BAHAN DAN METODE

2 KARAKTERISASI Bacillus sp. NP5 DAN APLIKASINYA SEBAGAI PROBIOTIK PADA IKAN MAS (Cyprinus carpio ) SEBAGAI PROBIOTIK PADA IKAN MAS (Cyprinus carpio)

BAHAN DAN METODE

Identifikasi Bacillus sp. NP5. Karakter fenotipik Bacillus sp. NP5 dievaluasi menggunakan kit api^® 50 CHB V4.0, bioMerieux, Marcy-I‟Etoile, France. Sedangkan karakter genotipik dievaluasi melalui amplifikasi gen penyandi 16S rRNA dengan primer 63f (5‟CAG GCC TAA CACATG CAA GTC-3‟) dan primer 1387r (5‟-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-„3) (Marchesi et al. 1998). Komposisi master mix PCR setiap tabung terdiri atas 25 µl GoTaq (Promega), 4 µl primer 63f, 4 µl primer 1387r, 17 µl ddH₂O dan DNA template yang diambil dengan tusuk gigi secara langsung dari isolat Bacillus sp. NP5. Kondisi PCR adalah sebagai berikut: pradenaturasi 95 ^oC selama 5 menit, denaturasi 95 ^oC selama 1 menit, annealing primer 55 ^oC selama 1 menit, elongation 72 ^oC selama 1 menit, dan post PCR pada suhu 72 ^oC selama 5 menit. Proses amplifikasi pada mesin PCR terdiri atas 30 siklus. Penghentian reaksi dilakukan dengan penurunan suhu ke 4 ^oC. Produk PCR dijalankan pada elektroforesis dengan gel agarose 1% dalam bufer TAE 1x pada 80 volt selama 45 menit, dilanjutkan visualisasi menggunakan UV transiluminator. Sekuensing dilakukan dengan mengirimkan DNA hasil amplifikasi ke perusahaan penyedia jasa sekuensing. Hasil sekuen disejajarkan dengan data base di Gene Bank menggunakan program BLAST-N online software (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Uji semi kuantitatif aktivitas amilolitik, proteolitik dan lipolitik. Pengujian ini bertujuan untuk mengukur kemampuan aktivitas amilolitik, proteolitik dan lipolitik bakteri probiotik melalui uji hidrolisis pati, susu skim dan minyak zaitun. Kemampuan hidrolisis ditandai dengan adanya zona bening di sekeliling koloni isolat.

Uji kuantitatif aktivitas amilolitik, proteolitik dan lipolitik. Enzim diperoleh melalui sentrifugasi kultur bakteri pada kecepatan 5000x g selama 30 menit. Aktivitas amilase diukur menurut metode Bernfeld (1955). Supernatan diukur aktivitas amilasenya secara kuantitatif dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm. Satu unit aktivitas amilase didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang menghasilkan gula pereduksi (maltose) sebanyak 1 mikromol per menit pada kondisi pengujian. Aktivitas protease diukur menggunakan metode Walter (1984). Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 578 nm dengan standar yang digunakan ialah L-tirosin 5 mM. Satu unit aktivitas protease didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mampu menghasilkan satu mikromol tirosin per menit. Aktivitas lipase diukur menggunakan metode Kwon and Rhee (1986). Pengukuran aktivitas lipase dilakukan menggunakan kurva standar asam margarat (asam heptadekanoat) yang diukur absorbansinya pada 715 nm. Satu unit aktivitas lipase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang membebaskan 1 mikromol asam lemak per mL per menit pada suhu 60 ^oC (Lampiran 1 dan 2).

