Kinerja Pertumbuhan Dan Status Kesehatan Ikan Mas (Cyprinus Carpio) Yang Diberi Probiotik, Prebiotik Dan Sinbiotik

(1)

KINERJA PERTUMBUHAN DAN STATUS KESEHATAN

IKAN MAS (

Cyprinus carpio

) YANG DIBERI PROBIOTIK,

PREBIOTIK DAN SINBIOTIK

RICKY DJAUHARI

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)

(3)

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Kinerja Pertumbuhan dan Status Kesehatan Ikan Mas (Cyprinus carpio) yang diberi Probiotik, Prebiotik dan Sinbiotik adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

(4)

RINGKASAN

RICKY DJAUHARI. Kinerja Pertumbuhan dan Status Kesehatan Ikan Mas (Cyprinus carpio) yang Diberi Probiotik, Prebiotik dan Sinbiotik. Dibimbing oleh WIDANARNI, SUKENDA, MUHAMMAD AGUS SUPRAYUDI, dan MUHAMMAD ZAIRIN JR.

Ikan mas (Cyprinus carpio) merupakan salah satu komoditas akuakultur penting yang populer dibudidayakan di Indonesia. Dalam perkembangan budidayanya, sebagian besar sentra produksi mengalami serangan penyakit Motile Aeromonad Septicaemia (MAS) yang disebabkan oleh bakteri Aeromonas hydrophila. Penyakit MAS menyebar sangat cepat dan mengakibatkan mortalitas sekitar 25%, namun angka ini dapat jauh lebih tinggi mencapai sekitar 80% pada budidaya dengan kepadatan tinggi dan kualitas air buruk. Antibiotik sudah sering digunakan untuk menghambat dan mencegah bakteri patogen berkembang, namun beresiko tinggi dengan meningkatnya strain bakteri resisten, terganggunya keseimbangan normal mikroflora usus dan residunya banyak terakumulasi pada ikan dan lingkungan perairan. Penggunaan probiotik merupakan salah satu alternatif ramah lingkungan untuk mereduksi penggunaan antibiotik karena dapat memodifikasi komunitas mikroba, menghambat pertumbuhan atau berkompetisi dengan patogen, memperbaiki nilai nutrisi, memperbaiki kualitas lingkungan, serta dapat meningkatkan respons imun. Peran bakteri probiotik tersebut dapat ditingkatkan melalui aplikasi prebiotik, yaitu bahan pangan yang tidak dapat dicerna yang memberikan efek menguntungkan bagi inangnya dengan cara merangsang pertumbuhan dan aktivitas sejumlah bakteri tertentu di usus sehingga meningkatkan kesehatan inang. Beberapa hasil penelitian menunjukkan bila probiotik dan prebiotik digabung dalam suatu produk tunggal (sinbiotik) maka manfaatnya menjadi meningkat.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi kinerja pertumbuhan dan status kesehatan ikan mas yang diberi probiotik Bacillus sp. NP5, prebiotik dari ekstrak ubi jalar (Ipomoea batatas L.) varitas Sukuh dan gabungan keduanya (sinbiotik) terhadap infeksi bakteri A. hydrophila. Secara garis besar untuk menjawab tujuan tersebut, penelitian dibagi dalam empat tahap, yaitu: 1. Karakterisasi Bacillus sp. NP5 dan aplikasinya sebagai probiotik pada ikan mas, 2. Ekstraksi prebiotik dari ubi jalar dan aplikasinya pada ikan mas 3. Kinerja pertumbuhan dan status kesehatan ikan mas yang diberi probiotik Bacillus sp. NP5, prebiotik dari ubi jalar dan sinbiotik 4. Mikroenkapsulasi sinbiotik dan aplikasinya untuk meningkatkan kinerja pertumbuhan ikan mas yang dipelihara pada kondisi lapangan di kolam.

(5)

107 CFU/mL (0.1 mL/ekor) dan resistensi ikan diamati dengan menghitung kelangsungan hidup ikan sampai pada hari ke-45. Hasil identifikasi fenotipik dan genotipik isolat Bacillus sp. NP5 menunjukkan bahwa isolat tersebut adalah Bacillus cereus dengan indeks similaritas 99%. Secara in vitro isolat Bacillus cereus NP5 mampu menghasilkan enzim protease, amilase, dan lipase serta berpotensi menghambat bakteri patogen A. hydrophila, Streptococcus agalactiae, dan Mycobacterium fortuitum. Suplementasi pakan mengandung probiotik dengan dosis 1010 CFU/mL sebanyak 1% menghasilkan peningkatan jumlah total bakteri dan total probiotik di usus serta aktivitas enzim amilase, protease dan lipase yang disertai dengan laju pertumbuhan harian tertinggi dan konversi pakan terendah (P<0.05). Total leukosit dan aktivitas fagositik pada perlakuan dosis probiotik 1010 CFU/mL lebih tinggi (P<0.05) dibanding kontrol di akhir masa pemeliharaan selama 30 hari. Ikan mas yang diberi pakan mengandung probiotik menunjukkan tingkat kelangsungan hidup setelah uji tantang dengan nilai yang berkisar antara 81-100%, sedangkan tingkat kelangsungan hidup ikan tanpa pemberian probiotik hanya sebesar 51.28%. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa suplementasi probiotik Bacillus cereus NP5 pada ikan mas dapat meningkatkan kinerja pertumbuhan, respons imun dan resistensi ikan mas terhadap penyakit akibat infeksi A. hydrophila, dengan hasil terbaik pada suplementasi probiotik dosis 1010 CFU/mL sebanyak 1%.

Penelitian tahap kedua bertujuan untuk mengekstraksi prebiotik dari ubi jalar varitas Sukuh dan mengevaluasi efektivitasnya terhadap kinerja pertumbuhan dan status kesehatan ikan mas sebelum serta setelah diinfeksi A. hydrophila. Prebiotik diberikan pada ikan mas melalui pakan secara at satiation tiga kali sehari selama 30 hari dengan dosis 0.5, 1 dan 2% (v/w). Parameter yang diamati selama aplikasi prebiotik meliputi populasi dan jenis bakteri dominan di usus, aktivitas enzim pencernaan, kinerja pertumbuhan, dan respons imun. Pada hari ke-32, ikan mas diuji tantang dengan injeksi bakteri patogen A. hydrophila secara intramuskular dengan dosis 107 CFU/mL (0.1 mL/ekor) dan resistensi ikan diamati dengan menghitung kelangsungan hidup ikan sampai pada hari ke-45. Suplementasi pakan mengandung prebiotik dengan dosis 2% menunjukkan pengaruh yang signifikan (P<0.05) terhadap jumlah total bakteri di usus dan aktivitas enzim protease, serta menghasilkan laju pertumbuhan harian dan konversi pakan terbaik (P<0.05) dibanding kontrol dan perlakuan lainnya. Bakteri yang tumbuh dominan di usus teridentifikasi sebagai Bacillus pumilus, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus hominis, Aeromonas veronii dan Kocuria rhizophila. Pada akhir pemeliharaan, nilai total leukosit dan aktivitas fagositik pada perlakuan prebiotik 2% lebih tinggi dibanding kontrol. Kelangsungan hidup ikan mas setelah uji tantang pada perlakuan prebiotik 1% dan 2% mencapai 87% dan 100%, sedangkan pada ikan tanpa pemberian prebiotik hanya sebesar 51.11%. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa suplementasi prebiotik pada ikan mas dapat meningkatkan kinerja pertumbuhan, respons imun dan resistensi ikan mas terhadap infeksi A. hydrophila, dengan hasil terbaik pada suplementasi prebiotik 2%.

(6)

selama 30 hari. Sinbiotik dibuat dengan menggabungkan probiotik dosis 1010 CFU/mL sebanyak 1% (v/w) dan prebiotik dosis 2% (v/w). Parameter yang diamati selama aplikasi probiotik, prebiotik dan sinbiotik meliputi total bakteri dan total Bacillus cereus NP5 di usus, aktivitas enzim pencernaan, kinerja pertumbuhan, biokimia darah dan respons imun. Pada hari ke-32, ikan mas diuji tantang dengan injeksi bakteri patogen A. hydrophila secara intramuskular dengan dosis 105 CFU/mL (0.1 mL/ekor) dan resistensi ikan diamati dengan menghitung kelangsungan hidup ikan sampai pada hari ke-45. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa parameter kinerja pertumbuhan termasuk aktivitas enzim saluran pencernaan, laju pertumbuhan harian, rasio konversi pakan, kecernaan protein dan total, retensi protein, dan retensi lemak pada perlakuan probiotik, prebiotik, dan sinbiotik lebih tinggi dari kontrol, dengan nilai tertinggi diperoleh pada perlakuan sinbiotik. Glikogen hati dan otot pada perlakuan probiotik dan sinbiotik berbeda nyata dibanding kontrol. Parameter respons imun sebelum dan sesudah uji tantang pada pada perlakuan probiotik, prebiotik, dan sinbiotik lebih baik dari kontrol positif; diikuti dengan nilai tingkat kelangsungan hidup ikan uji yang lebih tinggi (66.67-80.00%) dibanding kontrol positif (46.67%). Kombinasi probiotik Bacillus cereus NP5 dosis 1010 CFU/mL sebanyak 1% (v/w) dengan prebiotik dari ekstrak ubi jalar 2% (v/w) dapat meningkatkan kinerja pertumbuhan, respons imun dan resistensi ikan mas terhadap infeksi A. hydrophila.

