IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
4.1.1 Marka Molekuler Ikan Nila Putih
Kandidat marka molekuler untuk ikan nila putih didesain dari sekuen mtDNA ikan nila putih, dan ikan nila hitam. mtDNA dari ikan nila putih, dan ikan nila hitam diamplifikasi dengan PCR (Gambar 10), dan selanjutnya disekuensing untuk mendapatkan sekuen mtDNA (Lampiran 1;2;3;4).
Gambar 10. Elektroforegram mtDNA ikan nila hitam (H1-H5), dan ikan nila putih (P1-P5) produk PCR menggunakan primer universal ikan nila. M= marka DNA. Angka di sebelah kiri gambar adalah ukuran fragmen marka DNA. Tanda panah di sebelah kanan gambar menunjukkan produk PCR target.
Gambar 11. Posisi primerforward, danreverse(ditunjukkan dengan tanda panah) dari hasil penyejajaran mtDNA ikan nila hitam dan ikan nila putih.
Kandidat marka molekuler ditentukan dari homologi sekuen, dan perbedaan nukleotida di ujung 3’. Dari hasil penyejajaran (Lampiran 5; 6) diperoleh homologi sekuen yang cukup tinggi (sekitar 90%), sehingga kandidat marka ditentukan dari perbedaan nukleotida di ujung 3’, khususnya guanin (G), dan sitosin (C). Hasil penyejajaran menunjukkan beberapa daerah yang berbeda di ujung 3’ (Gambar 11). Dua pasang primer untuk ikan nila putih didesain, yaitu MtTi-F1: 5’-TCCTATATAAATACATACAAC-3’, dan MtTi-R1: 5’-ACA CACATTAAGTAATATAAC-3’; MtTi-F2: 5’-ACCCACCATCCTATCTTCCG-3’, dan MtTi-R2: 5’-CTCGTGCATTGATA GTACTAG-3’. Set primer tersebut digunakan dalam amplifikasi PCR untuk mencari pasangan primer yang dapat membedakan ikan nila hitam, dan ikan nila putih. Empat kombinasi pasangan primer dilakukan untuk mendapatkan primer yang spesifik untuk ikan nila putih. Berdasarkan suhu annealing dari sekuen primer diperoleh kombinasi program PCR (Tabel 1). Dari hasil PCR, kombinasi primer MtTi-F2 dan MtTi-R1 dapat dijadikan marka molekuler pembeda DNA ikan nila putih, dan ikan nila hitam (Gambar 12).
Tabel 1. Kondisi PCR untuk kombinasi pasangan primer
Program PCR Kombinasi primer MtTi-F1dan MtTi-R1 MtTi-F2dan MtTi-R2 MtTi-F1dan MtTi-R2 MtTi-F2dan MtTi-R1 Pre-denaturasi 94°C; 3 menit 94°C; 3 menit 94°C; 3 menit 94°C; 3 menit Denaturasi 94°C; 30 detik 94°C; 30 detik 94°C; 30 detik 94°C; 30 detik Annealing 47°C; 30 detik 54°C; 30 detik 47°C; 30 detik 47°C; 30 detik Ekstensi 72°C; 30 detik 72°C; 30 detik 72°C; 30 detik 72°C; 30 detik Final ekstensi 72°C; 3 menit 72°C; 3 menit 72°C; 3 menit 72°C; 3 menit
Gambar 12. Elektroforegram mtDNA ikan nila hitam (H1-H5), dan ikan nila putih (P1-P5), produk PCR menggunakan kombinasi primer MtTi-F2, dan MtTi-R1. M= marker DNA. Angka di sebelah kiri gambar adalah ukuran fragmen marka DNA. Tanda panah di sebelah kanan gambar menunjukkan produk PCR spesifik ikan nila putih.
Pengujian sensitivitas PCR dilakukan untuk mengetahui kemampuan primer spesifik yang dijadikan sebagai marka molekuler dalam mendeteksi konsentrasi terendah DNA ikan nila putih di dalam DNA ikan nila hitam. Dari hasil pengujian diperoleh rasio terendah yang dapat dideteksi dengan marka molekuler, yaitu 10 : 200 ng/µL (Gambar 13) yang berarti konsentrasi DNA ikan nila putih terendah yang dapat dideteksi oleh marka molekuler adalah 10 ng/µL di dalam 200 ng/µL DNA ikan nila hitam.