10

Uji penghambatan bakteri Bacillus sp. NP5 terhadap bakteri patogen. Uji kemampuan penghambatan dilakukan berdasarkan metode Kirby-Bauer dan kultur bersama terhadap bakteri patogen A. hydrophila, Streptococcus agalactiae, dan Mycobacterium fortuitum. Uji penghambatan dengan metode Kirby-Bauer dilakukan menggunakan kertas cakram dengan mengukur zona hambatnya, sedangkan melalui metode kultur bersama dilakukan dengan menumbuhkan isolat Bacillus sp. NP5 bersama setiap isolat patogen yang telah diberi penanda resisten antibiotik pada media TSB (Trypticase Soy Broth), diikuti dengan penghitungan jumlah bakteri patogen yang tumbuh pada media TSA dengan suplementasi antibiotik penanda (Widanarni et al. 2003). Hasil penghambatan pertumbuhan bakteri patogen pada metode kultur bersama diketahui dengan membandingkan jumlah sel bakteri patogen pada tabung kultur bersama (kultur probiotik dan patogen) dengan jumlah sel bakteri patogen pada tabung kontrol (kultur patogen). Persiapan probiotik. Bakteri probiotik yang digunakan sebagai suplemen pakan dalam penelitian ini adalah Bacillus sp. NP5 yang sebelumnya telah diberi penanda antibiotik rifampisin (Bacillus sp. NP5 Rf^R) sebagai penanda molekuler (Widanarni et al. 2003). Probiotik ditumbuhkan dalam media TSB dan diinkubasi dalam waterbath shaker pada suhu 29-30 ^oC, 160 rpm selama 24 jam. Suspensi sel bakteri yang diperoleh kemudian disentrifugasi dan pellet sel bakteri kemudian dicuci dua kali menggunakan larutan Phosphate Buffer Saline (PBS).

Persiapan pakan eksperimen. Persiapan pakan eksperimen menggunakan pakan komersial dengan kadar protein 31% dilakukan dengan menambahkan tiga dosis probiotik (10⁶, 10⁸ dan 10¹⁰ CFU/mL) sebanyak 1% (v/w) ke dalam pakan. Pencampuran pakan dan probiotik dilakukan dengan menambahkan 2% putih telur sebagai binder, sementara pakan kelompok kontrol hanya ditambahkan 2% putih telur.

Pemeliharaan dan rancangan eksperimen. Penelitian ini dilakukan selama 45 hari, yakni 30 hari pemeliharaan dengan pakan eksperimen dan 14 hari masa uji tantang. Hewan uji yang digunakan yaitu ikan mas dengan bobot rata-rata 4.81±0.25 g yang sebelumnya telah diadaptasikan pada lingkungan percobaan selama 2 minggu. Ikan ditebar secara acak pada masing-masing akuarium perlakuan berukuran 65x40x40 (cm³) dengan kepadatan 15 ekor per akuarium. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap, terdiri dari lima perlakuan dengan tiga ulangan: kontrol (-) (pakan tanpa probiotik dan tanpa uji tantang), kontrol (+) (pakan tanpa probiotik dengan uji tantang), A (suplementasi pakan dengan dosis probiotik 10⁶ CFU/mL dengan uji tantang), B (suplementasi pakan dengan dosis probiotik 10⁸ CFU/mL dengan uji tantang), dan C (suplementasi pakan dengan dosis probiotik 10¹⁰ CFU/mL dengan uji tantang). Pemberian pakan perlakuan dilakukan sampai ikan kenyang (at satiation) dengan feeding frequency tiga kali sehari (08.00, 12.00, 16.00 WIB) selama 30 hari. Kualitas air dijaga dengan menyipon feses ikan dan pergantian air media pemeliharaan sebanyak 20% setiap hari. Kualitas air dimonitor selama pemeliharaan dengan parameter dan kisaran: suhu 28.0-28.5 ^oC, DO 7.2-8.1 mg/L, pH 7.4-8.04, dan TAN 0.0032-0.0065 mg/L.

Pengukuran jumlah populasi bakteri usus. Usus ikan ditimbang sebanyak 0.1 g dan dihomogenkan dalam 0.9 mL PBS. Selanjutnya, pengenceran serial dilakukan dalam PBS, kemudian setiap suspensi pengenceran (0.05 mL) disebar di atas media TSA untuk total bakteri dan TSA dengan suplementasi rifampisin

11 untuk probiotik Bacillus sp. NP5 Rf^R. Jumlah bakteri dalam sampel dapat ditentukan dengan menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada media dikalikan dengan faktor pengenceran (Madigan et al. 2003) dalam CFU/g.

Uji tantang. Setelah menerima pakan perlakuan selama 30 hari, ikan mas dari setiap perlakuan (kecuali pada perlakuan kontrol negatif) diuji tantang dengan A. hydrophila. Tujuan uji tantang adalah untuk mengevaluasi performa perlakuan probiotik dalam meningkatkan resistensi ikan mas terhadap infeksi A. hydrophila. Ikan mas diinfeksi dengan A. hydrophila pada konsentrasi 10⁷ CFU/mL sebanyak 0.1 mL/ekor. Infeksi dilakukan dengan cara injeksi secara intramuskular menggunakan siring volume 1 mL, kelompok kontrol negatif diinjeksi dengan PBS. Gejala klinis dan mortalitas ikan mas diamati selama 14 hari setelah injeksi.

