DAFTAR PUSTAKA
KURVA STANDAR
Standar 1 Standar 2 Standar 3 Standar 4 Standar 5 Standar blanko
Reagent F (Larutan standar) 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 -
Akuades 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 2,00
Reagent E (Larutan warna) 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
Tutup dan letakkan pada water bath mendidih tepat 15 menit, kemudian dinginkan dalam es sampai temperatur ruang dan tambahkan
Akuades 9,00 9,00 9,00 9,00 9,00 9,00
Campur dan kemudian ukur absorbansinya dengan panjang gelombang 540 nm
3. Pengukuran aktivitas enzim lipase (Metode Borlongan, 1990) dilakukan berdasarkan tahapan-tahapan berikut:
Ke dalam tabung reaksi Sa
mpel (ml) Bla nko (ml) Substrat lipase 1,5 0 1,5 0 Tris-HCl buffer pH 8,00 1,5 0 1,5 0 Larutan enzim 1,0 0 - Campur dan inkubasi selama 6 jam pada temperatur 37oC,
kemudian tambahkan
Ethyl alcohol 95% 3,0
0
3,0 0 Campur, kemudian tambahkan
Larutan enzim - 1,0
0 Campuran dititrasi dengan 0,01 N NaOH dengan menggunakan
0,90% Thymolphthlein sebagai indikator
Pengukuran aktivitas enzim pencernaan dilakukan pada akhir penelitian. Sampel ikan diambil secara acak dari setiap perlakuan dan ditimbang bobot tubuhnya. Pengukuran aktivitas enzim pencernaan dari saluran pencernaan ikan dilakukan dengan cara memisahkan bagian tubuh ikan dengan organ pencernaan (usus). Hasil homogenasi usus ikan dengan akuades hingga sepuluh kali bobot contoh diperoleh ekstrak enzim kasar. Ekstrak enzim ini selanjutnya disimpan dalam freezer (suhu -20 oC) sampai pengujian aktivitas enzim dilakukan.
Pengukuran aktivitas enzim protease berpedoman pada metode Hans-Elmar Walter (1988). Substrat yang digunakan dalam pengukuran aktivitas enzim protease adalah kasein. Tirosin digunakan sebagai standar. Satu unit enzim protease didefinisikan sebagai 1 mg tirosin yang dibebaskan dalam 10 menit pada suhu 37 oC. Pengukuran aktivitas enzim α-amilase dilakukan dengan menggunakan metode Bernfeld (1955). Substrat yang digunakan dalam pengukuran aktivitas α-amilase adalah pati. Maltosa digunakan sebagai standar. Satu unit α-amilase didefinisikan sebagai 1 mg maltosa yang dibebaskan dari pati dalam waktu 3 menit pada suhu 20 oC, pH 6,9. Pengukuran aktivitas lipase dilakukan dengan menggunakan metode Borlongan (1990). Substrat yang digunakan adalah minyak zaitun. Asam lemak yang dihasilkan oleh hidrolisis
81 enzimatik dari trigliserida yang ada dalam emulsi yang stabil dari minyak zaitun dititrasi dengan NaOH. Satu unit aktivitas enzim lipase didefinisikan sebagai volume NaOH 0,05 N yang dibutuhkan untuk menetralisir asam lemak yang dilepaskan selama 6 jam inkubasi dengan substrat dan setelah dikoreksi dengan blanko.
82
83 Lampiran 1. Prosedur ekstraksi oligosakarida/prebiotik
Proses ekstraksi oligosakarida/prebiotik mengacu pada metode Marlis (2008). Sebanyak 500 gram tepung ubi jalar dicampur air dengan perbandingan 1:1 (w/v) dan dikukus pada suhu 100 oC selama 30 menit. Kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 55 oC selama 18 jam. Selanjutnya, digiling dan disaring dengan ayakan hingga tepung kukus ubi jalar dapat terkumpul. Pada proses ekstraksi, sebanyak 10 gram tepung kukus ubi jalar disuspensikan ke dalam 100 mL etanol 70% dan diaduk selama 15 jam menggunakan magnetic stirer pada suhu ruang. Setelah itu dilakukan penyaringan menggunakan kertas saring dan residu dicuci dengan menggunakan etanol 70%. Filtrat yang diperoleh dipekatkan menggunakan evaporator vakum pada suhu 40 oC. Hasil pemekatan disentrifuse pada 5000 rpm selama 10 menit untuk mengendapkan kotoran dan padatan sehingga ekstrak mudah disterilisasi dengan kertas saring 0,2 µm.
