METODOLOGI PENELITIAN
F. Definisi Operasional
1. Penderita PGK stadium V adalah penderita yang memenuhi kriteria seperti di bawah ini :
a. Kerusakan ginjal (renal damage) yang terjadi lebih dari tiga bulan, berupa kelainan struktural atau fungsional, dengan atau tanpa penurunan laju filtrasi glomerulus (LFG), dengan manifestasi :
1) Kelainan patologis.
2) Terdapat tanda kelainan ginjal, termasuk kelainan dalam komposisi darah atau urin, atau kelainan dalam test pencitraan (imaging test). b. Laju filtrasi glomerulus (LFG) kurang dari 60 ml/menit/1,73m2 selama
commit to user
Stadium V : Bila Laju Filtrasi Glomerulus < 15 mL/ menit, penderita mengalami PGK tanpa melihat penyebabnya, penderita sudah menjalani CAPD selama minimal tiga bulan. Sebelum dilakukan CAPD, pasien PGK stadium V harus memenuhi pra syarat untuk bisa dilakukan CAPD. Prasyarat ini sekaligus merupakan kriteria inklusi dari sampel yang diikutkan dalam penelitian.
Kriteria inklusi :
1. Pasien sudah tegak diagnosis PGK stadium V yang dibuktikan dengan pemeriksaan USG ginjal, laboratorium darah dan pemeriksaan urin memenuhi kriteria K/ DOQI 2002 dan memenuhi persyaratan untuk menjalani CAPD.
2. Usia 20-59 tahun.
3. Telah menjalani CAPD selama lebih dari tiga bulan sampai 5 tahun. Kriteria eksklusi :
1. Pasien PGK dengan nefropati diabetik stadium V.
2. Pasien PGK yang sedang menjalani terapi dengan steroid. 3. Pasien PGK stadium V dengan keganasan.
4. Pasien dalam kondisi infeksi/ sepsis. 5. Pasien menderita hepatitis B dan atau C.
6. Pasien peminum alkohol, perokok, obesitas dan dalam terapi asam folat. Keterangan tambahan definisi kriteria eksklusi:
commit to user
Nefropati diabetik merupakan salah satu komplikasi mikroangiopati diabetik pada ginjal, yang dapat berakhir pada penyakit ginjal kronik. Nefropati diabetik didefinisikan sebagai sindrom klinis pada pasien diabetes melitus yang ditandai dengan albuminuria menetap (>300 mg/24 jam atau 200 µg/menit) pada minimal dua kali pemeriksaan dalam kurun waktu 3 sampai 6 bulan (Hendromartono, 2006).
Pada pasien PGK, penanda biologis inflamasi tidak hanya berkorelasi dengan fungsi ginjal namun juga dengan albuminuria. TNF-α, IL-6, TNFR2, ICAM-1, dan protegerin meningkat seiring dengan meningkatnya rasio albumin/kreatinin urin (Upadhyay dkk., 2011).
2. Terapi steroid
Glukokortikoid memiliki efek anti inflamasi dan imunomodulator. Kortisol menghambat transkripsi pengkodean gen sitokin pro inflamasi dengan cara menurunkan aktivitas nuclear factor kappa (NF-кB) sebagai hasilnya, kortikosteroid akan menghambat sintesis atau aksi sebagian besar sitokin pro inflamasi (Rhen dan Cidlowski, 2005).
Meskipun efek anti inflamasi kortikosteroid terutama disebabkan oleh penekanan sintesis sitokin pro inflamasi (TNF-α, IL-1β, IL-6), sebagian efek juga disebabkan peningkatan produksi sitokin anti inflamasi seperti IL-10. Glukokortikoid menyebabkan pergeseran dari respon Th1 ke respon Th2, di mana akan terjadi peningkatan produksi IL-4, IL-10 dan IL-13 (Ramizem, 1996).
commit to user
Kortikosteroid mampu memblok jalur inflamasi melalui sejumlah jalur. Antara lain kortikosteroid mampu menghambat produksi prostaglandin melalui (i) induksi dan aktivasi annexin-1, (ii) induksi MAPK fosfatase-1, dan (iii) menekan transkipsi cyclooksigenase-2. Kortikostreroid juga dapat menghambat produksi sitokin-sitokin pro inflamasi melalui penghambatan aktivasi NF-kB (Rhen dan Cidlowski, 2005; Guntur, 2010).