Parameter eksperimen. Parameter eksperimen yang diukur terdiri dari populasi bakteri di usus, aktivitas enzim saluran pencernaan meliputi amilase, protease (Drapeau 1974) dan lipase (Debnath et al. 2007), kinerja pertumbuhan, respons imun, dan tingkat kelangsungan hidup ikan mas setelah uji tantang yang menggambarkan resistensi ikan terhadap infeksi. Parameter kinerja pertumbuhan yang diamati meliputi laju pertumbuhan harian (LPH) dan rasio konversi pakan (FCR). Populasi bakteri di usus meliputi jumlah total bakteri dan jumlah Bacillus sp. NP5 Rf^R. Kinerja pertumbuhan dan populasi bakteri di usus dievaluasi langsung setelah 30 hari perlakuan probiotik. Parameter respons imun yang diukur meliputi total leukosit, aktivitas fagositik (Balcazar et al. 2006), diferensial leukosit (limfosit, monosit dan neutrofil), hematokrit, hemoglobin dan total eritrosit. Respons imun dan tingkat kelangsungan hidup ikan diukur dua kali: setelah 30 hari pemberian pakan perlakuan (sebelum uji tantang), dan 14 hari setelah uji tantang.

Analisis data. Data yang diperoleh dianalisis secara statistik menggunakan software SPSS Statistic 17.0 dan uji lanjut dengan Uji Duncan untuk uji beda nyata (P<0.05).

HASIL

Identifikasi 16S-rRNA. Hasil identifikasi karakter fenotipik Bacillus sp. NP5 menggunakan kit api^® 50 CHB V4.0 menunjukkan bahwa isolat Bacillus sp. NP5 adalah spesies Bacillus cereus. Identifikasi berdasarkan hasil sekuensing parsial gen 16S-rRNA dan analisis BLAST-N pensejajaran 1250 bp juga menunjukkan bahwa isolat Bacillus sp. NP5 memiliki kedekatan dengan Bacillus cereus pada indeks similaritas sebesar 99% (Lampiran 3).

Aktivitas amilolitik, proteolitik dan lipolitik. Aktivitas enzim amilase, protease dan lipase Bacillus sp. NP5 diperoleh kisaran nilai indeks amilolitik (IA) 0.49, proteolitik (IP) 0.2 dan lipolitik (IL) 1.31 (Tabel 1). Aktivitas tertinggi amilase tercapai pada 48 jam pengamatan yaitu sebesar 0.044 U/mg protein, protease pada 96 jam (0.0030 U/mg protein), dan lipase diamati hanya sampai pada 24 jam (0.062 U/mg protein) (Tabel 2).

Uji penghambatan bakteri Bacillus cereus NP5 terhadap bakteri patogen. Hasil uji kemampuan penghambatan bakteri probiotik Bacillus sp. NP5 terhadap bakteri patogen A. hydrophila, S. agalactiae dan M. fortuitum menunjukkan bahwa probiotik Bacillus sp. NP5 memiliki aktivitas penghambatan terhadap bakteri patogen tersebut dengan nilai indeks penghambatan

masing-12

masing sebesar 0.4, 0.7 dan 0.2 (Tabel 3) serta mampu mereduksi patogen tersebut sebesar 66.1%, 98.81% dan 30% (Tabel 4).

Tabel 1. Indeks potensial amilolitik, proteolitik dan lipolitik Bacillus sp. NP5 Parameter Diameter zona

bening (cm) Diameter koloni bakteri (cm) Nilai indeks potensial Amilolitik 0.93±0.13 0.63±0.13 0.49±0.1 Proteolitik 1.2±0.1 1±0.1 0.20±0.02 Lipolitik 3.53±0.08 1.53±0.08 1.31±0.07

Tabel 2. Aktivitas enzim amilase, protease dan lipase Bacillus sp. NP5 pada waktu berbeda

Waktu ^{Enzim amilase}

(U/mg protein) Enzim protease (U/mg protein) Enzim lipase (U/mg protein) 18 jam 0.000±0.0 0.0009±0.0 0.054±0.001 21 jam 0.001±0.0 0.0008±0.0001 0.060±0.001 24 jam 0.029±0.001 0.0012±0.0001 0.062±0.0 48 jam 0.044±0.0 0.0027±0.0 NA 72 jam 0.035±0.001 0.0014±0.0 NA 96 jam 0.024±0.0 0.0030±0.0001 NA

