HASIL DAN PEMBAHASAN
4.4 Uji Genotipe Multiple-Drug Resistant Pseudomonas aeruginosa dengan PCR Sampel MDRPA dari hasil uji fenotipe Vitek 2 Compact kemudian diuji
genotipe secara molekuler menggunakan PCR. Produk hasil PCR diperiksa dengan alat elektroforesis dengan konsentrasi agarose 2% untuk medeteksi gen blaIMP,
blaNDM-1, blaSPM-1, blaVIM-2. Hasil PCR seluruh sampel MDRPA diuji dengan
kontrol positif dan kontrol negatif yang ditunjukkan pada Tabel 4.9, sedangkan persentase genotipe gen blaIMP, blaNDM-1, blaSPM-1, blaVIM-2 disajikan pada Tabel 4.10 berikut ini.
Tabel 4.9 Hasil Genotipe MDRPA
No Kode Isolat Genotipe MDRPA
IMP NDM-1 SPM-1 VIM-2
blaSPM-1, blaVIM-2 ditemukan pada tiap isolat P. aeruginosa.
Tabel 4.10 Persentase Genotipe blaIMP, blaNDM-1, blaSPM-1, blaVIM-2
No Genotipe MDRPA Persentase
1 blaIMP 95%
Adapun persentase gen blaIMP pada isolat P. aeruginosa yaitu sebanyak 95%,
blaNDM-1 40%, blaSPM-1 70%, dan blaVIM-2 75%. Hampir semua isolat memiliki lebih dari 1 gen resisten yaitu blaNDM-1 + blaIMP, blaVIM-2 + blaNDM-1, blaSPM-1 +
blaIMP-1 dengan persentase 10% dan blaVIM-2 + blaIMP sebesar 15%. Sebanyak 10%
isolat memiliki 3 gen resisten yaitu blaSPM-1 + blaNDM-1 + blaIMP, 35 % blaSPM-1 +
blaVIM-2 + blaIMP, dan 5% blaSPM-1 + blaVIM-2 + blaNDM-1 Sedangkan isolat yang memiliki 4 gen resisten yaitu blaSPM-1 + blaVIM-2 + blaIMP + blaNDM-1 ada sebanyak 15%. Hal ini menunjukkan bahwa isolat yang memiliki 1 gen resisten mengalami resistensi terhadap antibiotik tersebut, sedangkan isolat yang memiliki lebih dari 1 gen resisten menyebabkan mutasi dan diturunkan secara genetik sehingga resistensi meningkat menjadi multiple-drug resistant Pseudomonas aeruginosa.
Beberapa hasil fenotipe menunjukkan data yang berbeda dengan hasil genotipe. Dapat diketahui bahwa satu spesies memiliki multigen dalam melakukan resistensi pada gen yang diekspresikan sehingga akan menghasilkan protein yang lebih banyak. Jika spesies tersebut tidak memiliki gen multiple, maka protein yang dihasilkan tidak cukup untuk diekspresikan oleh gen resisten. Mekanisme resistensi dengan gen multiple terjadi di plasmid, sehingga gen yang berhubungan dengan plasmid yang dapat terdeteksi. Menurut Rios et al (2018), meskipun ada beberapa isolat yang sensitif terhadap imipenem, namun diperkirakan bahwa isolat mungkin mendapatkan gen resisten karbapenem melalui kontak plasmid saat pengobatan serta rendahnya hidrolisis karbapenem oleh keempat gen dan lamanya waktu inkubasi sampel. Adanya tes antimikroba menyebabkan isolat yang saat ini tumbuh di rumah sakit. Namun, jika diasumsikan bahwa isolat P. aeruginosa yang diujikan berasal dari satu isolat yang sama maka pengujian tidak dipermasalahkan meskipun isolat yang diujikan memiliki jangka waktu inkubasi yang berbeda.
4.4.1 Gen blaIMP
Analisis gen blaIMP dilakukan untuk mendeteksi keberadaan gen ini pada 20 isolat klinis P. aeruginosa dan 2 isolat kontrol positif dan negatif yang diuji.
Persentase keberadaan gen blaIMP pada penelitian ini ditemukan sebanyak 95%.
Hasil analisis PCR dan pola pita DNA dengan ukuran pita amplikon 588 bp pada isolat klinis P. aeruginosa dapat dilihat pada Gambar 4.1 berikut.
