. 2007). Salah satu jenis tanaman pangan alternatif berkarbohidrat yang cukup populer adalah ubi jalar (Ipomoea batatas L.). Ubi jalar merupakan salah satu jenis umbi-umbian yang banyak dikenal dan cukup sering dikonsumsi oleh masyarakat. Ubi jalar ini mengandung oligosakarida yang berpotensi sebagai prebiotik, salah satunya adalah rafinosa (Palmer 1982). Beberapa jenis oligosakarida yang terkandung pada ekstrak ubi jalar varitas Sukuh mentah dan kukus adalah maltosa, maltotriosa, sukrosa dan rafinosa. Kadar rafinosa ubi jalar varitas Sukuh mentah dan kukus masing-masing adalah 48.04 ppm dan 39.50 ppm, dengan kadar rafinosa sebesar 2,97% (Suryadjaja, 2005). Berdasarkan kandungan oligosakarida pada ubi jalar varitas Sukuh tersebut perlu dilakukan penelitian untuk mengevaluasi pengaruh prebiotik tersebut secara in vivo terhadap hewan uji. Tujuan penelitian ini adalah mengevaluasi kinerja pertumbuhan, respons imun dan resistensi ikan mas (Cyprinus carpio) yang diberi prebiotik dari ekstrak ubi jalar (Ipomoea batatas L.) terhadap infeksi A. hydrophila.

BAHAN DAN METODE

Persiapan prebiotik. Persiapan prebiotik dilakukan dalam beberapa tahap menurut metode Marlis (2008). Produksi prebiotik diawali dengan pembuatan tepung ubi jalar, ekstraksi oligosakarida menggunakan ethanol 70%, dan pengukuran total padatan terlarut. Selanjutnya ekstrak oligosakarida dengan

21 konsentrasi total padatan terlarut 5%, dianalisis jenis dan kandungan oligosakaridanya menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (Lampiran 4).

Persiapan pakan uji. Persiapan pakan uji dilakukan dengan menambahkan tiga dosis prebiotik (0.5%, 1% dan 2% v/w) ke dalam pakan komersial yang mengandung protein 31%. Pencampuran pakan dan prebiotik dilakukan dengan menambahkan 2% putih telur sebagai binder, sementara pakan kontrol hanya ditambahkan 2% putih telur. Selanjutnya pakan dikeringudarakan selama 10-15 menit untuk mengurangi kelembaban.

Pemeliharaan ikan dan rancangan eksperimen. Penelitian ini dilakukan selama 45 hari, terdiri dari 30 hari pemeliharaan dengan aplikasi prebiotik, satu hari persiapan uji tantang, dan 14 hari pengamatan setelah uji tantang. Hewan uji yang digunakan yaitu ikan mas dengan bobot rata-rata 4.75±0.22 g yang sebelumnya telah diadaptasikan selama dua minggu terhadap lingkungan percobaan. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap, terdiri dari lima perlakuan dengan tiga ulangan yaitu: kontrol (-) (pakan tanpa prebiotik dan tanpa uji tantang), kontrol (+) (pakan tanpa prebiotik dengan uji tantang), A (suplementasi pakan dengan dosis prebiotik 0.5% v/w dengan uji tantang), B (suplementasi pakan dengan dosis prebiotik 1% v/w dengan uji tantang), dan C (suplementasi pakan dengan dosis prebiotik 2% v/w dengan uji tantang). Ikan uji ditebar secara acak ke dalam masing-masing akuarium perlakuan yang berukuran 65x40x40 cm³ dengan padat penebaran 15 ekor/akuarium. Pemberian pakan uji dilakukan sampai ikan kenyang (at satiation) dengan feeding frequency tiga kali sehari (08.00, 12.00, 16.00 WIB). Kualitas air dijaga dengan menyipon feses ikan dan pergantian air media pemeliharaan sebanyak 25% setiap hari. Kualitas air dimonitor selama pemeliharaan dengan parameter dan kisaran: suhu 28-29^oC, oksigen terlarut (DO) 7.2-8.1 mg/L, pH 7.4-8.04, dan total amonia nitrogen (TAN) 0.0032-0.0065 mg/L.