Pengukuran total padatan terlarut TPT bertujuan untuk melihat kepekatan padatan terlarut yang berguna pada analisis oligosakarida, tahap pengujian secara in vitro dan pengujian in vivo. Cawan porselin ditimbang (a gram), kemudian sebanyak 1 mL oligosakarida yang diekstraksi dari ubi jalar ditempatkan dalam cawan porselin tersebut, kemudian ditimbang (b gram) dan dimasukkan ke dalam oven selama 24 jam dengan suhu 100 oC. Setelah kering, cawan didinginkan dalam desikator selama 10 menit atau hingga berat cawan stabil, kemudian cawan tersebut ditimbang (c gram). Total padatan terlarut dihitung dengan rumus:
84
Lampiran 2. Hasil Blast 5 isolat bakteri dominan di usus ikan mas perlakuan prebiotik
88
Lampiran 3. Parameter kinerja pertumbuhan
Pakan yang dikonsumsi diestimasikan sebagai perbedaan antara pakan yang diberikan dan pakan yang tidak termakan. Pakan yang tidak termakan disipon dari akuarium dan dikeringkan dalam oven pada suhu 120oC selama 12 jam dan selanjutnya digunakan untuk menentukan nilai FCR. Rasio konversi pakan (FCR) dihitung berdasarkan kuantitas pakan dikonsumsi dan peningkatan biomassa ikan. Parameter pertumbuhan fingerling ikan mas yang dinilai antara lain: laju pertumbuhan spesifik (SGR), rasio konversi pakan (FCR), efisiensi retensi protein (RP) dan lemak (RL) pada akhir eksperimen. Ikan mas uji per ulangan perlakuan ditimbang setiap 10 hari untuk mengetahui bobot tubuh ikan. Data SGR, FCR, RP, dan RL dievaluasi berdasarkan rumus:
Laju pertumbuhan spesifik (SGR) = 100 (loge rata-rata bobot tubuh akhir – loge rata-rata bobot tubuh awal) / DOC (lama pemeliharaan)
Rasio konversi pakan (FCR) = Total jumlah pakan kering yang dikonsumsi (g) / total penambahan bobot tubuh basah (g)
Retensi protein
Retensi protein menunjukkan besarnya protein yang tersimpan dalam tubuh ikan dari protein yang dikonsumsi. Formula yang digunakan adalah:
RP = P
I F
x 100 (Watanabe 1988) dengan : RP = retensi protein (%)
F = kandungan protein tubuh pada akhir percobaan (g) I = kandungan protein tubuh pada awal percobaan (g)
P = jumlah protein yang dikonsumsi (g)
Retensi lemak
Retensi lemak menunjukkan besarnya lemak yang tersimpan dalam tubuh ikan dari lemak yang dikonsumsi. Formula yang digunakan adalah:
RL = P
I F
x 100 (Watanabe 1988) dengan : RL = retensi lemak (%)
F = kandungan lemak tubuh pada akhir percobaan (g)
I = kandungan lemak tubuh pada awal percobaan (g)
P = jumlah lemak yang dikonsumsi (g)
Koefisien kecernaan nutrien pakan ditetapkan melalui metode tidak langsung menggunakan 6 g chromic oxide (Cr2O3) per kg pakan (modifikasi Gomes et al. 1995) selama 30 hari pemeliharaan. Setiap pagi hari pakan yang tidak termakan dan feses disipon 1 jam sebelum jadwal pemberian pakan pertama, kemudian koleksi feses segar dimulai setelah 1 jam pemberian pakan. Feses 5 hari pertama dibuang, dan sampel 25 hari berikutnya dikumpulkan dengan cepat memakai metode pipet (Spyridakis et al. 1989). Sampel feses gabungan dari setiap perlakuan dikeringkan pada suhu 55oC dan disimpan pada suhu −20°C untuk keperluan analisis selanjutnya (Mohanta et al. 2009). Kecernaan bahan kering dinyatakan dengan persentase yang dihitung menggunakan rumus:
89 Koefisien kecernaan bahan kering =
100 – (% Cr2O3 dalam pakan / % Cr2O3 dalam feses x 100). Kecernaan nutrien (protein dan lemak) =
100 – [(% Cr2O3 dalam pakan / % Cr2O3 dalam feses) x (% nutrien dalam feses / % nutrien dalam pakan) x 100].