3. Keganasan
Inflamasi kronis telah dikaitkan dengan beberapa keganasan solid, antara lain kanker oesofagus, gaster, hepar, pankreas, ginjal, dan prostat. Mekanisme yang mungkin di mana inflamasi dapat berkontribusi terhadap karsinogenesis antara lain: (i) interaksi sitokin dan faktor pertumbuhan yang memicu pertumbuhan sel tumor, (ii) induksi cyclo-oxygenase-2 pada makrofag dan sel epitel; dan (iii) pembentukan spesies oksigen dan nitrogen reaktif mutagenik.
C-reactive protein merupakan penanda inflamasi general yang kadarnya meningkat oleh sitokin pro-inflamasi antara lain IL-6, IL-8, dan TNF-α. Kadar CRP diketahui meningkat pada keganasan (Mazhar, 2006). 4. Infeksi dan sepsis
Infeksi adalah istilah untuk menamakan keberadaan berbagai kuman yang masuk ke dalam tubuh manusia. Bila kuman berkembang biak dan menyebabkan kerusakan jaringan disebut penyakit infeksi. Pada penyakit infeksi terjadi jejas sehingga timbullah reaksi inflamasi. Pada
commit to user
reaksi inflamasi berbagai jenis sel akan teraktivasi dan memproduksi berbagai jenis mediator inflamasi termasuk berbagai sitokin. Termasuk sitokin pro-inflamasi adalah TNF-α, IL-1, INF-γ.
Systemic inflammatory response syndrome adalah sindroma yang ditandai oleh dua atau lebih kriteria sebagai berikut:
a. Suhu > 38 C atau < 36 C
b. Denyut jantung > 90 kali / menit
c. Respirasi > 20 kali / menit atau Pa CO2 < 32 mmHg d. Hitung leukosit > 12.000/mm3 atau > 10 % sel immatur
Sepsis adalah SIRS ditambah tempat infeksi yang diketahui (ditentukan dengan biakan positif terhadap organisme dari tempat tersebut). Berdasarkan konferensi internasional pada tahun 2001 terdapat tambahan terhadap kriteria sebelumnya. Dimana pada konferensi tersebut menambahkan beberapa kriteria baru untuk sepsis. Bagian yang terpenting adalah dengan memasukkan petanda biomolekuler yaitu procalcitonin (PCT) dan C reactive protein (CRP) sebagai langkah awal dalam diagnosa sepsis (Guntur, 2008).
5. Hepatitis viral B dan C
Pada hepar, TNF-α terlibat dalam patofisiologi hepatitis virus (Schwabe, 2006).
6. Merokok
Merokok berhubungan dengan inflamasi saluran nafas dan sistemik. Berbagai penelitian menunjukkan bahwa perokok mengalami
commit to user
peningkatan kadar sitokin pro-inflamasi antara lain CRP, TNF-α, dan IL-6 (Tanni, 2010).
7. Konsumsi alkohol
Keterkaitan pola-U telah dilaporkan antara asupan alkohol dan tingkat kesehatan, yang menunjukkan bahwa asupan alkohol dapat mempengaruhi kadar acute-phase reactant (Wang, 2008).
8. Obesitas
Obesitas didefinisikan dengan IMT ≥ 30 kg/m2. Pada sebagian besar pasien obes, obesitas terkait dengan inflamasi dalam derajat rendah pada jaringan lemak putih akibat aktivasi kronis sistem imun innate. Pada obesitas, inflamasi jaringan lemak putih ditandai oleh peningkatan produksi dan sekresi sejumlah molkeul inflamasi antara lain TNF-α dan IL-6 (Bastard, 2006).
Pasien yang memenuhi kriteria inklusi dan ekslusi selanjutnya dilakukan randomisasi.
2. Continous Ambulatory Peritoneal Dialysis adalah salah satu bentuk DP kronik untuk pasien dengan gagal ginjal terminal (GGT). GGT adalah merupakan stadium akhir PGK saat pasien sudah tidak dapat lagi dipertahankan secara konservatif dan memerlukan terapi pengganti (renal replacement terapi). Terapi pengganti dapat berupa dialisis kronik atau transplantasi ginjal. Dialisis kronik dapat berupa HD dan DP. Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis (CAPD) dilakukan 3-4 kali sehari @ 2 liter dan tujuh hari seminggu. Pergantian cairan dilakukan setiap 4 – 6 jam pada
commit to user
siang hari dan saat sebelum tidur dengan dwelling time 10 jam malam hari ketika pasien tidur.