Penelitian tahap keempat bertujuan untuk mengevaluasi viabilitas sel probiotik Bacillus cereus NP5 dalam mikrokapsul sinbiotik serta menentukan dosis terbaiknya untuk meningkatkan kinerja pertumbuhan dan status kesehatan ikan mas yang dipelihara pada kondisi lapangan di kolam. Sinbiotik yang digunakan pada penelitian ini adalah kombinasi probiotik Bacillus cereus NP5 dosis 1010 CFU/mL sebanyak 1% (v/w) dan prebiotik dari ekstrak ubi jalar sebanyak 2% (v/w). Mikroenkapsulasi sinbiotik dilakukan menggunakan teknik spray drying dengan komposisi bahan meliputi sinbiotik, protein whey dan maltodekstrin (1:1:10%) (v/v/w). Mikrokapsul sinbiotik diberikan pada ikan mas melalui pakan secara at satiation tiga kali sehari yang dipelihara di kolam selama 30 hari dengan dosis 0.5, 1 dan 2%. Parameter yang diamati selama aplikasi mikroenkapsulasi sinbiotik meliputi viabilitas sel probiotik Bacillus cereus NP5 sebelum dan setelah proses mikroenkapsulasi serta setelah satu bulan penyimpanan, total bakteri dan total Bacillus cereus NP5 di usus, kinerja pertumbuhan dan respons imun ikan mas. Hasil penelitian menunjukkan bahwa viabilitas sel probiotik dalam mikrokapsul sinbiotik relatif stabil dengan konsentrasi sebelum dan setelah penyimpanan satu bulan mencapai 8.83±0.03 log CFU/g dan 8.79±0.02 log CFU/g. Suplementasi mikrokapsul sinbiotik melalui pakan mampu meningkatkan kinerja pertumbuhan dan status kesehatan ikan mas dengan hasil terbaik diperoleh pada dosis 1%.

(7)

(8)

SUMMARY

RICKY DJAUHARI. Growth Performances and Health Status of Common Carp (Cyprinus carpio) Supplemented Probiotic, Prebiotic and Synbiotic. Supervised by WIDANARNI, SUKENDA, MUHAMMAD AGUS SUPRAYUDI, and MUHAMMAD ZAIRIN JR.

The common carp (Cyprinus carpio) is one of the oldest aquaculture species and the economically important species, which is popular in Indonesia. In the development of the common carp cultivation, most of the production centers face obstacles by the attack of Motile Aeromonad Septicaemia (MAS) caused by Aeromonas hydrophila. This disease spreads quickly and result in mortality of about 25%, but it can be higher of about 80% in the cultivation with high density and poor water quality.

Antibiotics have been commonly used to inhibit and to prevent the growth of pathogenic bacteria, but they have a high risk with the increase of resistant bacterial strains, the disruption of the normal balance of intestinal microflora and the accumulation of their residues in fish and aquatic environment. The use of probiotics is one of the eco-friendly approaches to reduce the use of antibiotics, because probiotics can modify the microbial communities, inhibit the growth of pathogens or compete with pathogens, improve the feed nutritional value, the environmental quality and the immune response of the host. The role of probiotics can be increased through the application of prebiotics, a food material which cannot be digested providing beneficial effects to the host by stimulating the growth and the activity of a number of certain bacteria in the gut in order to improve the health of the host. Several studies have reported that when probiotic and prebiotic are combined in a single product (synbiotic), the benefits will be increased.

The aim of this study was to evaluate the growth performances and the health status of common carp supplemented with Bacillus sp. NP5, prebiotic from the extract of sweet potato (Ipomoea batatas L.) varietas Sukuh and the combination of those (synbiotic) to prevent the infection of A. hydrophila. To reach that aim, this study was divided into four phases: 1. Characterization of Bacillus sp. NP5 and evaluation of its application as probiotic for common carp, 2. Extraction of prebiotic from sweet potato varietas Sukuh and evaluation of its application in common carp, 3. Evaluation of growth performances and health status of common carp supplemented with Bacillus sp. NP5, prebiotic derived from the extract of sweet potato varieties Sukuh and synbiotic 4. Microencapsulation of synbiotic and its application to improve growth performances of common carp reared in ponds on the semi pilot scale.

(9)

hydrophila was conducted and the fish resistance was observed by calculating the survival rate of the fish on day 45. Fish were injected with a suspension of A. hydrophila via intramuscular route at a dose of 107 CFU/mL (0.1 mL/fish). The result of phenotypic and genotypic identification of the isolate of Bacillus sp. NP5 showed that the isolate was Bacillus cereus with 99% similarity index. At the in vitro test, Bacillus sp. NP5 was able to produce protease, amylase and lipase, it could also inhibit the growth of A. hydrophila, Streptococcus agalactiae, and Mycobacterium fortuitum. The feed supplemented with probiotic at a dose of 1010 CFU/mL (1% v/w) resulted in an increase in total viable bacterial count and total probiotic count in the intestines, it also increased the activity of amylase, protease and lipase along with the highest daily growth rate and the lowest feed conversion (P<0.05). Total leukocytes count and phagocytic activity of the probiotic treatment (1010 CFU/mL) was higher (P <0.05) than the control at the end of the study over 30 days. Common carps supplemented with probiotic showed better survival rate values after the challenge test with ranging from 81-100%, while the survival rate without the probiotic supplementation was only 51.28%. The results of this study indicates that the probiotic Bacillus cereus NP5 supplementation in common carp can improve growth performances, immune response and resistance of common carp to the infection of A. hydrophila, with the best results obtained at a dose of 1010 CFU/mL (1% v/w) probiotic supplementation.

The second phase aimed to evaluate the effects of prebiotic derived from sweet potato extract on the growth performances and health status of common carp before and after infected by A. hydrophila. Prebiotic was supplemented through the feed at doses of 0.5, 1 and 2% v/w for 30 days. The parameters observed during the application of prebiotic included the bacterial population and dominant bacterial species in the intestines, digestive enzymes activity, growth performances, and immune response. On day 32, the challenge test with A. hydrophila was conducted and the fish resistance was observed by calculating the survival rate of the fish on day 45. Fish were injected with a suspension of A. hydrophila via intramuscular route at a dose of 107 CFU/mL (0.1 mL/fish). The feed containing prebiotic supplementation at a dose of 2% showed a significant effect (P<0.05) on total viable bacterial count in the intestines and protease activity, produced the best daily growth rate and feed conversion (P<0.05) compared to the control and the other treatments. Bacteria which grew predominantly in the intestines were identified as Bacillus pumilus, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus hominis, A. veronii and Kocuria rhizophila. At the end of the study, total leukocytes count and phagocytic activity in the treatment of 2% prebiotic were higher than control. The survival rate of common carp after the challenge test in the treatment of 1% prebiotic and 2% prebiotic were 87% and 100%, respectively, while the fish without any prebiotic supplementation was only 51.11%. The results of this study indicate that supplementation of prebiotic on common carp can improve growth performances, immune response and resistance of common carp to the infection of A. hydrophila, with the best results obtained in 2% prebiotic supplementation.

(10)

On day 32, the challenge test with A. hydrophila was conducted and the fish resistance was observed by calculating the survival rate of the fish on day 45. Fish were injected with a suspension of A. hydrophila via intramuscular route at a dose of 105 CFU/mL (0.1 mL/fish). The parameters observed in this study were the total bacterial and total Bacillus cereus NP5 in the intestines, growth performances, the blood biochemistry, and the immune response. The results of this study indicate that the growth performances parameters including digestive enzymes activity, daily growth rate, feed conversion ratio, protein and total digestibility, protein and fat retention in prebiotic, probiotic, and synbiotic treatment were higher than controls, with the highest values obtained in synbiotic treatment. Liver and muscle glycogen content in the probiotic and synbiotic treatment were significantly different from control. The immune response parameters before and after the challenge test in prebiotic, probiotic, and synbiotic treatment were better than the positive control, followed by higher survival rate values (66.67-80.00%) than the positive control (46.67 %). The combination of Bacillus sp. NP5 at a dose of 1010 CFU/mL (1% v/w) with prebiotic derived from sweet potato extract 2% (v/w) can improve growth performances, immune response and resistance of common carp to the infection of A. hydrophila.

The fourth phase of this study aimed to evaluate the viability of probiotic cells in the microencapsulated synbiotic and to determine the best dose to improve growth performances and health status of common carp. The synbiotic used in this study was a combination of Bacillus cereus NP5 at a dose of 1010 CFU/mL (1% v/w) and 2% (v/w) prebiotic derived from sweet potato extract. Microencapsulation synbiotic was done through spray drying technique with the materials composition including synbiotic, whey protein and maltodextrin (1:1:10%) (v/v/w). Furthermore, the microencapsulated synbiotic was given through the feed to common carps reared in the ponds for 30 days. This study used completely randomized design consisting of four treatments with three replications: control and microencapsulated synbiotic supplementation at doses of 0.5%, 1% and 2%. The parameters observed in this study were evaluated the viability of probiotic cells before and after the microencapsulation process, and after one month of storage, the total bacterial and total Bacillus cereus NP5 in the intestines, growth performances and the immune response. The results showed that the viabilities of probiotic cells in the microencapsulated synbiotic before and after one month of storage were quite stable (8.83±0.03 log CFU/g and 8.79±0.02 log CFU/g). The supplementation of microencapsulated synbiotic through feed can improve growth performances and health status of common carp with the best results obtained in a dose of 1%.