Uji tantang. Setelah 30 hari diberi pakan perlakuan, ikan mas dipuasakan selama satu hari kemudian diuji tantang dengan bakteri patogen A. hydrophila. Infeksi dilakukan dengan cara injeksi secara intramuskular dengan konsentrasi A. hydrophila 10⁷ CFU/mL sebanyak 0.1 mL/ekor menggunakan siring volume 1 mL, ikan kontrol negatif diinjeksi dengan Phosphate Buffer Saline (PBS). Gejala klinis dan mortalitas ikan mas diamati setiap hari selama 14 hari setelah injeksi.

Parameter eksperimen. Parameter eksperimen yang diukur meliputi kinerja pertumbuhan, respons imun, tingkat kelangsungan hidup, total bakteri di usus dan jenis bakteri dominan, serta aktivitas enzim saluran pencernaan. Parameter kinerja pertumbuhan yang diamati meliputi laju pertumbuhan harian (LPH) dan rasio konversi pakan (FCR). Kinerja pertumbuhan dievaluasi setelah 30 hari perlakuan prebiotik, sedangkan tingkat kelangsungan hidup dihitung pada akhir perlakuan prebiotik dan akhir uji tantang. Aktivitas enzim saluran pencernaan diamati setelah 30 hari perlakuan prebiotik meliputi aktivitas enzim amilase (Bernfeld 1955), protease (Walter 1984) dan lipase (Kwon and Rhee 1986).

Populasi bakteri diusus diamati dengan mengambil sampel usus ikan sebanyak 0.1 g dan dihomogenkan dalam 0.9 mL PBS. Pengenceran serial dilakukan dan setiap suspensi pada masing-masing tabung pengenceran (0.05 mL) disebar di atas media TSA (Trypticase Soy Agar). Jumlah sel bakteri dalam

22

sampel ditentukan dengan menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada media dikalikan dengan faktor pengenceran (Madigan et al. 2003) dalam CFU/g.

Bakteri yang tumbuh dominan di usus (bakteri yang tumbuh pada pengenceran terendah) diidentifikasi berdasarkan sekuen gen 16S rRNA dengan primer 63f (5‟CAG GCC TAA CACATG CAA GTC-3‟) dan primer 1387r (5‟ -GGG -GGG WGT GTA CAA CGC-„3) (Marchesi et al. 1998). Komposisi master mix PCR setiap tabung terdiri atas 25 µl GoTaq (Promega), 4 µl primer 63f, 4 µl primer 1387r, 17 µl ddH₂O dan DNA template diambil dengan tusuk gigi secara langsung dari sampel isolat. Kondisi PCR adalah sebagai berikut: pradenaturasi 95 ^oC selama 5 menit, denaturasi 95 ^oC selama 1 menit, annealing primer 55 ^oC selama 1 menit, elongasi 72 ^oC selama 1 menit, dan post PCR pada suhu 72 ^oC selama 5 menit. Proses amplifikasi pada mesin PCR terdiri atas 30 siklus. Penghentian reaksi dilakukan dengan penurunan suhu ke 4 ^oC. Produk PCR dijalankan pada elektroforesis dengan gel agarose 1% dalam bufer TAE 1x pada 80 volt selama 45 menit, dilanjutkan visualisasi menggunakan UV transiluminator. Sekuensing dilakukan dengan mengirimkan DNA hasil amplifikasi ke perusahaan penyedia jasa sekuensing. Hasil sekuen disejajarkan dengan data base di Gene Bank menggunakan program BLAST-N online software (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Lampiran 5).

Parameter respons imun yang diukur meliputi total leukosit, aktivitas fagositik (Balcazar et al. 2006), diferensial leukosit (limfosit, monosit dan neutrofil), hematokrit, hemoglobin dan total eritrosit. Respons imun dan tingkat kelangsungan hidup ikan diukur dua kali yaitu setelah 30 hari masa pemberian pakan dengan suplementasi prebiotik (sebelum uji tantang) dan 14 hari setelah uji tantang.