NA: not analyzed

Tabel 3. Aktivitas penghambatan Bacillus sp. NP5 terhadap bakteri patogen dengan metode Kirby-Baeuer

Patogen/Parameter ^{Diameter zona}

bening (cm) Diameter koloni bakteri (cm) Indeks penghambatan A. hydrophila 1.33±0.15 0.93±0.15 0.43±0.07 S. agalactiae 1.7±0.1 1.0±0.1 0.71±0.07 M. fortuitum 1.53±0.1 1.33±0.1 0.15±0.01

Populasi bakteri di usus. Suplementasi probiotik melalui pakan pada ikan mas selama 30 hari secara signifikan (P<0.05) berpengaruh terhadap populasi bakteri di dalam usus ikan. Nilai tertinggi dari jumlah total bakteri di usus ikan terdapat pada perlakuan C yang tidak berbeda nyata (P>0.05) dengan perlakuan B, tetapi berbeda nyata (P<0.05) dengan kontrol dan perlakuan A. Selain itu, nilai tertinggi untuk total bakteri probiotik Bacillus sp. NP5 di usus ikan juga terdapat pada perlakuan C yang berbeda nyata (P<0.05) dengan semua perlakuan (Tabel 5).

Aktivitas enzim pencernaan dan performa pertumbuhan. Aktivitas enzim pencernaan (amilase, protease dan lipase) pada perlakuan probiotik dosis 10¹⁰ CFU/mL signifikan lebih tinggi (P<0.05) dibandingkan dengan kontrol (Tabel 6). Ada perbedaan yang signifikan pada laju pertumbuhan harian antara perlakuan C dengan kontrol dan perlakuan A (P<0.05), tetapi tidak berbeda nyata (P>0.05) dengan perlakuan B. Nilai FCR pada perlakuan probiotik lebih rendah (P<0.05) dibandingkan dengan kontrol, tetapi tidak terdapat perbedaan (P>0.05) antar perlakuan probiotik (Tabel 7).

13 Tabel 4. Aktivitas penghambatan Bacillus sp. NP5 terhadap bakteri patogen

dengan metode kultur bersama

Patogen ^{Jumlah koloni bakteri}

patogen (cfu/mL)

Persentase penghambatan (%)

A. hydrophila (tabung kontrol) 2.35x10⁹±1.65x10⁸

A. hydrophila (tabung campuran) 8x10⁸±5x10⁷ 66.1±0.04

S. agalactiae (tabung kontrol) 1x10¹⁰±9x10⁸

S. agalactiae (tabung campuran) 1.18x10⁸±2.05x10⁷ 98.8±0.3

M. fortuitum (tabung kontrol) 1x10¹⁰±6x10⁸

M. fortuitum (tabung campuran) 7x10⁹±4.5x10⁸ 29.85±1.48

Tabel 5. Total bakteri dan total Bacillus sp. NP5 di usus ikan mas yang diberi probiotik setelah 30 hari pemeliharaan

Parameter/

Perlakuan ^{Kontrol A (10}

6

cfu/mL) B (10⁸ cfu/mL) C (10¹⁰ cfu/mL) Total bakteri (log cfu/g) 7.70±0.03^a 8.85±0.03^b 9.78±0.06^c 10.28±0.03^d Total Bacillus sp. NP5 (log cfu/g) not detected 7.03±0.08^a 8.38±0.08^b 9.43±0.08^c

Keterangan: huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan pengaruh perlakuan yang berbeda nyata (uji jarak berganda Duncan; P<0.05). Nilai yang tertera merupakan nilai rata-rata dan simpangan baku.

Tabel 6. Aktivitas enzim pencernaan (U/mg protein) ikan mas yang diberi probiotik dengan kepadatan 10¹⁰ CFU/mL sebanyak 1%

Parameter/Perlakuan Probiotik Kontrol

Amilase 0.77±0.03^b 0.50±0.03^a

Protease 0.07±0.002^b 0.04±0.004^a

Lipase 0.80±0.03^b 0.47±0.04^a

Keterangan: huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan pengaruh perlakuan yang berbeda nyata (uji jarak berganda Duncan; P<0.05). Nilai yang tertera merupakan nilai rata-rata dan simpangan baku.