Based on the results of whole phases of this study, those can be concluded that Bacillus cereus NP5, prebiotic derived from the extract of sweet potato varietas Sukuh, and the combination of those (synbiotic) can increase growth performances and health status of common carp infected by A. hydrophila with the best results obtained in the application of synbiotic. The viability of probiotic cells in the microencapsulated synbiotic was also quite stable, so it can be applied on the semi pilot scale of the common carp cultivation in the ponds.

(11)

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB

(12)

(13)

Disertasi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor

pada

Program Studi Ilmu Akuakultur

KINERJA PERTUMBUHAN DAN STATUS KESEHATAN

IKAN MAS (

Cyprinus carpio

) YANG DIBERI PROBIOTIK,

PREBIOTIK DAN SINBIOTIK

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2016

(14)

Penguji pada Ujian Tertutup : 1. Dr Ir Dinar Tri Soelistyowati, DEA

(Staf Pengajar Departemen Budidaya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB) 2. Dr drh Angela Mariana Lusiastuti, MSi

(Staf Peneliti Balai Penelitian dan

Pengembangan Budidaya Air Tawar Bogor)

Penguji pada Sidang Promosi : 1. Dr Ir Dinar Tri Soelistyowati, DEA

(Staf Pengajar Departemen Budidaya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB) 2. Dr drh Angela Mariana Lusiastuti, MSi

(Staf Peneliti Balai Penelitian dan

(15)

(16)

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala karunia-Nya sehingga Disertasi ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Agustus 2014 sampai Agustus 2015 ini ialah probiotik, prebiotik dan sinbiotik dengan judul Kinerja Pertumbuhan dan Status Kesehatan Ikan Mas (Cyprinus carpio) yang diberi Probiotik, Prebiotik dan Sinbiotik.

Terima kasih dan penghormatan penulis sampaikan kepada Ibu Dr Ir Widanarni MSi, Bapak Dr Ir Sukenda MSc, Bapak Dr Ir Muhammad Agus Suprayudi MSi dan Bapak Prof Dr Ir Muhammad Zairin Jr, MSc selaku pembimbing yang telah banyak memberi motivasi, serta Ibu Dr Ir Dinar Tri Soelistyowati DEA dan Dr drh Angela Mariana Lusiastuti M.Si selaku penguji luar komisi yang telah banyak memberi saran. Ungkapan terima kasih dan penghormatan juga disampaikan kepada ayah, ibu, isteri Evi Mirnayanti SE dan anak Samuel Mozart Joviano serta seluruh keluarga, atas doa dan kasih sayangnya.

Terima kasih penulis sampaikan kepada Kementerian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi Republik Indonesia atas kesempatan dan Beasiswa Pendidikan Pascasarjana (BPPS), sehingga penulis dapat melanjutkan dan menyelesaikan pendidikan pada Program Doktor (S3) di Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Terima kasih dan penghargaan penulis sampaikan kepada Rektor, Dekan Fakultas Pertanian, Ketua Jurusan Perikanan, Ketua Program Studi Budidaya Perairan Universitas Palangkaraya yang telah memberikan ijin dan kesempatan untuk melanjutkan pendidikan Program Doktor (S3).

Terima kasih dan penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Ranta, Bapak Wasjan dan Retno sebagai teknisi Laboratorium Kesehatan Ikan dan Nutrisi Ikan, mahasiswa akuakultur FPIK-IPB, yakni Dian, Evy, Novi, Hasan dan Yanti yang telah banyak memberikan bantuan di lapangan dan laboratorium, serta saudari Diah Ayu yang telah banyak membantu dalam analisis data dan mengedit laporan.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

(17)

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR ... vii

DAFTAR LAMPIRAN ... viii

1 PENDAHULUAN ... 1

Latar Belakang ... 1

Perumusan Masalah ... 3

Tujuan Penelitian ... 4

Kebaruan (Novelty) ... 4

2 KARAKTERISASI Bacillus sp. NP5 DAN APLIKASINYA SEBAGAI PROBIOTIK PADA IKAN MAS (Cyprinus carpio) ... 6

Abstrak ... 6

Pendahuluan ... 7

Bahan dan Metode... 9

Hasil ... 11

Pembahasan ... 14

Simpulan ... 17

3 EKSTRAKSI PREBIOTIK DARI UBI JALAR (Ipomoea batatas L.) DAN APLIKASINYA PADA IKAN MAS (Cyprinus carpio) ... 18

Abstrak ... 18

Pendahuluan ... 19

Hasil ... 22

Pembahasan ... 24

Simpulan ... 28

4 KINERJA PERTUMBUHAN DAN STATUS KESEHATAN IKAN MAS (Cyprinus carpio) YANG DIBERI PROBIOTIK Bacillus cereus NP5, PREBIOTIK DARI UBI JALAR (Ipomoea batatas L.) DAN SINBIOTIK ... 29

Abstrak ... 29

Pendahuluan ... 30

Hasil ... 32

Pembahasan ... 35

(18)

5 MIKROENKAPSULASI SINBIOTIK DAN APLIKASINYA UNTUK MENINGKATKAN KINERJA PERTUMBUHAN DAN STATUS

KESEHATAN IKAN MAS (Cyprinus carpio) ... 41

Abstrak ... 41

Pendahuluan ... 42

Bahan dan metode ... 43

Hasil ... 44

Pembahasan ... 46

Simpulan ... 49

6 PEMBAHASAN UMUM ... 50

7 SIMPULAN DAN SARAN ... 59

DAFTAR PUSTAKA ... 60

LAMPIRAN ... 76

RIWAYAT HIDUP ... 98

DAFTAR TABEL

Halaman 1. Indeks potensial amilolitik, proteolitik dan lipolitik Bacillus sp. NP5 ... 12

2. Aktivitas enzim amilase, protease dan lipase oleh Bacillus sp. NP5 pada waktu berbeda ... 12

3. Aktivitas penghambatan Bacillus sp. NP5 terhadap bakteri patogen dengan metode Kirby-Baeuer ... 12

4. Aktivitas penghambatan Bacillus sp. NP5 terhadap bakteri patogen dengan metode kultur bersama ... 13

5. Total bakteri dan total Bacillus sp. NP5 di usus ikan mas yang diberi probiotik setelah 30 hari pemeliharaan... 13

6. Aktivitas enzim pencernaan (U/mg protein) ikan mas yang diberi probiotik dosis 1% dengan kepadatan 1010 CFU/g pakan ... 13

7. Kinerja pertumbuhan ikan mas yang diberi probiotik setelah 30 hari pemeliharaan ... 14

8. Tingkat kelangsungan hidup dan parameter imunitas ikan mas yang diberi probiotik setelah 30 hari pemeliharaan ... 14

(19)

10. Aktivitas enzim pencernaan (U/mg protein) ikan mas yang diberi prebiotik dosis 2% ... 24 11. Kinerja pertumbuhan dan total bakteri di usus ikan mas yang diberi

prebiotik setelah 30 hari pemeliharaan ... 24 12. Bakteri dominan di usus ikan mas yang diberi prebiotik dosis 2% ... 24 13. Tingkat kelangsungan hidup dan parameter imunitas ikan mas yang

diberi prebiotik setelah 30 hari pemeliharaan ... 25 14. Tingkat kelangsungan hidup dan parameter imunitas ikan mas yang

diberi prebiotik setelah uji tantang dengan Aeromonas hydrophila... 25 15. Jumlah konsumsi pakan (JKP), total bakteri (TB), total Bacillus cereus

NP5 (TBNP5), laju pertumbuhan harian (LPH), rasio konversi pakan (RKP), kecernaan protein (KP), kecernaan total (KT), retensi protein (RP) dan retensi lemak (RL) ikan mas yang diberi prebiotik, probiotik dan sinbiotik setelah 30 hari pemeliharaan ... 34 16. Aktivitas enzim pencernaan, kadar glikogen hati dan otot ikan mas yang

diberi prebiotik, probiotik dan sinbiotik setelah 30 hari pemeliharaan ... 34 17. Biokimia darah ikan mas yang diberi prebiotik, probiotik dan sinbiotik

setelah 30 hari pemeliharaan ... 35 18. Tingkat kelangsungan hidup dan parameter imunitas ikan mas yang

diberi prebiotik, probiotik dan sinbiotik setelah 30 hari pemeliharaan ... 35 19. Tingkat kelangsungan hidup dan parameter imunitas ikan mas yang

diberi prebiotik, probiotik dan sinbiotik setelah uji tantang dengan Aeromonas hydrophila ... 36

20. Total bakteri (TB), total Bacillus cereus NP5, jumlah konsumsi pakan (JKP), tingkat kelangsungan hidup (TKH), laju pertumbuhan harian (LPH), rasio konversi pakan (RKP), retensi protein (RP) dan retensi lemak (RL) ikan mas yang diberi mikroenkapsulasi sinbiotik setelah 30 hari pemeliharaan ... 47 21. Parameter imunitas ikan mas yang diberi mikroenkapsulasi sinbiotik

setelah 30 hari pemeliharaan ... 47

DAFTAR GAMBAR

Halaman

(20)

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1. Prosedur Uji in vitro Enzim Amilase, Protease, dan Lipase ... 77

2. Prosedur pengukuran aktivitas enzim protease, α-amilase dan lipase ... 80

3. Hasil Blast Bakteri Probiotik Bacillus sp. NP5 ... 83

4. Prosedur ekstraksi oligosakarida/prebiotik... 84

5. Hasil Blast 5 isolat bakteri dominan di usus ikan mas perlakuan prebiotik ... 85

6. Parameter kinerja pertumbuhan ... 89

7. Prosedur pengukuran glikogen hati dan otot ... 91

8. Prosedur pengukuran glukosa darah ... 92

9. Prosedur pengukuran trigliserida darah ... 93

10. Prosedur pengukuran kadar kolesterol, HDL dan LDL... 94

(21)