90
Lampiran 4. Prosedur pengukuran glikogen hati dan otot
Pengukuran kadar glikogen hati dan otot (Metode Wedemeyer dan Yasutake, 1977) dilakukan berdasarkan tahapan-tahapan berikut:
1. Didihkan 100 mg jaringan otot atau hati dalam 3 ml 30% KOH sampai melarut (20-30 menit)
2. Tambahkan 0,50 ml Na2SO4 jenuh dan 3,50 ml 95% ethanol, panaskan 3. Dinginkan, sentrifuse dan buang supernatan
4. Larutkan glikogen dalam 2 ml air dan endapkan kembali dengan 2,5 ml 95% ethanol
5. Buang supernatan dan hidrolisa glikogen yang mengendap selama 30 menit dalam 2 ml 5M HCl dalam waterbath mendidih
6. Dinginkan, dan netralkan dengan 0,50M NaOH (Gunakan 1 tetes phenolred sebagai indikator). Kemudian encerkan sampai suatu volume yang diketahui
7. Tentukan kandungan glukosanya sebagaimana prosedur pengukuran glukosa pada Lampiran 3.
PERHITUNGAN :
Plotkan konsentrasi sampel terhadap kurva standar glukosa (1 gram glikogen = 1,11 gram glukosa)
91 Lampiran 5. Prosedur pengukuran glukosa darah
Pengukuran kadar glukosa darah (Metode Wedemeyer dan Yasutake, 1977) dilakukan berdasarkan tahapan-tahapan berikut:
1. Masukkan 0,05 ml sampel, standar glukosa (konsentrasi 50, 100, 200, 400 mg/100 ml), dan akuades (blanko) ke dalam tabung uji yang terpisah yang telah berisi 3,50 ml color reagent
2. Panaskan semua tabung dalam water bath mendidih selama 10 menit, angkat, dan dinginkan sampai temperatur ruang. Warna ini stabil selama 1 jam
3. Baca absorbansi sampel dan standar glukosa pada panjang gelombang 635 nm. Nolkan colorimeter dengan menggunakan reagent blanko
92
Lampiran 6. Prosedur pengukuran trigliserida darah
Pengukuran kadar trigliserida darah (Kit GPO-Enzimatik, ST Reagensia) dilakukan berdasarkan tahapan-tahapan berikut :
1. Membuat larutan kerja yang telah disediakan dalam kit trigliserida dari ST Reagensia
2. Pengukuran kadar trigliserida dilakukan berdasarkan tahapan-tahapan berikut:
Ke dalam tabung reaksi Blanko Standar Sampel
Plasma darah - - 10 µl
Standar - 10 µl 10 µl
Larutan kerja 1 ml 1 ml 1 ml
Campur sampai merata dan biarkan pada suhu kamar selama 20 menit
3. Baca absorbansi sampel dan standar terhadap blanko pada panjang gelombang 500 nm
93
Lampiran 7. Prosedur pengukuran kadar kolesterol, HDL dan LDL
Kadar kolesterol diukur menggunakan metode CHOD-PAP, Enzymatic Colorimetric Test dengan Lipid Clearing Factor (LCF) setelah proses hidrolisis enzimatik dan oksidasi. Indikator quinoneimine digunakan untuk penanda keberadaan phenol dan peroksidase dalam reaksi hidrogen peroksida dan 4-aminophenazone.
Prosedur penentuan kadar kolesterol menggunakan standar:
C = 200 x [ΔA sampel / ΔA STD] (mg/dl); C = 5.17 x [ΔA sampel / ΔA STD] (mmol/l)
Pipet ke dalam kurvet
Blanko reagen Sampel / STD
Sampel / STD - 10 µl
RGT 1000 µl 1000 µl
Campur, inkubasi 10 menit suhu 20-25 oC atau 5 menit suhu 37 oC. Ukur absorbansi sampel STD dibandingkan dengan blanko reagen (ΔA) dalam 60 menit. HDL kolesterol diukur berdasarkan metode presipitasi (pengendapan) dan standard menggunakan Human cholesterol liquicolor test kit. Kilomikron terdiri dari VLDL (very low density lipoproteins) dan LDL (low density lipoproteins) diendapkan dengan menambahkan phosphotungstic acid dan magnesium klorida. Setelah disentrifuse cairan supernatan yang mengandung fraksi HDL (high density lipoproteins) dipakai untuk mengukur HDL kolesterol menggunakan Human Cholesterol liquicolor reagent.
1. Metode presipitasi (pengendapan) Pipet ke dalam tabung
sentrifuse
Makro Semi-mikro
Sampel 500 µl 200 µl
PRECa 1000 µl -
PRECb - 500 µl
Campur, inkubasi 10 menit suhu ruang, sentrifuse 10000 g 2 menit, atau 4000 g 10 menit. Setelah sentrifuse, pisahkan supernatan jernih dari endapan dalam 1 jam dan tentukan kadar kolesterol menggunakan Human Cholesterol liquicolor reagent.