Analisis data. Data yang diperoleh dianalisis secara statistik menggunakan software SPSS Statistic 17.0 dan uji lanjut dengan Uji Duncan untuk uji beda nyata (P<0.05).

HASIL

Komposisi prebiotik. Prebiotik yang diekstraksi dari ubi jalar varitas Sukuh mengandung berbagai komponen oligosakarida, yaitu inulin sebesar 1.115%, fruktooligosakarida (FOS) sebesar 1.015% dan galaktooligosakarida (GOS) sebesar 1.488%.

Aktivitas enzim pencernaan dan performa pertumbuhan. Aktivitas enzim pencernaan (amilase, protease dan lipase) pada perlakuan prebiotik dosis 2% signifikan lebih tinggi (P<0.05) dibandingkan dengan kontrol (Tabel 10). Laju pertumbuhan harian pada perlakuan prebiotik lebih tinggi (P<0.05) dibanding kontrol, dengan nilai tertinggi pada perlakuan prebiotik 2%. Konversi pakan pada semua perlakuan prebiotik lebih rendah (P<0.05) dibanding kontrol dan nilai konversi pakan terendah diperoleh pada perlakuan prebiotik 2%. Suplementasi pakan dengan prebiotik selama 30 hari berpengaruh nyata (P<0.05) terhadap populasi bakteri di usus ikan mas. Dalam penelitian ini jumlah total bakteri di usus ikan yang diberi perlakuan prebiotik lebih tinggi (P<0.05) dibanding kontrol dan nilai tertinggi untuk parameter ini teramati pada perlakuan prebiotik 2% (Tabel 11).

23 Bakteri dominan di usus. Hasil isolasi bakteri yang tumbuh dominan di usus ikan mas yang diberi prebiotik dengan dosis 2% diperoleh lima isolat murni. Hasil identifikasi berdasarkan sekuen gen 16S-rRNA terhadap lima isolat tersebut menunjukkan bahwa lima isolat bakteri tersebut memiliki kedekatan dengan Bacillus pumilus strain FR1_11 dengan indeks similaritas 99%, Staphylococcus kloosii strain 68 dengan indeks similaritas 99%, Staphylococcus hominis strain HN-3 dengan indeks similaritas 99%, Aeromonas veronii strain BB1 dengan indeks similaritas 96% dan Kocuria rhizophila strain 3330 dengan indeks similaritas 97% (Tabel 12).

Tabel 10. Aktivitas enzim pencernaan (U/mg protein) ikan mas yang diberi prebiotik dosis 2%

Parameter/Perlakuan Prebiotik Kontrol

Amilase 0.543±0.004^b 0.495±0.003^a

Protease 0.077±0.004^b 0.037±0.002^a

Lipase 0.609±0.008^b 0.467±0.004^a

Keterangan: huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan pengaruh perlakuan yang berbeda nyata (uji jarak berganda Duncan; P<0.05). Nilai yang tertera merupakan nilai rata-rata dan simpangan baku.

Tabel 11. Kinerja pertumbuhan dan total bakteri di usus ikan mas yang diberi prebiotik setelah 30 hari pemeliharaan

Parameter/Perlakuan Prebiotik Kontrol 0.5% 1% 2%

Laju pertumbuhan harian (%) 1.72±0.13^a 1.86±0.02^ab 1.93±0.03^b 2.81±0.05^c

Rasio konversi pakan 2.34±0.12^a 2.03±0.02^b 1.72±0.12^c 1.34±0.02^d

Total bakteri di usus (log cfu/g) 7.44±0.06^a 8.66±0.03^b 8.99±0.04^c 9.30±0.05^d

Keterangan: huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan pengaruh perlakuan yang berbeda nyata (uji jarak berganda Duncan; P<0.05). Nilai yang tertera merupakan nilai rata-rata dan simpangan baku.