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Ikan mas (Cyprinus carpio) merupakan salah satu komoditas akuakultur tertua (Balon 2006) dan termasuk spesies ekonomis penting yang populer dibudidayakan di Indonesia. Dalam perkembangan budidayanya, sebagian besar sentra produksi menghadapi hambatan berupa serangan penyakit Motile Aeromonad Septicaemia (MAS) yang disebabkan oleh bakteri Aeromonas hydrophila. Penyakit MAS menyebar sangat cepat dan mengakibatkan mortalitas sekitar 25%, namun angka ini dapat jauh lebih tinggi pada budidaya dengan kepadatan tinggi dan kualitas air buruk (Hoole et al. 2001). A. hydrophila memiliki ciri-ciri: Gram negatif, motil dan bentuk batang pendek (Harikrishnan et al. 2003). Gejala klinis MAS antara lain: penggembungan jaringan, dropsy, bercak merah pada permukaan tubuh, nekrosis, ulserasi dan haemorrhagic septicaemia (Karunasagar et al. 1989). Antibiotik sudah sering digunakan untuk menghambat dan mencegah bakteri patogen berkembang (Jagoda et al. 2014), namun beresiko tinggi dengan meningkatnya strain bakteri resisten, terganggunya keseimbangan normal mikroflora usus dan residunya banyak terakumulasi pada ikan dan lingkungan perairan (Sartar et al. 2007).

Penggunaan probiotik merupakan salah satu alternatif solusi ramah lingkungan untuk mereduksi penggunaan antibiotik karena dapat memodifikasi komunitas mikroba, menghambat pertumbuhan atau berkompetisi dengan bakteri patogen, memperbaiki ketersediaan biologis nutrien (bioavailability nutrients), memperbaiki kualitas lingkungan (Verschuere et al. 2000), serta dapat meningkatkan respon imun (Nayak 2010). Probiotik saluran pencernaan pada umumnya adalah bakteri asam laktat hidup, single-cell dan non-patogenik, umumnya menghasilkan bakteriosin yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen Gram negatif (Ringo et al. 2010a). Probiotik akuakultur berkembang karena secara alami tipe dan jumlah komunitas bakteri asam laktat hanya sebagian kecil dari total proporsi keseluruhan mikrobiota usus ikan (Ringø et al. 2010b). Berbagai probiotik yang sering digunakan adalah dari genus Lactococcus (Hagi et al. 2004; Sugita et al. 2009), Bacillus (Kumar et al. 2006, 2008), Lactobacillus (Ramakrishnan et al. 2008) dan Saccharomyces cerevisiae (Pal et al. 2007; Ramakrishnan et al. 2008). Beberapa probiotik umumnya menunjukkan dominansi pada saluran gastrointestinal ikan hanya selama perlakuan. Oleh karena itu, tantangan utama yang ingin dicapai pada pemberian probiotik adalah menghasilkan kolonisasi bakteri di usus ikan untuk jangka panjang, khususnya probiotik yang bersumber dari spesies ikan berbeda. Untuk menghasilkan efek therapeutic maksimum diperlukan konsentrasi minimum 106 CFU/ml (Kurmann dan Rasic 1991), kisaran 107-108 CFU/ml atau lebih tinggi (Davis et al. 1971; Ross et al. 2005; Jayamanne dan Adams 2006). Bacillus sp. NP 5 yang diisolasi dari usus ikan nila telah diuji mampu meningkatkan kinerja pertumbuhan ikan nila (Putra dan Widanarni 2015) dan resistensi udang vaname terhadap serangan Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) (Widanarni et al. 2014).

(22)

2

bagi inangnya dengan cara merangsang pertumbuhan dan aktivitas sejumlah bakteri tertentu di usus sehingga meningkatkan kesehatan inang (Cerezuela et al. 2011). Prebiotik yang banyak diteliti untuk diaplikasikan pada berbagai spesies ikan, antara lain fructooligosaccarides (FOS), short-cain fructooligo-saccharides (scFOS), mannanoligosaccharides (MOS), galactooligosaccharides (GOS), arabinoxylooligosaccharides (AXOS), isomaltooligosaccharides (IMO) dan inulin (Ringo dan Song 2016). Beberapa hasil penelitian menunjukkan prebiotik dapat meningkatkan pertumbuhan, kelangsungan hidup, kecernaan pakan, efisiensi pakan, komposisi mikroflora dalam usus, menghambat pertumbuhan patogen, dan meningkatkan imunitas ikan (Merrifield et al. 2010; Akrami et al. 2012a,b). Prebiotik memiliki beberapa kriteria utama, antara lain resisten terhadap keasaman lambung, hidrolisis enzim-enzim pencernaan, proses penyerapan pada saluran gastrointestinal, dapat difermentasi oleh mikroflora usus, dan secara selektif mampu menstimulir pertumbuhan dan aktivitas bakteri probiotik. Produk penting hasil fermentasi prebiotik oleh mikroflora usus adalah short chain fatty acid (SCFA) (Cummings dan Macfarlane 2002), yang merupakan sumber energi utama untuk sel-sel probiotik pada epitelium usus, menstimulir sistem imun dan resistensi melawan patogen (Maslowski dan Mackay 2010), dan modulasi sintesis lemak (Marcil et al. 2002). Ubi jalar (Ipomoea batatas L.) varitas sukuh adalah salah satu jenis tanaman pangan alternatif yang mengandung karbohidrat cukup populer saat ini dan berpotensi sebagai sumber prebiotik (Marlis 2008). Ekstrak oligosakarida dari ubi jalar (Ipomoea batatas L.) varitas sukuh telah diuji mampu meningkatkan kinerja pertumbuhan (Putra et al. 2015) dan respons imun (Tanbiyaskur et al. 2015) ikan nila.

Bila probiotik dan prebiotik digabung dalam suatu produk tunggal (sinbiotik) maka manfaatnya menjadi meningkat (Lisal 2005), karena nutrien yang terkandung dalam prebiotik penting untuk mendukung kelangsungan hidup dan mengoptimalkan fungsi probiotik termasuk semua mikroorganisme menguntungkan lainnya sebagai bagian integral mikroflora normal usus. Penggunaan probiotik dan prebiotik secara bersamaan telah diuji dapat meningkatkan populasi mikroba intestinal, respons imun dan resistensi udang vaname terhadap infeksi White Spot Syndrome Virus (WSSV) (Li et al. 2009) serta kinerja pertumbuhan dan respon imun juvenil Carassius auratus gibelio (Mahghani et al. 2014). Kombinasi probiotik Bacillus sp. NP5 dan prebiotik MOS juga telah diuji mampu meningkatkan kinerja pertumbuhan dan respon imun terhadap infeksi Streptococcus agalactiae pada ikan nila (Agung et al. 2015) dan infeksi A. hydrophila pada ikan patin (Tamamdusturi et al. 2016). Sedangkan kombinasi prebiotik dari ubi jalar dan probiotik Vibrio alginoliticus telah diuji mampu meningkatkan kinerja pertumbuhan dan respons imun udang vaname (Oktaviana et al. 2014; Nurhayati et al. 2015). Selanjutnya, kombinasi bakteri probiotik Bacillus sp. NP5 dan prebiotik dari ekstrak ubi jalar juga sudah diuji mampu mengendalikan infeksi streptococosis pada ikan nila (Widanarni et al. 2015).

(23)

3 budidaya, bakteri probiotik perlu dikarakterisasi dan diidentifikasi untuk membedakan dengan spesies lain yang potensial bersifat patogen. Selain itu, karakterisasi dan identifikasi bakteri probiotik juga penting dilakukan untuk kontrol kualitas dan kebutuhan paten, sehingga pada penelitian diawali dengan karakterisasi probiotik Bacillus sp. NP5, meningkatkan aktivitas probiotik dengan memahami peran prebiotik, dan dilanjutkan dengan mempelajari mekanisme aksinya dalam meningkatkan kinerja pertumbuhan dan status kesehatan ikan mas.

Selanjutnya, masih ada beberapa kendala utama terkait dengan aplikasi kultur segar probiotik di lapangan yaitu viabilitasnya yang menurun dalam waktu yang singkat baik selama persiapan maupun selama penyimpanan (Wang et al. 2008). Viabilitas yang tinggi dari sel-sel probiotik menjadi tuntutan utama terkait dengan efikasi produk-produk pakan berbasis probiotik. Teknik mikroenkapsulasi bermanfaat untuk melindungi dan memelihara sel-sel probiotik dari kondisi lingkungan yang kurang menguntungkan selama perjalanan melewati saluran pencernaan ikan, seperti keasaman tinggi dan garam-garam empedu (Del Piano et al. 2010; Solanki et al. 2013), kejutan panas pada proses spray drying, kejutan dingin pada deep freezing dan freeze drying (Shah dan Rarula 2000). Teknik spray drying merupakan metode mikroenkapsulasi yang tergolong murah dan mampu menghasilkan serbuk kualitas tinggi untuk produksi skala besar (Brun-Graeppi et al. 2011; John et al. 2011). Studi terkait aplikasi mikrokapsul sinbiotik pada akuakultur masih sedikit mendapatkan perhatian, sehingga penelitian ini diakhiri dengan produksi mikrokapsul sinbiotik dan mengevaluasi viabilitas sel probiotik serta efektivitasnya dalam meningkatkan kinerja pertumbuhan dan status kesehatan ikan mas pada kondisi lapangan di kolam.