Tingkat kelangsungan hidup, respons imun dan resistensi. Tingkat kelangsungan hidup ikan sebelum uji tantang berkisar antara 80-100%. Namun, tingkat kelangsungan hidup ikan setelah uji tantang pada semua perlakuan probiotik dan kontrol negatif lebih tinggi (P<0.05) dibanding dengan kontrol positif. Tingkat kelangsungan hidup yang diperoleh pada kontrol negatif, A, B, dan C masing-masing adalah 92.49, 80.59, 88.09 dan 100%, sedangkan pada kontrol positif hanya 51.28%. Nilai total leukosit, aktivitas fagositik, hemoglobin dan total eritrosit sebelum uji tantang pada perlakun C lebih tinggi (P<0.05) dibandingkan dengan perlakuan A dan B serta kontrol. Nilai total leukosit setelah uji tantang pada perlakuan B dan C lebih tinggi (P<0.05) dibandingkan dengan perlakuan A dan kontrol. Hemoglobin dan total eritrosit ikan pada semua perlakuan yang diinjeksi dengan patogen mengalami penurunan pada akhir uji tantang (Tabel 8 dan 9).

14

Tabel 7. Kinerja pertumbuhan ikan mas yang diberi probiotik setelah 30 hari pemeliharaan Parameter/Perlakuan Kontrol A (10⁶ cfu/mL) B (10⁸ cfu/mL) C (10¹⁰ cfu/mL) Laju pertumbuhan harian (%) 1.40±0.05^a 1.52±0.25^a 2.33±0.05^b 2.91±0.13^c

Rasio konversi pakan 2.55±0.1^a 1.72±0.1^b 1.66±0.18^b 1.54±0.02^b

Keterangan: huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan pengaruh perlakuan yang berbeda nyata (uji jarak berganda Duncan; P<0.05). Nilai yang tertera merupakan nilai rata-rata dan simpangan baku.

Tabel 8. Tingkat kelangsungan hidup dan parameter imunitas ikan mas yang diberi probiotik setelah 30 hari pemeliharaan

Parameter K- K+ ^{A (10} 6 cfu/mL) B (10⁸ cfu/mL) C (10¹⁰ cfu/mL) TKH (%) 93.33±6.67^ab 86.67±6.67^a 91.11±3.85^ab 95.55±3.85^ab 100.00±0.00^b Total Leukosit (x10⁴ sel/mm³) ^13.9±0.53 a 13.1±0.3^a 21±2.65^b 21.5±2.12^b 31.5±1.92^c Total Eritrosit (x10⁶ sel/mm³) ^1.5±0.03 a 1.54±0.05^a 1.73±0.03^b 1.96±0.03^c 2.76±0.04^d Hematokrit (%) 34±3.61^a 34±1^a 33±2.65^a 30±3^a 34±3.61^a Hemoglobin (g%) 6.6±0.27^a 6.25±0.04^a 6.2±0.04^a 6.5±0.17^a 7.6±0.27^b Aktivitas fagositik (%) ^27±2.65 a 26±1.73^a 17±2.65^b 25±2^a 64±2.65^c

Keterangan: huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan pengaruh perlakuan yang berbeda nyata (uji jarak berganda Duncan; P<0.05). Nilai yang tertera merupakan nilai rata-rata dan simpangan baku.

Tabel 9. Tingkat kelangsungan hidup dan parameter imunitas ikan mas yang diberi probiotik setelah uji tantang dengan Aeromonas hydrophila

Parameter K- K+ ^{A (10} 6 cfu/mL) B (10⁸ cfu/mL) C (10¹⁰ cfu/mL) TKH (%) 92.49±7.7^ab 51.28±2.22^c 80.59±3.49^a 88.09±10.91^ab 100.00±0.00^b Total Leukosit (x10⁴ sel/mm³) ^34.2±0.3 a 14.9±0.82^b 34.3±0.36^a 36.9±0.36^a 37±2.65^a Total Eritrosit (x10⁶ sel/mm³) ^1.12±0.06 a 1.04±0.04^a 1.43±0.04^b 1.32±0.07^b 1.08±0.05^a Hematokrit (%) 31±2.65^a 20±3^b 34±1.73^a 28±2^a 31±2.65^a Hemoglobin (g%) 6±0.4^a 5±0.06^b 6±0.5^a 5.1±0.15^b 4.7±0.1^b Aktivitas fagositik (%) ^26±2.65 a 36±3.61^b 31±1.73^ab 36±4^b 66±3.61^c

Keterangan: huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan pengaruh perlakuan yang berbeda nyata (uji jarak berganda Duncan; P<0.05). Nilai yang tertera merupakan nilai rata-rata dan simpangan baku.