2. Penentuan kadar HDL menggunakan standar Pipet ke dalam kurvet Blanko reagen STD Sampel Akuades 100 µl - - STD - 100 µl - HDL supernatan - - 100 µl Reagen 1000 µl 1000 µl 1000 µl
Campur, inkubasi 5 menit suhu 37 oC atau 10 menit 20-25 oC. Ukur absorbansi sampel dan standar dibandingkan dengan blanko reagen dalam 60 menit (ΔA).
94
Perhitungan kadar HDL kolesterol menggunakan standar: 1. Metode Makro
C = 150 x [ΔA sampel / ΔA STD] (mg/dl); C = 3.87 x [ΔA sampel / ΔA STD] (mmol/l)
2. Metode Semi-mikro
C = 175 x [ΔA sampel / ΔA STD] (mg/dl); C = 4.52 x [ΔA sampel / ΔA STD] (mmol/l)
Perhitungan kadar LDL kolesterol
Kadar LDL kolesterol (LDL-C) dihitung dari total kadar kolesterol (TC), kadar HDL kolesterol (HDL-C) dan kadar trigliserida (TG).
LDL-C = TC – HDL-C – [TG/5] (mg/dl); LDL-C = TC – HDL-C – [TG/2.2] (mmol/l)
95 Lampiran 8. Metode pengukuran gambaran darah dan patologi klinik darah 1. Kadar hemoglobin diukur mengikuti metode Sahli dengan Sahlinometer
(Wedemeyer dan Yasutake, 1977), dengan cara mengisi tabung sahlinometer dengan larutan HCl 0.1 N sampai angka 10 (garis skala paling bawah pada tabung sahlinometer). Tabung tersebut ditempatkan di antara 2 tabung dengan warna standar. Darah ikan diambil dari tabung eppendorf dengan pipet sahli sebanyak 0,02 ml. Bersihkan ujung pipet, masukkan darah ke dalam tabung Sahli dan diamkan 3 menit. Tambahkan akuades dengan pipet tetes sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan gelas pengaduk sampai warnanya tepat sama dengan warna standar. Kadar hemoglobin dinyatakan dalam %.
2. Kadar hematokrit diukur dengan metode Anderson dan Siwicki (1992), yaitu dengan memasukkan sampel darah dari 5 ekor ikan per unit penelitian ke dalam tabung mikrohematokrit secara kapiler hingga terisi 80% bagian, kemudian ujung tabung disumbat dengan kretoseal. Selanjutnya disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Pengukuran kadar hematokrit dilakukan dengan membandingkan volume padatan sel darah dengan volume seluruh darah dengan skala hematokrit.
3. Total leukosit dihitung menurut metode Blaxhall dan Daisley (1973), yaitu sampel darah dihisap dengan pipet sampai skala 0,5 (pipet yang digunakan adalah pipet khusus pengukuran leukosit), dilanjutkan dengan menghisap larutan Turk‟s sampai skala 11 sambil goyangkan pipet agar bercampur homogen. Buang tetesan pertama, tetesan berikutnya dimasukkan ke dalam hemasitometer dan tutup dengan kaca penutup. Perhitungan dilakukan pada 5 kotak besar hemasitometer. Jumlah leukosit = jumlah sel leukosit terhitung X 50 sel/mm3.
4. Jenis leukosit dihitung menurut petunjuk Blaxhall dan Daisley (1973). Pemeriksaan dilakukan dengan membuat sediaan ulas darah dari 5 ekor ikan per unit penelitian, dikering udarakan, kemudian difiksasi dengan methanol selama 5 menit. Dibilas dengan akuades, kemudian dikering udarakan dan dilanjutkan dengan pewarnaan Giemsa 15 menit. Dicuci kembali dengan air mengalir dan dikering udarakan. Jenis lekosit dihitung sampai jumlah 100 sel. 5. Total eritrosit dihitung menurut metode Blaxhall dan Daisley (1973), yaitu
menghisap sampel darah ikan dengan pipet berskala sampai 0.5, selanjutnya menghisap larutan Hayem sampai skala 101 sambil digoyangkan agar bercampur homogen. Tetesan pertama dibuang, berikutnya diteteskan ke dalam hemasitometer dan tutup dengan kaca penutup. Perhitungan dilakukan pada 5 kotak kecil hemasitometer. Jumlah eritrosit = jumlah eritrosit terhitung X 104 sel/mm3.