Perumusan Masalah

(24)

4

singkat. Mikroenkapsulasi terbukti mampu memproduksi beberapa produk dalam bentuk mikrokapsul dengan kualitas dan viabilitas yang stabil. Untuk mendukung aplikasi skala massal sinbiotik dari gabungan probiotik Bacillus sp. NP5 dan prebiotik dari ekstrak ubi jalar varitas sukuh, produksi mikrokapsul sinbiotik penting untuk dilakukan, bersamaan dengan evaluasi viabilitas serta efektivitasnya dalam meningkatkan kinerja pertumbuhan dan status kesehatan ikan mas pada kondisi lapangan di kolam. Secara lengkap kerangka pemikiran penelitian ini disajikan pada Gambar 1.

Tujuan Penelitian

Tujuan umum dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi kinerja pertumbuhan dan status kesehatan ikan mas yang diberi probiotik Bacillus sp. NP5, prebiotik dari ekstrak ubi jalar (Ipomoea batatas L.) varitas Sukuh dan gabungan keduanya (sinbiotik) terhadap infeksi bakteri Aeromonas hydrophila. Secara garis besar untuk menjawab tujuan tersebut penelitian dibagi dalam empat tahap dengan tujuan khusus setiap tahap adalah sebagai berikut:

1. Mengkarakterisasi probiotik Bacillus sp. NP5 dan mengevaluasi efektivitas aplikasinya terhadap kinerja pertumbuhan dan status kesehatan ikan mas sebelum serta setelah diinfeksi A. hydrophila.

2. Mengekstraksi prebiotik dari ubi jalar varitas Sukuh dan mengevaluasi efektivitasnya terhadap kinerja pertumbuhan dan status kesehatan ikan mas sebelum serta setelah diinfeksi A. hydrophila.

3. Mengevaluasi efektivitas probiotik, prebiotik, dan sinbiotik terhadap kinerja pertumbuhan, respons imun dan resistensi ikan mas sebelum serta setelah diinfeksi A. hydrophila.

4. Mengevaluasi viabilitas sel probiotik Bacillus cereus NP5 dalam mikrokapsul sinbiotik serta menentukan dosis terbaiknya untuk meningkatkan kinerja pertumbuhan dan status kesehatan ikan mas yang dipelihara pada kondisi lapangan di kolam.

Kebaruan (Novelty)

1. Bacillus sp. NP5 telah teridentifikasi sebagai Bacillus cereus dengan indeks similaritas 99% dan berpotensi sebagai probiotik untuk ikan mas.

2. Oligosakarida yang diekstraksi dari ubi jalar varitas sukuh mengandung inulin, fruktooligosakarida, dan galaktooligosakarida dan berpotensi sebagai prebiotik untuk ikan mas.

3. Kombinasi probiotik Bacillus cereus NP5 dan prebiotik dari ubi jalar varitas sukuh menunjukkan efek sinergisme dalam meningkatkan kinerja pertumbuhan dan status kesehatan ikan mas.

(25)

5

BENIH IKAN MAS (Cyprinus carpio)

AKTIVITAS ENZIM PENCERNAAN RENDAH

SERANGAN PENYAKIT TINGGI (STATUS KESEHATAN RENDAH)

PREBIOTIK:

 Peningkatan diversitas komunitas mikroba usus

 Perubahan komposisi dan

aktivitas mikroba menguntungkan

 Modulasi respons imun

PROBIOTIK:

 Produksi senyawa antimikroba

 Produksi enzim pencernaan

 Kompetisi tempat perlekatan

 Modulasi respons imun

 Kompetisi nutrien (mineral; karbon)

SINBIOTIK

MIKROKAPSUL SINBIOTIK (Viabilitas tinggi)

KECERNAAN NUTRIEN DAN RESPONS IMUN MENINGKAT

KINERJA PERTUMBUHAN MENINGKAT

KELANGSUNGAN HIDUP MENINGKAT

Gambar 1. Kerangka pemikiran kinerja pertumbuhan dan status kesehatan ikan mas (Cyprinus carpio) yang diberi probiotik Bacillus sp. NP5, prebiotik dari ekstrak ubi jalar (Ipomoea batatas L.) dan sinbiotik

(26)

6

2 KARAKTERISASI

Bacillus

sp. NP5 DAN APLIKASINYA

SEBAGAI PROBIOTIK PADA IKAN MAS (

Cyprinus carpio

)

Abstrak

Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi probiotik Bacillus sp. NP5 dan mengevaluasi efektivitas aplikasinya terhadap kinerja pertumbuhan dan status kesehatan ikan mas (Cyprinus carpio) sebelum dan setelah diinfeksi Aeromonas hydrophila. Bacillus sp. NP5 diberikan pada ikan mas melalui pakan secara at satiation tiga kali sehari selama 30 hari dengan dosis 106, 108 dan 1010 CFU/mL sebanyak 1% (v/w). Parameter yang diamati selama aplikasi probiotik meliputi total bakteri dan total Bacillus sp. NP5 di usus, aktivitas enzim pencernaan, kinerja pertumbuhan, dan respons imun. Pada hari ke-32, ikan mas diuji tantang dengan injeksi bakteri patogen A. hydrophila secara intramuskular dengan dosis 107 CFU/mL (0.1 mL/ekor) dan resistensi ikan diamati dengan menghitung kelangsungan hidup ikan sampai pada hari ke-45. Hasil identifikasi fenotipik dan genetik isolat Bacillus sp. NP5 menunjukkan bahwa isolat tersebut adalah Bacillus cereus dengan indeks similaritas 99%. Secara in vitro isolat Bacillus sp. NP5 mampu menghasilkan enzim protease, amilase, dan lipase serta berpotensi menghambat bakteri patogen A. hydrophila, Streptococcus agalactiae, dan Mycobacterium fortuitum. Suplementasi pakan mengandung probiotik dengan dosis 1010 CFU/mL menghasilkan peningkatan jumlah total bakteri dan total probiotik di usus serta aktivitas enzim amilase, protease dan lipase yang disertai dengan laju pertumbuhan harian tertinggi dan konversi pakan terendah (P<0.05). Total leukosit dan aktivitas fagositik pada perlakuan dosis probiotik 1010 CFU/mL lebih tinggi (P<0.05) dibandingkan dengan kontrol di akhir masa pemeliharaan selama 30 hari. Ikan mas yang diberi pakan mengandung probiotik menunjukkan tingkat kelangsungan hidup setelah uji tantang dengan nilai yang berkisar antara 81-100%, sedangkan tingkat kelangsungan hidup ikan tanpa pemberian probiotik hanya sebesar 51.28%. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa suplementasi probiotik Bacillus cereus NP5 pada ikan mas dapat meningkatkan kinerja pertumbuhan, respons imun dan resistensi ikan mas terhadap penyakit akibat infeksi A. hydrophila, dengan hasil terbaik pada suplementasi probiotik dosis 1010 CFU/mL sebanyak 1%.

Kata kunci: Bacillus sp. NP5, pertumbuhan, respons imun, MAS, Cyprinus carpio Abstracts

(27)

7 hydrophila was conducted and the fish resistance was observed by calculating the survival rate of the fish on day 45. Fish were injected with a suspension of A. hydrophila via intramuscular route at a dose of 107 CFU/mL (0.1 mL/fish). The result of phenotypic and genotypic identification of the isolate of Bacillus sp. NP5 showed that the isolate was Bacillus cereus with 99% similarity index. At the in vitro test, Bacillus sp. NP5 was able to produce protease, amylase and lipase, it could also inhibit the growth of A. hydrophila, Streptococcus agalactiae, and Mycobacterium fortuitum. The feed supplemented with probiotic at a dose of 1010 CFU/mL (1% v/w) resulted in an increase in total viable bacterial count and total probiotic count in the intestines, it also increased the activity of amylase, protease and lipase along with the highest daily growth rate and the lowest feed conversion (P<0.05). Total leukocytes count and phagocytic activity of the probiotic treatment (1010 CFU/mL) was higher (P <0.05) than the control at the end of the study over 30 days. Common carps supplemented with probiotic showed better survival rate values after the challenge test with ranging from 81-100%, while the survival rate without the probiotic supplementation was only 51.28%. The results of this study indicates that the probiotic Bacillus cereus NP5 supplementation in common carp can improve growth performances, immune response and resistance of common carp to the infection of A. hydrophila, with the best results obtained at a dose of 1010 CFU/mL (1% v/w) probiotic supplementation.

Key words: Bacillus sp. NP5, growth, immune response, MAS, Cyprinus carpio PENDAHULUAN

Ikan mas (Cyprinus carpio) merupakan ikan konsumsi air tawar yang cukup berkembang dengan permintaan terhadap produk segar cukup besar sebagai salah satu ikan favorit masyarakat. Indonesia sendiri menempati posisi keenam dalam produksi ikan mas dunia dengan total produksi mencapai sekitar 497.000 ton pada tahun 2015 yang secara rinci diperoleh melalui usaha budidaya di kolam sekitar 90% dan karamba 10% (DJPB 2015). Seiring meningkatnya tuntutan sumber protein hewani, akuakultur muncul sebagai salah satu industri berkelanjutan yang dapat diandalkan untuk mencukupi kebutuhan nutrisi dan menopang keamanan pangan manusia. Namun, sebagian besar sentra produksi akuakultur intensif menghadapi hambatan utama yang disebabkan oleh serangan wabah penyakit.