PEMBAHASAN

Identifikasi gen 16S-rRNA merupakan suatu pendekatan secara molekuler yang dilakukan untuk mengetahui spesies dari isolat bakteri berdasarkan kemiripan sekuen gen dengan data pada Gene Bank. Berdasarkan distribusi hasil BLAST-N isolat Bacillus sp. NP5 memiliki nilai homologi sebesar 99% dengan

15 Bacillus cereus. Homologi menunjukkan bahwa sekuen tersebut memiliki hubungan evolusi (Pertsemlidis dan Fondon III 2002). Bacillus sp. NP5 digunakan sebagai probiotik terkait dengan kemampuannya menghasilkan enzim-enzim pencernaan seperti amilase, protease, dan lipase. Di samping itu, probiotik ini juga memiliki aktivitas penghambatan terhadap beberapa bakteri patogen akuakultur antara lain A. hydrophila, S. agalactiae dan M. fortuitum.

Introduksi setiap jenis bakteri ke dalam usus harus mampu berkompetisi dengan mikroflora residen yang sudah terbentuk dengan niche ekologi (nutrien dan tempat perlekatan) agar dapat bertahan hidup. Strain probiotik harus mampu menempel pada lapisan mukus usus dan memanfaatkan mukus sebagai sumber nutrien untuk berkolonisasi, bersifat persisten dan mampu berproliferasi dalam saluran pencernaan ikan (Merrifield et al. 2010). Kemampuan Bacillus sp. NP5 untuk bertahan hidup dalam usus ikan mas ditunjukkan dengan data jumlah bakteri di usus ikan; jumlah bakteri pada perlakuan probiotik lebih tinggi dibanding dengan kontrol. Probiotik yang merupakan mikroflora usus yang ikut berperan dalam mekanisme resistensi inang terhadap kondisi stress dan patogen; melalui stimulasi respons imun, produksi substansi antimikroorganisme spesifik (bakteriosin), merilis produk metabolik seperti asam lemak rantai pendek (SCFA) yang menyebabkan pH cairan usus menurun sampai tingkat di bawah kondisi optimum untuk pertumbuhan patogen, memperbaiki sel-sel epitelium usus dan mekanisme aksi sel-sel pertahanan tubuh.

Efek signifikan probiotik terhadap aktivitas enzim saluran pencernaan ikan mas terlihat lebih baik pada ikan yang mengkonsumsi pakan mengandung probiotik, karena probiotik mampu memperbaiki kecernaan protein, karbohidrat dan lemak. Hal ini lebih diperjelas dengan nilai laju pertumbuhan harian dan FCR yang lebih baik. Hasil penelitian ini memperlihatkan bahwa bakteri probiotik Bacillus sp. NP5 mampu membantu proses pencernaan yang dibuktikan dengan pertumbuhan ikan yang lebih baik karena menghasilkan berbagai macam enzim ekstraseluler, antara lain amilase, protease dan lipase sehingga memudahkan penyerapan serta pemanfaatan nutrien menjadi lebih efisien. Hal ini sejalan dengan hasil penelitian Bairagi et al. (2002) yang menyatakan bahwa Bacillus sp. yang diisolasi dari usus C. carpio memiliki aktivitas amilolitik, proteolitik dan lipolitik ekstraseluler dalam jumlah yang tinggi. Efek suplementasi probiotik terhadap perbaikan kecernaan juga telah diteliti pada berbagai jenis ikan (Tovar-Ramirez et al. 2004). Enzim protease yang disekresikan oleh probiotik berfungsi untuk memecah ikatan-ikatan peptida dalam protein, selanjutnya memecah dengan rinci menjadi unsur inti protein berupa monomer-monomer dan asam-asam amino bebas, yang sangat bermanfaat untuk perbaikan status nutrisional ikan. Bakteri probiotik Bacillus sp. NP5 juga mampu mensekresi lipase yang memicu produksi dan asimilasi asam-asam lemak esensial, sehingga menghasilkan pertumbuhan dan imunitas ikan mas yang lebih tinggi. Asam-asam lemak esensial tidak hanya menjadi booster bagi sistem imun, tetapi juga memicu pertumbuhan (Sharma et al. 2009). Hidrolisis enzimatik bakterial menghasilkan peningkatan pertumbuhan ikan mas dan didukung dengan nilai FCR yang lebih rendah, menunjukkan ketersediaan biologik protein dan lemak yang meningkat. Amilase dan lipase merupakan enzim-enzim utama yang terkait dengan pemecahan karbohidrat dan lemak. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas amilase, protease dan lipase lebih tinggi pada ikan yang diberi pakan mengandung probiotik dibanding kontrol.