Tabel 12. Bakteri dominan di usus ikan mas yang diberi prebiotik dosis 2%

Nama Spesies Homologi Nomor Assesi

Bacillus pumilus strain FR1_11 99% EU373536.1

Staphylococcus kloosii strain 68 99% JX102547.1

Staphylococcus hominis strain HN-3 99% KT003249.1

Aeromonas veronii strain BB1 96% KF446249.1

Kocuria rhizophila strain 3330 97% KP345929.1

Tingkat kelangsungan hidup, respons imun dan resistensi. Tingkat kelangsungan hidup ikan setelah 30 hari pemeliharaan adalah 100%, tidak ada perbedaan antara semua perlakuan prebiotik dan kontrol. Tingkat kelangsungan hidup ikan mas setelah uji tantang pada perlakuan prebiotik 2% lebih tinggi (P<0.05) dibanding dengan kontrol positif. Nilai total leukosit dan total eritrosit ikan mas setelah 30 hari pemeliharaan dengan perlakuan prebiotik 2% lebih tinggi (P<0.05) dibanding perlakuan 0.5% dan 1% serta kontrol (positif dan negatif). Nilai total leukosit dan aktivitas fagositik setelah uji tantang pada perlakuan prebiotik 2% lebih tinggi (P<0.05) dibanding kontrol positif. Total eritrosit,

24

hematokrit dan hemoglobin ikan mengalami penurunan setelah uji tantang (Tabel 13 dan 14).

Tabel 13. Tingkat kelangsungan hidup dan parameter imunitas ikan mas yang diberi prebiotik setelah 30 hari pemeliharaan

Parameter Prebiotik 0.5% 1% 2% Kontrol positif Kontrol negatif TKH (%) 100±0.00^a 100±0.00^a 100±0.00^a 100±0.00^a 100±0.00^a Total Leukosit (x10⁴ sel/mm³) 7.5±0.27^b 6.6±0.17^c 9.8±0.3^d 8±0.46^ab 8.8±0.31^a Total Eritrosit (x10⁶ sel/mm³) 1.09±0.06^bc 1±0.17^c 1.61±0.07^d 1.28±0.03^ab 1.35±0.04^a Hematokrit (%) 41±1.73^c 46±2.65^cd 50.5±1.32^d 18.5±1.32^b 33.5±2.18^a Hemoglobin (g%) 6.6±0.2^a 7.25±0.05^b 7.45±0.03^b 6.6±0.17^a 6.8±0.1^a Aktivitas fagositik (%) 25±2.65^a 23±1^a 48±1.73^b 26±1.73^a 27±2^a

Keterangan: huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan pengaruh perlakuan yang berbeda nyata (uji jarak berganda Duncan; P<0.05). Nilai yang tertera merupakan nilai rata-rata dan simpangan baku.

Tabel 14. Tingkat kelangsungan hidup dan parameter imunitas ikan mas yang diberi prebiotik setelah uji tantang dengan Aeromonas hydrophila

Parameter Prebiotik 0.5% 1% 2% Kontrol

positif Kontrol negatif TKH (%) 64.44±10.18^a 86.67±13.34^b 100.00±0.00^b 51.11±3.85^a 93.33±6.67^b Total Leukosit (10⁴ sel/mm³) 12.9±0.27^a 16.8±0.17^c 20.7±0.27^d 13.8±0.27^b 12.6±0.36^a Total Eritrosit (10⁶ sel/mm³) 1.04±0.03^b 0.99±0.04^b 0.73±0.03^c 1.02±0.02^b 1.17±0.03^a Hematokrit (%) 23±2.65^b 28±1.73^ab 31±3.61^a 22±1.73^b 32±2.65^a Hemoglobin (g%) 4.9±0.1^c 5.6±0.2^ab 5.7±0.27^a 5±0.27^bc 6.1±0.27^a Aktivitas fagositik (%) 44±3.61^b 54±2.65^c 62±2.65^c 36±3.61^ab 29±3.61^a

Keterangan: huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan pengaruh perlakuan yang berbeda nyata (uji jarak berganda Duncan; P<0.05). Nilai yang tertera merupakan nilai rata-rata dan simpangan baku