(28)

8

(Pridgeon dan Klesius 2011), serangannya bersifat sangat akut sehingga dapat menyebabkan mortalitas kurang dari 24 jam.

Kegiatan pengendalian penyakit yang biasa dilakukan adalah menggunakan antibiotik. Aplikasi antibiotik memiliki beberapa kelemahan, antara lain potensi munculnya generasi bakteri patogen dan mikroflora pada saluran pencernaan yang resisten terhadap antibiotik, ketidakseimbangan kondisi mikroflora pada saluran pencernaan dan reduksi populasi bakteri yang menguntungkan, serta residu antibiotik pada jaringan tubuh ikan. Penggunaan antibiotik dalam akuakultur saat ini sudah banyak ditinggalkan dan sebagai alternatif penggantinya adalah menggunakan probiotik, karena memiliki beberapa keunggulan, yaitu produk dapat disiapkan dengan teknik yang relatif sederhana dan lebih ramah lingkungan. Probiotik telah terbukti berdampak positif bagi kesehatan ikan, maka proses identifikasi dan karakterisasi bakteri terkait modulasi aktivitas dan manipulasi komposisi bakteri yang mampu mendukung kesehatan ikan menjadi sangat penting, sama pentingnya dengan upaya ikan mengkonsumsi suplemen probiotik untuk memperkuat dan mempertahankan keseimbangan kondisi mikroflora menguntungkan pada saluran pencernaan ikan. Studi intensif aplikasi probiotik akuakultur sering berfokus pada berbagai spesies Bacillus sp. yang dapat membentuk spora. Pada kondisi starvasi nutrien, pertumbuhan sel vegetatif mengalami serangkaian proses perubahan morfologi membentuk suatu forespore (spora induk) dalam sporangium sel induk yang sekitar 8 jam kemudian terjadi perilisan spora dengan cara melisis sel induk (Cutting 2011). Bacillus sp. telah banyak terbukti memperlihatkan kemampuan adhesi, produksi bakteriosin (senyawa peptida antimikrobial) dan juga berkarakter imunostimulasi. Strain probiotik Bacillus sp. memiliki beberapa keunggulan karena mempunyai spora yang relatif stabil terhadap panas, beberapa mampu bertahan hidup pada pH rendah (Barbosa et al. 2005), dan viabilitasnya relatif stabil selama masa penyimpanan jangka panjang untuk tujuan produksi pakan komersial dalam skala besar (Ringo et al. 2014b).

Pemberian probiotik tunggal Bacillus subtilis dan Lactobacillus acidophilus dosis 107 CFU/g pakan selama 1 dan 2 bulan pada ikan nila mampu meningkatkan aktivitas lisosim dan bakterisidal serum melawan A. hydrophila dengan kelangsungan hidup pasca uji tantang sebesar 43.52% (Aly et al. 2008). Suplementasi Bacillus NL110 yang diisolasi dari telur dan larva Macrobrachium rosenbergii lewat pakan dan air menunjukkan perbaikan kualitas air, pertumbuhan, tingkat kelangsungan hidup, laju pertumbuhan harian, FCR dan parameter imunitas juvenil M. rosenbergii (0.001-0.08 g) (Rahiman et al. 2010). Pada penelitian ini digunakan probiotik Bacillus sp. NP5 yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan nila (Putra dan Widanarni 2015) dan telah diuji mampu mengendalikan streptococcosis pada ikan nila (Widanarni dan Tanbiyaskur 2015). Probiotik yang diberikan dalam jumlah yang cukup akan menghasilkan efek pertumbuhan dan kesehatan yang baik bagi ikan, sehingga dapat mengurangi biaya produksi melalui perbaikan pertumbuhan dan efisiensi pemanfaatan nutrien dalam pakan. Dosis probiotik yang umum digunakan dalam industri akuakultur bervariasi antara 106-1010 CFU/g pakan (Nayak 2010).

(29)

9 probiotik juga penting dilakukan untuk kontrol kualitas dan kebutuhan paten (Gomez-Gill et al. 2000; Romero dan Navarrete 2006). Berdasarkan hal tersebut penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi probiotik Bacillus sp. NP5 dan mengevaluasi efektivitas aplikasinya terhadap kinerja pertumbuhan dan status kesehatan ikan mas (Cyprinus carpio) sebelum dan setelah diinfeksi Aeromonas hydrophila.

BAHAN DAN METODE

Identifikasi Bacillus sp. NP5. Karakter fenotipik Bacillus sp. NP5 dievaluasi menggunakan kit api® 50 CHB V4.0, bioMerieux, Marcy-I‟Etoile, France. Sedangkan karakter genotipik dievaluasi melalui amplifikasi gen penyandi 16S rRNA dengan primer 63f (5‟CAG GCC TAA CACATG CAA GTC-3‟) dan primer 1387r (5‟-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-„3) (Marchesi et al. 1998). Komposisi master mix PCR setiap tabung terdiri atas 25 µl GoTaq (Promega), 4 µl primer 63f, 4 µl primer 1387r, 17 µl ddH2O dan DNA template yang diambil

dengan tusuk gigi secara langsung dari isolat Bacillus sp. NP5. Kondisi PCR adalah sebagai berikut: pradenaturasi 95 oC selama 5 menit, denaturasi 95 oC selama 1 menit, annealing primer 55 oC selama 1 menit, elongation 72 oC selama 1 menit, dan post PCR pada suhu 72 oC selama 5 menit. Proses amplifikasi pada mesin PCR terdiri atas 30 siklus. Penghentian reaksi dilakukan dengan penurunan suhu ke 4 oC. Produk PCR dijalankan pada elektroforesis dengan gel agarose 1% dalam bufer TAE 1x pada 80 volt selama 45 menit, dilanjutkan visualisasi menggunakan UV transiluminator. Sekuensing dilakukan dengan mengirimkan DNA hasil amplifikasi ke perusahaan penyedia jasa sekuensing. Hasil sekuen disejajarkan dengan data base di Gene Bank menggunakan program BLAST-N online software (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Uji semi kuantitatif aktivitas amilolitik, proteolitik dan lipolitik. Pengujian ini bertujuan untuk mengukur kemampuan aktivitas amilolitik, proteolitik dan lipolitik bakteri probiotik melalui uji hidrolisis pati, susu skim dan minyak zaitun. Kemampuan hidrolisis ditandai dengan adanya zona bening di sekeliling koloni isolat.

(30)

10

Uji penghambatan bakteri Bacillus sp. NP5 terhadap bakteri patogen. Uji kemampuan penghambatan dilakukan berdasarkan metode Kirby-Bauer dan kultur bersama terhadap bakteri patogen A. hydrophila, Streptococcus agalactiae, dan Mycobacterium fortuitum. Uji penghambatan dengan metode Kirby-Bauer dilakukan menggunakan kertas cakram dengan mengukur zona hambatnya, sedangkan melalui metode kultur bersama dilakukan dengan menumbuhkan isolat Bacillus sp. NP5 bersama setiap isolat patogen yang telah diberi penanda resisten antibiotik pada media TSB (Trypticase Soy Broth), diikuti dengan penghitungan jumlah bakteri patogen yang tumbuh pada media TSA dengan suplementasi antibiotik penanda (Widanarni et al. 2003). Hasil penghambatan pertumbuhan bakteri patogen pada metode kultur bersama diketahui dengan membandingkan jumlah sel bakteri patogen pada tabung kultur bersama (kultur probiotik dan patogen) dengan jumlah sel bakteri patogen pada tabung kontrol (kultur patogen). Persiapan probiotik. Bakteri probiotik yang digunakan sebagai suplemen pakan dalam penelitian ini adalah Bacillus sp. NP5 yang sebelumnya telah diberi penanda antibiotik rifampisin (Bacillus sp. NP5 RfR) sebagai penanda molekuler (Widanarni et al. 2003). Probiotik ditumbuhkan dalam media TSB dan diinkubasi dalam waterbath shaker pada suhu 29-30 oC, 160 rpm selama 24 jam. Suspensi sel bakteri yang diperoleh kemudian disentrifugasi dan pellet sel bakteri kemudian dicuci dua kali menggunakan larutan Phosphate Buffer Saline (PBS).

Persiapan pakan eksperimen. Persiapan pakan eksperimen menggunakan pakan komersial dengan kadar protein 31% dilakukan dengan menambahkan tiga dosis probiotik (106, 108 dan 1010 CFU/mL) sebanyak 1% (v/w) ke dalam pakan. Pencampuran pakan dan probiotik dilakukan dengan menambahkan 2% putih telur sebagai binder, sementara pakan kelompok kontrol hanya ditambahkan 2% putih telur.