16

Aktivitas enzim amilase, protease dan lipase pada perlakuan probiotik diduga sebagian besar adalah hasil stimulasi oleh probiotik, sehingga mendorong eksoenzim untuk mensintesis endoenzim pencernaan yang akhirnya bersinergi memperbaiki kecernaan nutrien dan performa pertumbuhan serta FCR.

Dosis probiotik merupakan faktor pembatas untuk mencapai efek menguntungkan yang optimum (Minelli dan Benini 2008). Dosis probiotik akuakultur umumnya berkisar 10⁶-10¹⁰ CFU/g pakan dengan dosis optimum bervariasi tergantung pada jenis ikan dan tipe parameter imun yang diamati. Konsentrasi optimum tidak hanya diindikasikan oleh kolonisasi dan proliferasi bakteri di dalam usus, tetapi juga oleh pertumbuhan, respons imun dan proteksi terhadap inang. Dosis efektif strain probiotik Bacillus sp. yaitu 2x10⁸ CFU/g pakan pada Oncorhynchus mykiss, menghasilkan persentase mortalitas yang rendah setelah uji tantang dengan bakteri patogen (Brunt et al. 2007). Aktivitas fagositik meningkat tinggi pada O. mykiss yang diberi Lactobacillus rhamnosus dengan dosis 10¹¹ CFU/g pakan selama 30 hari, tetapi menurun pada dosis 10⁹ CFU/g pakan (Panigrahi et al. 2004). Dosis terbaik probiotik Lactobacillus plantarum untuk meningkatkan pertumbuhan, respons imun dan proteksi pada grouper (Epinephelus coioides) adalah 10⁸ CFU/g pakan; dosis ini menunjukkan hasil yang lebih baik dibanding dosis 10⁶ dan 10¹⁰ CFU/g pakan (Son et al. 2009). Dosis yang rendah tidak berhasil merangsang kinerja pertumbuhan maksimum dan sistem imun seluler terkait dengan kurangnya kapasitas kolonisasi, namun pada dosis tinggi dapat menyebabkan mortalitas yang tinggi, seperti pada O. mykiss yang diberi L. rhamnosus dengan dosis 10¹² CFU/g pakan, tetapi hal tersebut tidak terjadi pada dosis 10⁹ CFU/g pakan (Nikoskelainen et al. 2001).

Penambahan probiotik (10⁶– 10¹⁰ CFU/mL) dapat mereduksi jumlah pakan yang dibutuhkan untuk pertumbuhan ikan mas, sehingga menghasilkan pengurangan biaya produksi. Pemberian probiotik Lactobacillus casei dengan dosis 5x10⁷ selama 30 hari dan 5x10⁸ selama 60 hari secara signifikan dapat memperbaiki performa pertumbuhan Barbus gryprus, antara lain pada laju pertumbuhan harian dan FCR (Vand et al. 2014). Pemberian probiotik L. plantarum pada pakan ikan Labeo rohita dengan dosis 10⁸ dan 10¹⁰ CFU/g pakan dapat meningkatkan pertambahan bobot tubuh harian dan FCR serta menunjukkan peningkatan yang nyata pada SGR (Giri et al. 2013). Hasil yang sama juga ditemukan pada Epinephelus coioides (Son et al. 2009), tilapia nilotica (Oreochromis niloticus) (Aly et al. 2008), gilthead sea bream (Sparus aurata) (Suzer et al. 2008), Clarias gariepinus (Al-Dohail et al. 2009) dan Macrobrachium rosenbergii (Venkat et al. 2004). Suplementasi probiotik komersial Streptococcus faecium mampu memperbaiki pertumbuhan dan efisiensi pakan pada Israeli carp dibandingkan antibiotik dan ragi (Saccharomyces cerevisiae) (Bogut et al. 1998); hal tersebut juga terjadi pada mamalia tingkat tinggi, khususnya pada babi (Bertin et al. 1997). Peningkatan dosis probiotik juga menunjukkan pengaruh terhadap keberadaan bakteri dalam usus ikan mas; dosis yang lebih tinggi menunjukkan jumlah bakteri yang lebih banyak. Kemampuan bertahan hidup Bacillus yang cukup tinggi dalam sel-sel mukosa usus dapat disebabkan oleh mekanisme eliminasi kompetitif terhadap bakteri lain, terutama bakteri patogen potensial yang telah dibuktikan pada hasil uji hambat (in vitro) probiotik terhadap beberapa patogen potensial. Probiotik ini mempunyai kemampuan antagonistik terhadap A. hydrophila yang merupakan patogen residen