Gambar 4.1 Pola Pita DNA Gen blaIMP pada Isolat MDRPA
Keterangan : IS = Sputum PU = Pus SW = Swab JR = Jaringan K- = Kontrol Negatif K+ = Kontrol Positif
Dari Gambar 4.1 dapat dilihat bahwa munculnya pola pita DNA menunjukkan adanya gen blaIMP pada isolat klinis P. aeruginosa. Keberadaan gen ini menyebabkan terekspresinya enzim imipenemase sehingga bakteri resisten terhadap antibiotik imipenem. Isolat klinis yang tidak memunculkan adanya pola pita DNA menunjukkan tidak adanya gen blaIMP. Hal ini membuktikan bahwa primer yang telah dirancang oleh Erfani et al (2017) spesifik mendeteksi keberadaan gen
blaIMP pada bakteri dengan ukuran pita amplikon sebesar 588 bp. Pada penelitiannya tidak ditemukan adanya gen blaIMP. Hal yang sama ditemukan oleh Khosravi dan
Target pita DNA memiliki ukuran yang sama, namun yang membedakan satu sama lain yakni ketebalan dan kejelasan pita tersebut. Pita DNA yang relatif tipis dan kurang cerah mengindikasikan bahwa konsentrasi DNA dalam larutan tidak terlalu tinggi. Menurut Nasution et al (2018), konsentrasi template DNA yang terlalu rendah sering menghasilkan pita DNA amplifikasi yang redup dan tidak jelas. Sejalan dengan hal tersebut, volume template DNA sangat berkaitan dengan konsentrasi primer dan volume total reaksi sehingga perlu dicari optimalisasi rasio antara volume
500 bp
template DNA dengan primer. Penampakan pita DNA yang relatif tebal dan terang menunjukkan bahwa pasangan primer berhasil menempel dengan spesifik pada DNA cetakan sampel produk PCR dan proses purifikasi berhasil memurnikan fragmen DNA gen dari pengotor seperti komponen PCR, protein, dan garam. Kontrol positif berfungsi untuk memastikan jika proses amplifikasi berjalan dengan baik sesuai dengan kondisi yang diharapkan. Tidak tampaknya pita DNA pada kontrol negatif menunjukkan tidak terjadi kontaminasi pada komponen PCR.
4.4.2 Gen blaNDM-1, blaSPM-1, blaVIM-2
aeruginosa dapat dilihat pada Gambar 4.2 berikut.
Gambar 4.2 Pola Pita DNA Gen blaNDM-1, blaSPM-1 dan blaVIM-2 pada Isolat
adanya mutasi 1 atau 2 basa yang tidak berpengaruh terhadap protein sehingga primer tidak dapat menempel. Hasil PCR yang menunjukkan pita DNA lebih dari satu mengindikasikan bahwa isolat tersebut memiliki lebih dari satu gen resisten.
Teknik PCR multipleks memiliki keuntungan yang lebih daripada teknik PCR simpleks atau tunggal yaitu waktu penelitian menjadi lebih cepat dimana dapat mendeteksi lebih dari 2 gen serta tidak menggunakan banyak reagen. Markoulatos et al (2002) mengatakan bahwa teknik multipleks pertama kali ditemukan pada tahun 1988 berhasil diaplikasikan pada pengujian DNA termasuk analisis delesi gen, analisis mutasi dan polimorfisme, analisis kuantitatif, dan reverse-transcription (RT)-PCR.
Hasil penelitian oleh Ellington et al (2007), menunjukkan sebanyak 80% gen
blaVIM-2 terdeteksi dari total 60 isolat klinis dan tidak ditemukan adanya gen bla SPM-1 dan blaNDM-1, sedangkan Moosavian and Rahimzadeh (2015) berhasil mendeteksi 12% blaVIM-2 dan tidak ditemukan gen blaSPM-1. Gen ini masih jarang ditemukan di Amerika. Inacio et al (2014) di Brazil, menemukan gen blaSPM-1 sebanyak 30%.
Gen blaNDM merupakan jenis MBL yang baru ditemukan. Prevalensi adanya gen
blaNDM di dunia khususnya di Indonesia kemungkinan masih sangat sedikit. Hal ini dibuktikan bahwa pada penelitian ini hanya menemukan gen blaNDM sebanyak 7 isolat. Pengujian isolat yang lebih banyak diperlukan untuk membuktikan hal tersebut.
BAB V