Pemeliharaan dan rancangan eksperimen. Penelitian ini dilakukan selama 45 hari, yakni 30 hari pemeliharaan dengan pakan eksperimen dan 14 hari masa uji tantang. Hewan uji yang digunakan yaitu ikan mas dengan bobot rata-rata 4.81±0.25 g yang sebelumnya telah diadaptasikan pada lingkungan percobaan selama 2 minggu. Ikan ditebar secara acak pada masing-masing akuarium perlakuan berukuran 65x40x40 (cm3) dengan kepadatan 15 ekor per akuarium. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap, terdiri dari lima perlakuan dengan tiga ulangan: kontrol (-) (pakan tanpa probiotik dan tanpa uji tantang), kontrol (+) (pakan tanpa probiotik dengan uji tantang), A (suplementasi pakan dengan dosis probiotik 106 CFU/mL dengan uji tantang), B (suplementasi pakan dengan dosis probiotik 108 CFU/mL dengan uji tantang), dan C (suplementasi pakan dengan dosis probiotik 1010 CFU/mL dengan uji tantang). Pemberian pakan perlakuan dilakukan sampai ikan kenyang (at satiation) dengan feeding frequency tiga kali sehari (08.00, 12.00, 16.00 WIB) selama 30 hari. Kualitas air dijaga dengan menyipon feses ikan dan pergantian air media pemeliharaan sebanyak 20% setiap hari. Kualitas air dimonitor selama pemeliharaan dengan parameter dan kisaran: suhu 28.0-28.5 oC, DO 7.2-8.1 mg/L, pH 7.4-8.04, dan TAN 0.0032-0.0065 mg/L.

(31)

11 untuk probiotik Bacillus sp. NP5 RfR. Jumlah bakteri dalam sampel dapat ditentukan dengan menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada media dikalikan dengan faktor pengenceran (Madigan et al. 2003) dalam CFU/g.

Uji tantang. Setelah menerima pakan perlakuan selama 30 hari, ikan mas dari setiap perlakuan (kecuali pada perlakuan kontrol negatif) diuji tantang dengan A. hydrophila. Tujuan uji tantang adalah untuk mengevaluasi performa perlakuan probiotik dalam meningkatkan resistensi ikan mas terhadap infeksi A. hydrophila. Ikan mas diinfeksi dengan A. hydrophila pada konsentrasi 107 CFU/mL sebanyak 0.1 mL/ekor. Infeksi dilakukan dengan cara injeksi secara intramuskular menggunakan siring volume 1 mL, kelompok kontrol negatif diinjeksi dengan PBS. Gejala klinis dan mortalitas ikan mas diamati selama 14 hari setelah injeksi.

Parameter eksperimen. Parameter eksperimen yang diukur terdiri dari populasi bakteri di usus, aktivitas enzim saluran pencernaan meliputi amilase, protease (Drapeau 1974) dan lipase (Debnath et al. 2007), kinerja pertumbuhan, respons imun, dan tingkat kelangsungan hidup ikan mas setelah uji tantang yang menggambarkan resistensi ikan terhadap infeksi. Parameter kinerja pertumbuhan yang diamati meliputi laju pertumbuhan harian (LPH) dan rasio konversi pakan (FCR). Populasi bakteri di usus meliputi jumlah total bakteri dan jumlah Bacillus sp. NP5 RfR. Kinerja pertumbuhan dan populasi bakteri di usus dievaluasi langsung setelah 30 hari perlakuan probiotik. Parameter respons imun yang diukur meliputi total leukosit, aktivitas fagositik (Balcazar et al. 2006), diferensial leukosit (limfosit, monosit dan neutrofil), hematokrit, hemoglobin dan total eritrosit. Respons imun dan tingkat kelangsungan hidup ikan diukur dua kali: setelah 30 hari pemberian pakan perlakuan (sebelum uji tantang), dan 14 hari setelah uji tantang.

Analisis data. Data yang diperoleh dianalisis secara statistik menggunakan software SPSS Statistic 17.0 dan uji lanjut dengan Uji Duncan untuk uji beda nyata (P<0.05).

HASIL

Identifikasi 16S-rRNA. Hasil identifikasi karakter fenotipik Bacillus sp. NP5 menggunakan kit api® 50 CHB V4.0 menunjukkan bahwa isolat Bacillus sp. NP5 adalah spesies Bacillus cereus. Identifikasi berdasarkan hasil sekuensing parsial gen 16S-rRNA dan analisis BLAST-N pensejajaran 1250 bp juga menunjukkan bahwa isolat Bacillus sp. NP5 memiliki kedekatan dengan Bacillus cereus pada indeks similaritas sebesar 99% (Lampiran 3).

Aktivitas amilolitik, proteolitik dan lipolitik. Aktivitas enzim amilase, protease dan lipase Bacillus sp. NP5 diperoleh kisaran nilai indeks amilolitik (IA) 0.49, proteolitik (IP) 0.2 dan lipolitik (IL) 1.31 (Tabel 1). Aktivitas tertinggi amilase tercapai pada 48 jam pengamatan yaitu sebesar 0.044 U/mg protein, protease pada 96 jam (0.0030 U/mg protein), dan lipase diamati hanya sampai pada 24 jam (0.062 U/mg protein) (Tabel 2).

(32)

masing-12

[image:32.595.41.487.92.566.2]

masing sebesar 0.4, 0.7 dan 0.2 (Tabel 3) serta mampu mereduksi patogen tersebut sebesar 66.1%, 98.81% dan 30% (Tabel 4).

Tabel 1. Indeks potensial amilolitik, proteolitik dan lipolitik Bacillus sp. NP5 Parameter Diameter zona

bening (cm)

Diameter koloni bakteri (cm)

Nilai indeks potensial

Amilolitik 0.93±0.13 0.63±0.13 0.49±0.1

Proteolitik 1.2±0.1 1±0.1 0.20±0.02

Lipolitik 3.53±0.08 1.53±0.08 1.31±0.07

Tabel 2. Aktivitas enzim amilase, protease dan lipase Bacillus sp. NP5 pada waktu berbeda

Waktu Enzim amilase

(U/mg protein)

Enzim protease (U/mg protein)

Enzim lipase (U/mg protein)

18 jam 0.000±0.0 0.0009±0.0 0.054±0.001

21 jam 0.001±0.0 0.0008±0.0001 0.060±0.001

24 jam 0.029±0.001 0.0012±0.0001 0.062±0.0

48 jam 0.044±0.0 0.0027±0.0 NA

72 jam 0.035±0.001 0.0014±0.0 NA

96 jam 0.024±0.0 0.0030±0.0001 NA

NA: not analyzed

Tabel 3. Aktivitas penghambatan Bacillus sp. NP5 terhadap bakteri patogen dengan metode Kirby-Baeuer

Patogen/Parameter Diameter zona

bening (cm)

Diameter koloni bakteri (cm)

Indeks penghambatan

A. hydrophila 1.33±0.15 0.93±0.15 0.43±0.07

S. agalactiae 1.7±0.1 1.0±0.1 0.71±0.07

M. fortuitum 1.53±0.1 1.33±0.1 0.15±0.01

Populasi bakteri di usus. Suplementasi probiotik melalui pakan pada ikan mas selama 30 hari secara signifikan (P<0.05) berpengaruh terhadap populasi bakteri di dalam usus ikan. Nilai tertinggi dari jumlah total bakteri di usus ikan terdapat pada perlakuan C yang tidak berbeda nyata (P>0.05) dengan perlakuan B, tetapi berbeda nyata (P<0.05) dengan kontrol dan perlakuan A. Selain itu, nilai tertinggi untuk total bakteri probiotik Bacillus sp. NP5 di usus ikan juga terdapat pada perlakuan C yang berbeda nyata (P<0.05) dengan semua perlakuan (Tabel 5).

(33)

13 Tabel 4. Aktivitas penghambatan Bacillus sp. NP5 terhadap bakteri patogen

dengan metode kultur bersama

Patogen Jumlah koloni bakteri

patogen (cfu/mL)

Persentase penghambatan (%)

A. hydrophila (tabung kontrol) 2.35x109±1.65x108

A. hydrophila (tabung campuran) 8x108±5x107 66.1±0.04

S. agalactiae (tabung kontrol) 1x1010±9x108

S. agalactiae (tabung campuran) 1.18x108±2.05x107 98.8±0.3

M. fortuitum (tabung kontrol) 1x1010±6x108

M. fortuitum (tabung campuran) 7x109±4.5x108 29.85±1.48

Tabel 5. Total bakteri dan total Bacillus sp. NP5 di usus ikan mas yang diberi probiotik setelah 30 hari pemeliharaan

Parameter/

Perlakuan Kontrol A (10

6

cfu/mL) B (108 cfu/mL) C (1010 cfu/mL) Total bakteri

(log cfu/g)

7.70±0.03a 8.85±0.03b 9.78±0.06c 10.28±0.03d

Total Bacillus sp. NP5 (log cfu/g)

not detected 7.03±0.08a 8.38±0.08b 9.43±0.08c

Keterangan: huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan pengaruh perlakuan yang berbeda nyata (uji jarak berganda Duncan; P<0.05). Nilai yang tertera merupakan nilai rata-rata dan simpangan baku.