3. Tumor Necrosis Factor-Alpha (TNF-α) dibentuk atas 212 asam amino diatur pada homotrimer yang stabil dengan berat molekul 17 kDa. TNF-α adalah suatu sitokin yang bersifat pleiotropik yang mempunyai kemampuan besar terhadap efek proinflamasi pada aterosklerosis dan metabolik lain serta kelainan inflamasi seperti obesitas dan resistensi insulin yang juga merupakan faktor risiko terhadap PJV. TNF-α diproduksi oleh monosit dan makrofag. Kadar TNF-α diukur dari darah sampel yang diambil dari darah vena sebesar 5 cc, sebelum dan delapan minggu setelah pemberian plasebo pada kelompok kontrol, dan sebelum dan delapan minggu setelah pemberian NAS oral pada kelompok perlakuan. Kemudian disentrifuge untuk selanjutnya serum diukur kadar TNF-α secara quantitative dengan metode Human TNF-α/ TNF-SF 1A Immunoassay di laboratorium Prodia Surakarta. Reagen kit yang digunakan untuk pemeriksaan Human TNF-alfa HS Elisa adalah produk R & D System. Minneapolis. MN. USA, Cat : HSTAOOD, Lot : 289275. Kadar TNF-α normal adalah 0,550 – 2,816 pq/mL.
4. Dengan metode pengambilan yang sama kadar PCT serum diperiksa secara kuantitatif melalui Electrochemiluminescence dengan metode ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) dengan alat Elecsys di laboratorium PRODIA. Kadar PCT normal adalah < 0.5 ng/mL.
5. N-Asetil Sistein oral merupakan suatu senyawa yang mengandung tiol dengan efek antioksidan dan antiinflamasi (Nascimento dkk., 2010).
N-commit to user
acetylcysteine (NAS) yang digunakan Fluimucil ZAMBON 600 mg tablet effervescent yang mengandung N-Acetylcysteine 600 mg, yang diberikan 2x600 mg selama delapan minggu pada kelompok perlakuan. Dos berisi 2 kantong @ 5 strip @ 2 tablet effevercent. No. Reg. DKL 0632208811A1. Hindarkan dari jangkauan anak anak. Simpan pada suhu kamar ( 25 0C – 30 0C). Dibuat oleh : PT MUGI Laboratories Bekasi- Indonesia. Dibawah pengawasan : Zambon S.p.a., Vicenza-Italy
G. Waktu
Waktu yang diperlukan dalam penelitian ini adalah delapan minggu.
H. Biaya
Biaya penelitian diperkirakan lebih kurang Rp.20.000.000,-
I. Cara Kerja
Subyek penelitian diberikan informed consent. Subyek dibagi dua kelompok dengan cara diundi memakai gulungan kertas bertuliskan angka 1-34. Satu kelompok (yang berangka genap) mendapatkan perlakuan dengan NAS oral, dan kelompok yang lain (berangka ganjil) mendapatkan perlakuan dengan plasebo. Kelompok yang mendapat perlakuan NAS oral sebelum perlakuan diambil sampel darahnya, kemudian diperiksa Variabel utama kadar TNF-α dan PCT dan variabel-variabel lainya. Kemudian setelah selama delapan minggu
commit to user
diberikan NAS oral 2 x 600 mg, diambil kembali sampel darahnya dan dilakukan pemeriksaan ulang.
Demikian juga dengan kelompok kontrol dengan pemberian plasebo 2 x 1 selama delapan minggu dan dilakukan pemeriksaan seperti pada kelompok perlakuan. Prinsip pemeriksaan TNF-α (Metode Sandwich Enzym Imunoassay). Dalam penelitian ini kadar PCT serum diperiksa secara kuantitatif melalui Electrochemiluminescence dengan metode ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) dengan alat Elecsys di laboratorium PRODIA.
Prinsip pemeriksaan TNF-α (Metode sandwich enzym imunoassay) : Suatu monoklonal antibodi yang spesifik untuk TNF-α diteteskan/precoated pada microplate. Standar dan sampel diteteskan pada cekungan microplate yang sudah dilapis antibodi anti TNF-α tersebut. TNF-α yang ada akan terikat pada antibodi tersebut. Sesudah dilakukan pencucian untuk membuang substansi yang tidak terikat, suatu enzyme-linked policlonal antibodi spesifik untuk TNF-α dimasukkan pada cekungan tersebut. Kemudian dilakukan pencucian lagi. Diberikan larutan substrat pada cekungan tersebut. Sesudah diinkubasi, diberikan cairan amplifier dan akan timbul warna sesuai dengan proporsi kadar TNF-α yang terikat pada antibodi. Perubahan warna yang timbul ditunggu sampai berhenti dan kemudian dilakukan pengukuran.
Penelitian ini kadar PCT dalam serum diperiksa secara kuantitatif melalui Electrochemiluminescence dengan metode ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) dengan alat Elecsys di laboratorium PRODIA.
commit to user
Gambar 4.1. Diagram alur pemeriksaan TNF-α dan PCT