PEMBAHASAN

Prebiotik adalah karbohidrat yang tidak tercerna oleh ikan, sebagian besar berupa monosakarida rantai pendek yang umumnya dikenal sebagai oligosakarida. Prebiotik merupakan komponen karbohidrat yang lepas dari metabolisme pencernaan tingkat tinggi pada saluran pencernaan, namun dapat mengubah komposisi mikroflora usus dengan cara mengubah tipe substrat yang lebih sesuai dengan kondisi mikroekofisiologi mikroflora usus residen spesifik, sehingga cepat berkembang. Oleh karena itu, efek prebiotik bersifat spesifik karakter, artinya prebiotik hanya meningkatkan pertumbuhan mikroflora menguntungkan dan atau mereduksi mikroflora patogen di dalam usus inang, mengurangi pH cairan usus melalui produksi asam-asam lemak rantai pendek (SCFA), dan mengubah

25 konsentrasi enzim ekstraseluler yang dihasilkan oleh probiotik (Woods dan Gorbach 2001; Gibson dan Roberfroid 1995; Mei et al. 2011).

Berbagai jenis komponen karbohidrat yang mempunyai karakteristik prebiotik dan telah banyak diaplikasikan pada sistem akuakultur adalah mannanoligosakarida (MOS), fruktooligosakarida (FOS), galaktooligosakarida (GOS), inulin, transgalaktooligosakarida (TOS) dan laktosa (Hoffmann 2012). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa suplementasi prebiotik dari ekstrak ubi jalar yang mengandung beberapa jenis oligosakarida seperti FOS sebesar 1.015%, GOS sebesar 1.488%, serta inulin sebesar 1.115% terbukti dapat meningkatkan populasi bakteri pada usus ikan uji. Peningkatan populasi bakteri di usus dipengaruhi oleh dosis prebiotik yang diberikan, jumlah total bakteri semakin meningkat seiring dengan meningkatnya dosis prebiotik yang diberikan. Hal tersebut mengindikasikan bahwa dosis prebiotik yang diberikan menyediakan substrat untuk pertumbuhan bakteri di dalam saluran pencernaan sehingga populasinya lebih tinggi dibanding kontrol. Performa pertumbuhan dan konversi pakan terlihat lebih baik pada ikan mas yang mengkonsumsi pakan mengandung prebiotik dengan hasil terbaik pada dosis 2%. Perbaikan performa pertumbuhan tersebut disebabkan oleh adanya aktivitas enzim pencernaan yang meningkat, perbaikan struktur mikrovilli pada permukaan enterosit yang membuat permukaan sel penyerap nutrien menjadi lebih luas sehingga efisiensi pakan meningkat, serta produksi asam lemak rantai pendek (SCFA) sebagai hasil fermentasi prebiotik oleh mikroflora endoseluler usus. Suplementasi MOS dengan dosis 0.2% meningkatkan panjang mikrovilli larva cobia (Rachycentron canadum) (Salze et al. 2008) dan peningkatan densitas mikrovilli usus bagian depan dan belakang gilthead sea bream (Sparus aurata) (Dimitroglou et al. 2010). Oligosakarida juga mampu memperbaiki morfologi usus seiring dengan potensi mengendalikan stress oksidatif, sehingga meningkatkan efisiensi kapasitas penyerapan usus melalui mekanisme perluasan area mikrovilli usus, yang berdampak positif terhadap pertumbuhan (Solis de los Santos et al. 2005; Song et al. 2010).

Perbaikan aktivitas enzim pencernaan akibat pemberian prebiotik pada ikan mas ditunjukkan melalui data aktivitas enzim pencernaan; pemberian prebiotik 2% menghasilkan aktivitas enzim protease yang signifikan lebih tinggi dibanding kontrol. Hal tersebut disebabkan oleh integrasi peningkatan aktivitas enzim endoseluler ikan dan ekstraseluler mikroflora yang dimodulasi oleh prebiotik. Hasil yang sama juga diperoleh dari studi pada crucian carp yang diberi prebiotik xylooligosakarida (XOS) (Xu et al. 2009) dan pemberian MOS pada lobster air tawar (Cherax destructor) (Sang et al. 2011).