Tabel 6. Aktivitas enzim pencernaan (U/mg protein) ikan mas yang diberi probiotik dengan kepadatan 1010 CFU/mL sebanyak 1%

Parameter/Perlakuan Probiotik Kontrol

Amilase 0.77±0.03b 0.50±0.03a

Protease 0.07±0.002b 0.04±0.004a

Lipase 0.80±0.03b 0.47±0.04a

(34)

14

Tabel 7. Kinerja pertumbuhan ikan mas yang diberi probiotik setelah 30 hari pemeliharaan

Parameter/Perlakuan Kontrol A (106

cfu/mL)

B (108 cfu/mL)

C (1010 cfu/mL) Laju pertumbuhan

harian (%)

1.40±0.05a 1.52±0.25a 2.33±0.05b 2.91±0.13c

Rasio konversi pakan 2.55±0.1a 1.72±0.1b 1.66±0.18b 1.54±0.02b

Tabel 8. Tingkat kelangsungan hidup dan parameter imunitas ikan mas yang diberi probiotik setelah 30 hari pemeliharaan

Parameter K- K+ A (10

6

cfu/mL)

B (108 cfu/mL)

C (1010 cfu/mL)

TKH (%) 93.33±6.67ab 86.67±6.67a 91.11±3.85ab 95.55±3.85ab 100.00±0.00b

Total Leukosit

(x104 sel/mm3) 13.9±0.53

a

13.1±0.3a 21±2.65b 21.5±2.12b 31.5±1.92c

Total Eritrosit

(x106 sel/mm3) 1.5±0.03

a

1.54±0.05a 1.73±0.03b 1.96±0.03c 2.76±0.04d

Hematokrit (%) 34±3.61a 34±1a 33±2.65a 30±3a 34±3.61a

Hemoglobin (g%) 6.6±0.27a 6.25±0.04a 6.2±0.04a 6.5±0.17a 7.6±0.27b

Aktivitas fagositik

(%) 27±2.65

a

26±1.73a 17±2.65b 25±2a 64±2.65c

Tabel 9. Tingkat kelangsungan hidup dan parameter imunitas ikan mas yang diberi probiotik setelah uji tantang dengan Aeromonas hydrophila

Parameter K- K+ A (10

6 cfu/mL)

B (108 cfu/mL)

C (1010 cfu/mL)

TKH (%) 92.49±7.7ab 51.28±2.22c 80.59±3.49a 88.09±10.91ab 100.00±0.00b

Total Leukosit (x104

sel/mm3) 34.2±0.3

a

14.9±0.82b 34.3±0.36a 36.9±0.36a 37±2.65a

Total Eritrosit (x106

sel/mm3) 1.12±0.06

a

1.04±0.04a 1.43±0.04b 1.32±0.07b 1.08±0.05a

Hematokrit (%) 31±2.65a 20±3b 34±1.73a 28±2a 31±2.65a

Hemoglobin (g%) 6±0.4a 5±0.06b 6±0.5a 5.1±0.15b 4.7±0.1b

Aktivitas fagositik

(%) 26±2.65

a

36±3.61b 31±1.73ab 36±4b 66±3.61c

PEMBAHASAN

[image:34.595.48.488.78.821.2]

(35)

15 Bacillus cereus. Homologi menunjukkan bahwa sekuen tersebut memiliki hubungan evolusi (Pertsemlidis dan Fondon III 2002). Bacillus sp. NP5 digunakan sebagai probiotik terkait dengan kemampuannya menghasilkan enzim-enzim pencernaan seperti amilase, protease, dan lipase. Di samping itu, probiotik ini juga memiliki aktivitas penghambatan terhadap beberapa bakteri patogen akuakultur antara lain A. hydrophila, S. agalactiae dan M. fortuitum.

Introduksi setiap jenis bakteri ke dalam usus harus mampu berkompetisi dengan mikroflora residen yang sudah terbentuk dengan niche ekologi (nutrien dan tempat perlekatan) agar dapat bertahan hidup. Strain probiotik harus mampu menempel pada lapisan mukus usus dan memanfaatkan mukus sebagai sumber nutrien untuk berkolonisasi, bersifat persisten dan mampu berproliferasi dalam saluran pencernaan ikan (Merrifield et al. 2010). Kemampuan Bacillus sp. NP5 untuk bertahan hidup dalam usus ikan mas ditunjukkan dengan data jumlah bakteri di usus ikan; jumlah bakteri pada perlakuan probiotik lebih tinggi dibanding dengan kontrol. Probiotik yang merupakan mikroflora usus yang ikut berperan dalam mekanisme resistensi inang terhadap kondisi stress dan patogen; melalui stimulasi respons imun, produksi substansi antimikroorganisme spesifik (bakteriosin), merilis produk metabolik seperti asam lemak rantai pendek (SCFA) yang menyebabkan pH cairan usus menurun sampai tingkat di bawah kondisi optimum untuk pertumbuhan patogen, memperbaiki sel-sel epitelium usus dan mekanisme aksi sel-sel pertahanan tubuh.

(36)

16

Aktivitas enzim amilase, protease dan lipase pada perlakuan probiotik diduga sebagian besar adalah hasil stimulasi oleh probiotik, sehingga mendorong eksoenzim untuk mensintesis endoenzim pencernaan yang akhirnya bersinergi memperbaiki kecernaan nutrien dan performa pertumbuhan serta FCR.

Dosis probiotik merupakan faktor pembatas untuk mencapai efek menguntungkan yang optimum (Minelli dan Benini 2008). Dosis probiotik akuakultur umumnya berkisar 106-1010 CFU/g pakan dengan dosis optimum bervariasi tergantung pada jenis ikan dan tipe parameter imun yang diamati. Konsentrasi optimum tidak hanya diindikasikan oleh kolonisasi dan proliferasi bakteri di dalam usus, tetapi juga oleh pertumbuhan, respons imun dan proteksi terhadap inang. Dosis efektif strain probiotik Bacillus sp. yaitu 2x108 CFU/g pakan pada Oncorhynchus mykiss, menghasilkan persentase mortalitas yang rendah setelah uji tantang dengan bakteri patogen (Brunt et al. 2007). Aktivitas fagositik meningkat tinggi pada O. mykiss yang diberi Lactobacillus rhamnosus dengan dosis 1011 CFU/g pakan selama 30 hari, tetapi menurun pada dosis 109 CFU/g pakan (Panigrahi et al. 2004). Dosis terbaik probiotik Lactobacillus plantarum untuk meningkatkan pertumbuhan, respons imun dan proteksi pada grouper (Epinephelus coioides) adalah 108 CFU/g pakan; dosis ini menunjukkan hasil yang lebih baik dibanding dosis 106 dan 1010 CFU/g pakan (Son et al. 2009). Dosis yang rendah tidak berhasil merangsang kinerja pertumbuhan maksimum dan sistem imun seluler terkait dengan kurangnya kapasitas kolonisasi, namun pada dosis tinggi dapat menyebabkan mortalitas yang tinggi, seperti pada O. mykiss yang diberi L. rhamnosus dengan dosis 1012 CFU/g pakan, tetapi hal tersebut tidak terjadi pada dosis 109 CFU/g pakan (Nikoskelainen et al. 2001).

(37)

17 ikan-ikan air tawar (Gonzalez et al. 1999), melalui produksi senyawa-senyawa inhibitor. Peningkatan populasi probiotik dapat menghasilkan sejumlah produk fermentatif seperti laktat dan asetat yang menyebabkan reduksi pH cairan usus di bawah kondisi optimum bagi mikroekofisiologi patogen. Oleh karena itu, suplementasi Bacillus sp. NP5 dapat meningkatkan proteksi dan resistensi ikan mas terhadap suatu patogen dengan tingkat kelangsungan hidup yang tinggi.

Suplementasi probiotik dapat meningkatkan respons imun seluler ikan mas sehingga memudahkan eliminasi patogen potensial dalam jaringan usus. Sitotoksisitas A. hydrophila dan akumulasi produk ekstraselulernya (α dan β hemolisin; aerolisin; enterotoksin ACT, ALT dan AST, protease serta Rnase) menyebabkan nekrotik eritrosit, hemolisis eritrosit dan ion besi (Rey et al. 2009), sehingga menimbulkan adanya penurunan jumlah sel darah merah ikan uji. Hal tersebut sesuai dengan hasil penelitian ini, total eritrosit ikan mas yang terinfeksi A. hydrophila mengalami penurunan dari total eritrosit ikan mas sebelum mendapatkan infeksi. Probiotik berinteraksi dengan sel-sel fagositik mononuklear (monosit dan makrofag) dan polimorfonuklear leukosit (neutrofil) serta sel-sel natural killer. Probiotik dapat bertindak sebagai trigger yang efektif bagi sel-sel fagositik sehingga meningkatkan aktivitas fagositik, seperti pada ikan nila (Oreochromis niloticus) yang diberi pakan mengandung L. rhamnosus selama 2 minggu (Pirarat et al. 2006). Peningkatan aktivitas fagositik juga terjadi pada gilthead sea bream (Sparus aurata L.) yang diberi pakan mengandung Lactobacillus delbrueckii spp. lactis (CECT 287) dengan dosis sebanyak 107 CFU/g pakan selama 14 hari (Salinas et al. 2005). Fagositosis bertanggung jawab untuk aktivasi awal respons inflamasi sebelum produksi antibodi terjadi, dan bertindak sebagai mediator sel-sel fagositik (neutrofil, monosit dan makrofag). Aktivasi in vivo sel-sel fagositik oleh imunomodulator juga menyebabkan sekresi sejumlah besar molekul-molekul biologik aktif seperti enzim-enzim inhibitor, peptida kationik, komponen komplemen, produksi oksigen reaktif spesies (ROS = reactive oxygen species) dan nitrat oksida sintase (NOS = nitric-oxide synthase) yang seluruhnya terlibat dalam aktivitas bakterisidal (Kwak et al. 2003). Pemberian probiotik Bacillus sp. NP5 dapat meningkatkan sel-sel fagositik aktif dan total leukosit. Stresor menimbulkan respons stres pada leukosit untuk semua vertebrata termasuk ikan (Davis 2008). Peningkatan jumlah total leukosit diduga dapat pula disebabkan oleh ikan mengalami stres akibat setiap hari mengkonsumsi pakan mengandung probiotik yang dikenali sebagai benda asing. Seiring dengan meningkatnya jumlah leukosit pada dosis probiotik 1010 CFU/mL, mortalitas ikan menunjukkan nilai yang lebih rendah setelah uji tantang dengan