6. Respiratory burst dari hemosit diukur berdasarkan reduksi NBT (nitroblue tetrazolium) sebagai ukuran superoxide anion (O2-). Sebanyak 50 µL darah diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 oC. Selanjutnya darah dibuang dan dibilas menggunakan PBS pH 7,4. Kemudian ditambahkan 100 µL NBT 0,2% dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 oC. Buang larutan NBT dan tambahkan 100 µL metanol absolut selama 10 menit. Selanjutnya metanol dibuang dan dibilas menggunakan metanol 30% yg dilarurkan dalam PBS pH 7,4. Tambahkan 60 µL KOH (1M) dan 70 DMSO (dimethylsulfoxide). RB
96
activity diukur dengan melihat densitas optikal (OD) menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 630 nm (Anderson dan Siwicki 1993).
7. Aktivitas fagosit oleh sel fagosit (% PI) diukur mengikuti metode Anderson dan Siwicki (1992), yaitu dengan memasukkan sampel darah dari 5 ekor ikan per unit penelitian ke dalam sumur microplate steril sebanyak 0.1 ml dan ditambahkan 0.1 ml suspensi Staphylococcus aureus dalam PBS (107 sel), dicampur sampai homogen, lalu disimpan dalam water bath suhu 25 oC selama 30 menit, digoyang perlahan setiap 10 menit. Setelah inkubasi, 50 μl suspensi dipipet ke kaca preparat untuk membuat preparat ulas. Setelah dikering udarakan, ulasan difiksasi dengan methanol selama 3 menit. Kaca preparat dibilas dengan larutan antikoagulan untuk membuang sel darah yang tidak melekat, dikering udarakan, berikutnya diwarnai dengan larutan Giemsa selama 5 menit, lalu dicuci dengan air mengalir dan dikering udarakan. Jumlah sel darah fagositik dan non-fagositik dihitung di bawah mikroskop. Rasio fagositosis dihitung dengan rumus: % PI = (jumlah sel darah fagositik / jumlah sel darah teramati) x 100.
8. Aktivitas lisozim dapat diuji dengan dengan metode Ellis (1990) yang dimodifikasi. Plasma (30 μL) ditambahkan suspensi cair bakteri Micrococcus lysodeikticus (Sigma) sebanyak 170 μL (0,2 mg/mL dalam 0,1 M Phosphate buffered saline pH 6.2 pada suhu 25 oC). Dilakukan dua kali pembacaan adsorpsi pada panjang gelombang 540 nm di microplate reader selama 30 detik pencampuran dan 30 menit pencampuran. Unit aktivitas lisozim akan dibatasi sejumlah enzim yang menyebabkan penurunan absorbans 0,001/menit.
97
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Surabaya pada tanggal 28 Maret 1970 sebagai anak kedua dari pasangan Djoehari dan Christine Mary Sapulete. Pendidikan sarjana ditempuh di Program Studi Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya, lulus pada tahun 1994. Pada tahun 2002, penulis diterima di Program Studi Ilmu Perairan pada Program Pascasarjana IPB dan menamatkannya pada tahun 2005. Kesempatan untuk melanjutkan ke program doktor pada Program Studi Ilmu Akuakultur dan pada perguruan tinggi yang sama diperoleh pada tahun 2011. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari Kementerian Riset Teknologi dan Pendidikan Tinggi Republik Indonesia.
Penulis bekerja sebagai Staf Pengajar di Fakultas Pertanian Jurusan Perikanan Program Studi Budidaya Perairan Universitas Palangkaraya sejak tahun 2000. Bidang keilmuan yang menjadi tanggung jawab peneliti ialah kesehatan ikan. Menikah dengan Evi Mirnayanti, SE dan dikaruniai satu orang anak Samuel Mozart Joviano.
Sebuah artikel telah diterbitkan dengan judul Characterization of Bacillus sp. NP5 and its Application as Probiotic for Common Carp (Cyprinus carpio) pada Research Journal of Microbiology pada tanggal 15 April 2016, volume 11 halaman 101-111. Artikel lain berjudul Growth Performances and Health Status of Common Carp (Cyprinus carpio) Supplemented by Prebiotic from Sweet Potato (Ipomoea batatas L.) Extract sedang menunggu penerbitan di Pakistan Journal of Nutrition pada tahun 2016, volume 15 (x): xx-xx. Karya-karya ilmiah tersebut merupakan bagian dari program S-3 penulis.