Perbaikan diversitas mikroflora usus akibat pemberian prebiotik pada penelitian ini ditunjukkan melalui identifikasi bakteri yang mendominasi usus ikan mas yang mendapat suplementasi prebiotik. Pada suplementasi prebiotik 2% didapatkan beberapa jenis bakteri yang tumbuh dominan seperti Bacillus pumilus strain FR1_11, Staphylococcus kloosii strain 68, Staphylococcus hominis strain HN-3, Aeromonas veronii strain BB1 dan Kocuria rhizophila strain 3330. Keberadaan bakteri-bakteri tersebut dalam usus ikan mas diduga dapat meningkatkan performa pertumbuhan dan status kesehatan ikan. Keberadaan bakteri Bacillus pumilus strain FR1_11, Staphylococcus kloosii strain 68, Staphylococcus hominis strain HN-3, Aeromonas veronii strain BB1 dan Kocuria rhizophila strain 3330 telah terbukti aman bagi kehidupan ikan mas, karena tidak

26

ditemukan gejala klinis atau mortalitas setelah bakteri-bakteri tersebut diinjeksikan pada ikan mas (data tidak ditampilkan). Selain itu, beberapa penelitian sebelumnya melaporkan bahwa bakteri-bakteri tersebut merupakan bakteri menguntungkan. Hasil penelitian Yun-Zhang et al. (2010) menunjukkan bahwa pemberian Bacillus pumilus dan Bacillus clausii dapat memperbaiki performa pertumbuhan dan respons imun grouper Epinephelus coioides. Bacillus pumilus dan banyak genus Bacillus lainnya telah banyak dievaluasi sebagai sumber probiotik dalam sistem akuakultur, baik untuk tujuan perbaikan kualitas air maupun mereduksi insiden akibat wabah patogen pada berbagai spesies ikan budidaya (Irianto dan Austin 2002). Bacillus pumilus yang diisolasi dari usus bagian tengah Penaeus monodon, secara in vitro mempunyai daya hambat yang sangat kuat melawan bakteri patogen Vibrio alginolyticus, Vibrio mimicus dan Vibrio harveyi (Hill et al. 2009). Aplikasi probiotik Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis dan Bacillus subtilis yang bersumber dari sampel tanah dan air laut juga telah diuji dapat mereduksi TAN, meningkatkan pertumbuhan dan kelangsungan hidup udang stadia PL tanpa pergantian air (Devaraja et al. 2013).

Blaxhall dan Daisley (1973) menyatakan bahwa parameter darah seperti hematokrit, hemoglobin dan total eritrosit adalah parameter yang menggambarkan status kesehatan pada ikan. Suplementasi prebiotik pada ikan mas selama 30 hari tidak menimbulkan pengaruh yang negatif terhadap total eritrosit ikan mas. Hal ini ditunjukkan melalui data total eritrosit ikan mas setelah 30 hari mendapatkan suplementasi prebiotik masih berada pada kisaran normal; menurut Kumar et al. (2013) jumlah sel darah merah merupakan yang terbesar dan jumlahnya bervariasi dengan kisaran 1.05-3.0 x10⁶/mm³. Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa suplementasi prebiotik memberikan pengaruh positif terhadap total leukosit ikan mas sebelum uji tantang; total leukosit pada perlakuan prebiotik lebih tinggi dibanding kontrol.