17 ikan-ikan air tawar (Gonzalez et al. 1999), melalui produksi senyawa-senyawa inhibitor. Peningkatan populasi probiotik dapat menghasilkan sejumlah produk fermentatif seperti laktat dan asetat yang menyebabkan reduksi pH cairan usus di bawah kondisi optimum bagi mikroekofisiologi patogen. Oleh karena itu, suplementasi Bacillus sp. NP5 dapat meningkatkan proteksi dan resistensi ikan mas terhadap suatu patogen dengan tingkat kelangsungan hidup yang tinggi.

Suplementasi probiotik dapat meningkatkan respons imun seluler ikan mas sehingga memudahkan eliminasi patogen potensial dalam jaringan usus. Sitotoksisitas A. hydrophila dan akumulasi produk ekstraselulernya (α dan β hemolisin; aerolisin; enterotoksin ACT, ALT dan AST, protease serta Rnase) menyebabkan nekrotik eritrosit, hemolisis eritrosit dan ion besi (Rey et al. 2009), sehingga menimbulkan adanya penurunan jumlah sel darah merah ikan uji. Hal tersebut sesuai dengan hasil penelitian ini, total eritrosit ikan mas yang terinfeksi A. hydrophila mengalami penurunan dari total eritrosit ikan mas sebelum mendapatkan infeksi. Probiotik berinteraksi dengan sel-sel fagositik mononuklear (monosit dan makrofag) dan polimorfonuklear leukosit (neutrofil) serta sel-sel natural killer. Probiotik dapat bertindak sebagai trigger yang efektif bagi sel-sel fagositik sehingga meningkatkan aktivitas fagositik, seperti pada ikan nila (Oreochromis niloticus) yang diberi pakan mengandung L. rhamnosus selama 2 minggu (Pirarat et al. 2006). Peningkatan aktivitas fagositik juga terjadi pada gilthead sea bream (Sparus aurata L.) yang diberi pakan mengandung Lactobacillus delbrueckii spp. lactis (CECT 287) dengan dosis sebanyak 10⁷ CFU/g pakan selama 14 hari (Salinas et al. 2005). Fagositosis bertanggung jawab untuk aktivasi awal respons inflamasi sebelum produksi antibodi terjadi, dan bertindak sebagai mediator sel-sel fagositik (neutrofil, monosit dan makrofag). Aktivasi in vivo sel-sel fagositik oleh imunomodulator juga menyebabkan sekresi sejumlah besar molekul-molekul biologik aktif seperti enzim-enzim inhibitor, peptida kationik, komponen komplemen, produksi oksigen reaktif spesies (ROS = reactive oxygen species) dan nitrat oksida sintase (NOS = nitric-oxide synthase) yang seluruhnya terlibat dalam aktivitas bakterisidal (Kwak et al. 2003). Pemberian probiotik Bacillus sp. NP5 dapat meningkatkan sel-sel fagositik aktif dan total leukosit. Stresor menimbulkan respons stres pada leukosit untuk semua vertebrata termasuk ikan (Davis 2008). Peningkatan jumlah total leukosit diduga dapat pula disebabkan oleh ikan mengalami stres akibat setiap hari mengkonsumsi pakan mengandung probiotik yang dikenali sebagai benda asing. Seiring dengan meningkatnya jumlah leukosit pada dosis probiotik 10¹⁰ CFU/mL, mortalitas ikan menunjukkan nilai yang lebih rendah setelah uji tantang dengan patogen, mengindikasikan adanya peningkatan status kesehatan ikan yang mengkonsumsi pakan mengandung probiotik.

SIMPULAN

1. Bacillus sp. NP5 teridentifikasi sebagai Bacillus cereus dengan indeks similaritas 99% dan berpotensi sebagai probiotik untuk ikan mas.

2. Dosis terbaik Bacillus sp. NP5 yang menghasilkan kinerja pertumbuhan, respons imun dan resistensi ikan mas terhadap infeksi Aeromonas hydrophila adalah 10¹⁰ CFU/mL sebanyak 1% (v/w).

18