Gambar 13. Elektroforegram dalam pengujian sensitivitas PCR. 200-0.1 = rasio konsentrasi DNA ikan nila putih : ikan nila hitam. M = marker DNA. Produk PCRdiseparasi sebanyak 3 μ L.Angka di sebelah kiri gambar adalah ukuran fragmen marka DNA. Tanda panah di sebelah kanan gambar menunjukkan produk PCR spesifik DNA ikan nila putih. 4.1.2 Transplantasi sel testikular
Pendaran PKH-26 di dalam larva (Gambar 14) terdeteksi sesaat setelah penyuntikan. Hal ini menunjukkan keberhasilan penyuntikan. Selanjutnya larva triploid dipastikan dengan melihat preparat kromosom. Dari 5 individu yang
dianalisis, semuanya menunjukkan adanya 3 kromosom berukuran besar dengan jumlah kromosom 66 (Gambar 15). Hal ini berarti ikan tersebut semuanya triploid.
Gambar 14. Larva ikan nila hitam triploid. a) Larva tanpa fluoresensi; b) Larva sebelum transplantasi; c) Larva sesaat setelah transplantasi.
Gambar 15. Preparat kromosom ikan nila diploid, dan triploid Tanda panah menunjukkan kromosom berukuran besar yang menjadi penanda tingkat ploidi pada ikan nila.
Kolonisasi sel ikan nila putih di dalam gonad ikan nila hitam triploid pada umur 30 hari dapat terdeteksi menggunakan mikroskop fluoresens (Gambar 16). Pendaran PKH-26 di dalam gonad (Gambar 16) menunjukkan sel testikular ikan nila putih berhasil terkolonisasi di dalam gonad ikan nila hitam triploid dengan persentase kolonisasi 80%. Akan tetapi, dari hasil PCR tidak terlihat adanya produk amplifikasi DNA ikan nila putih di dalam gonad ikan nila hitam triploid (Gambar 17). Selanjutnya, hasil amplifikasi DNA dari gonad ikan umur 60 hari, masih menunjukkan hasil yang sama dengan umur 30 hari, yaitu tidak adanya hasil amplifikasi DNA ikan nila putih di dalam gonad ikan nila triploid transplan.
Gambar 16. Fluoresensi PKH-26 di dalam gonad ikan nila hitam triploid transplan umur 1 bulan. (kiri: foto gonad dengan menggunakan filter fluoresens; kanan: foto gonad tanpa menggunakan filter fluoresens).
Gambar 17. Elektroforegram gonad ikan nila hitam 3n transplan umur 1 bulan. M= Marker. 1-9 = DNA gonad ikan nila triploid transplant. P= DNA ikan nila putih. H= DNA ikan nila hitam. Angka di sebelah kiri gambar adalah ukuran fragmen marka DNA. Tanda panah di sebelah kanan gambar menunjukkan produk PCR spesifik DNA ikan nila putih.
Pada identifikasi gonad ikan umur 90 hari terlihat adanya hasil amplifikasi DNA ikan nila putih (Gambar 18). Selanjutnya, nilai GSI ikan nila triploid transplan lebih tinggi daripada ikan nila triploid tanpa transplantasi (Gambar 19).
Kontrol
3n transplan
Gambar 18. Elektroforegram produk PCR menggunakan DNA dari gonad ikan nila hitam triploid transplan umur 90 hari (1=5). P= DNA ikan nila putih. H= DNA ikan nila hitam. M= marker DNA. Angka di sebelah kiri gambar adalah ukuran fragmen marka DNA. Tanda panah di sebelah kanan gambar menunjukkan produk PCR spesifik DNA ikan nila putih.
Gambar 19. Nilai gonadosomatic index (GSI) ikan nila triploid (3nT), dan diploid (2nT) transplan, serta ikan nila triploid (3nK), dan diploid (2nK) tanpa transplantasi pada umur 60, 90, dan 120 hari.
Pada penampakan gonad ikan umur 90, dan 120 hari (Gambar 20) terlihat perbedaan ukuran yang nyata antara gonad ikan nila triploid hasil transplantasi dengan gonad ikan nila triploid tanpa transplantasi. Ukuran gonad ikan nila triploid hasil transplantasi relatif sama dengan gonad ikan nila diploid normal.
Gambar 20. Ukuran ikan dan gonad pada umur 60, dan 120 hari. 3nT= gonad ikan nila triploid transplant. 3nK= gonad ikan nila tanpa transplantasi. 2nT= gonad ikan nila diploid transplant. 2nK= gonad ikan nila diploid tanpa transplantasi.