Infeksi A. hydrophila yang terjadi setelah uji tantang menimbulkan beberapa perubahan pada parameter gambaran darah, meliputi penurunan nilai hematokrit, hemoglobin, dan total leukosit. Sitotoksisitas A. hydrophila dan akumulasi produk ekstraselulernya (α dan β hemolisin; aerolisin; enterotoksin ACT, ALT dan AST, protease serta RNAse) menyebabkan nekrotik eritrosit, hemolisis eritrosit dan ion besi (Rey et al. 2009), sehingga menimbulkan adanya penuruan jumlah sel darah merah ikan uji. Suplementasi prebiotik pada ikan mas pada penelitian ini terbukti mampu memberikan pengaruh positif pada resistensi ikan mas terhadap A. hydrophila yang ditunjukkan melalui data kelangsungan hidup setelah uji tantang yang lebih tinggi pada perlakuan prebiotik dibanding kontrol positif. Hal ini diduga terjadi akibat status kesehatan ikan mas sebelum uji tantang yang lebih baik sebagai hasil dari suplementasi prebiotik, sehingga ikan mas mempunyai sistem pertahanan yang baik dan mampu melawan infeksi patogen. Mekanisme aksi prebiotik mirip dengan antibodi yang mempunyai kemampuan untuk mengikat antigen dengan mengikat dan mengeluarkan patogen dari jaringan usus serta menjadikannya perangsang agar dapat bereaksi membentuk suatu respons imun seluler dan humoral. Bakteri patogen pada umumnya menempel pada sel-sel enterosit dengan fimbriae type 1. Perlekatan ini merupakan syarat kunci terbukanya peluang besar bagi bakteri untuk menyebabkan penyakit. FOS, GOS dan inulin (prebiotik yang terkandung pada ekstrak ubi jalar) serta MOS merupakan jenis oligosakarida yang unik karena memiliki reseptor untuk fimbriae

27 type 1. Fungsi dari komponen utama prebiotik ini adalah sebagai kompetitor tempat perlekatan pada sel-sel enterosit dimana bakteri patogen akan melekat, selanjutnya membawa bakteri tersebut keluar dari jaringan usus sebelum bakteri menempel pada sel-sel enterosit. Efek positif prebiotik tidak ditentukan berdasarkan apakah patogen tidak mampu memfermentasi prebiotik, namun ditentukan jika patogen tidak dapat dirangsang perlekatan dan kolonisasinya oleh prebiotik, berhadapan dengan berbagai jenis mikroflora menguntungkan yang hidup di dalam usus ikan. Secara alami, prebiotik berpotensi merangsang sistem imun seluler melalui mekanisme aksi tidak langsung yaitu diawali dari keterlibatannya dalam merangsang pertumbuhan mikroflora menguntungkan seperti bakteri asam laktat dan Bacillus spp. (Zhang et al. 2011; Sang et al. 2011). Adanya peningkatan pertumbuhan mikroflora menguntungkan tersebut berdampak sinergis pada fermentasi oligosakarida tidak tercerna, surplus cadangan energi, sintesis vitamin B dan K, produksi SCFA, perbaikan struktur dan fungsi saluran pencernaan, reduksi kolesterol dan stimulasi sistem imun lokal (GALT = gastrointestinal associated lymphoid tissue), dimana sekitar 60% dari total limfosit yang bekerja dalam sistem imun ikan difasilitasi oleh GALT, yang mengandung lamina propria dan limfosit intraepitelium (Iijima et al. 2001; Penders et al. 2006; Shadid et al. 2007). Perbaikan respons imun juga dimediasi melalui produksi SCFA (asam asetat dan laktat) oleh bakteri menguntungkan; SCFA ini menstimulus sistem imun, sehingga terjadi peningkatan proteksi dan resistensi ikan melawan infeksi patogen. Hal ini sejalan dengan hasil penelitian ini; suplementasi prebiotik dengan dosis 0.5-2% menunjukkan total leukosit dan aktivitas fagositik yang tinggi dan diikuti dengan mortalitas sebesar 0% pada perlakuan prebiotik 2%. Hasil tersebut mengindikasikan bahwa respons imun seluler dan status kesehatan ikan mas yang mengkonsumsi pakan yang mengandung prebiotik, mempunyai nilai yang lebih baik dibanding kontrol. Hasil positif pada parameter imunitas yang terjadi akibat suplementasi prebiotik juga dilaporkan oleh He et al. (2003), suplementasi prebiotik MOS dengan dosis 0.6% atau FOS pada hybrid tilapia mampu memperbaiki tingkat kelangsungan hidup dan aktivitas mekanisme pertahanan seluler khususnya aktivitas lisozim.

Prebiotik yang digunakan dalam penelitian ini menciptakan kondisi ideal untuk proliferasi beberapa strain bakteri yang diduga mempunyai potensi sebagai