OKSIDATIF DENGAN PEMBERIAN DIPEPTIDA ALANIL-GLUTAMINA
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil pengamatan level glutation hipokampus pada penelitian pendahuluan disajikan pada Tabel 1. Berdasarkan data pada Tabel 1 terlihat bahwa umur dan stres oksidatif terkait interaksinya berpengaruh signifikan pada penurunan level glutation hipokampus (P<0.05).
Pengamatan level glutation hipokampus oleh pengaruh umur diperoleh bukti bahwa tikus umur 12 bulan mempunyai level glutation tertinggi, yaitu 0.0100 mg/mg atau mengalami peningkatan 34.56% dibanding tikus umur 6 bulan. Adapun tikus umur 24 bulan mempunyai level glutation terendah, yaitu 0.0052 mg/mg jaringan atau mengalami penurunan 30.74% dibanding tikus umur 6 bulan, dan 48.56% dibanding tikus umur 12 bulan. Penurunan secara signifikan level glutation hipokampus juga terjadi pada tikus yang mengalami stres oksidatif (P<0.05). Tikus dengan stres oksidatif menghasilkan level glutation hipokampus 0.0008 mg/mg jaringan atau mengalami penurunan 94.42% dibanding tikus normal. Penurunan level glutation hipokampus pada tikus umur tua atau tikus dengan stres oksidatif menandakan bahwa peningkatan umur atau stres oksidatif mempengaruhi perubahan morfologi dan biokimiawi di hipokampus yang memicu penurunan level glutation.
Tabel 1 Rataan level glutation hipokampus pada tikus yang mengalami penuaan fisiologis dan penuaan akibat stres oksidatif.
Keterangan: Data yang ditampilkan merupakan nilai rataan ± standar deviasi. TS: tanpa stres oksidatif, S: stres oksidatif, U: umur. Tanda * (P<0.05): berpengaruh signifikan.
Peningkatan umur tikus, yaitu 12 bulan dari 6 bulan yang diikuti stres oksidatif menghasilkan level glutation tertinggi di hipokampus, yaitu 0.00098 mg/mg jaringan, meningkat sebesar 34.25%, lebih tinggi dibanding umur tikus lainnya namun lebih rendah dibanding kondisi normal. Bukti ini menggambarkan bahwa tikus umur 12 bulan memiliki kondisi fisiologis yang optimum dibanding umur tikus lainnya. Adapun peningkatan umur tikus, yaitu 24 bulan dari 6 bulan yang diikuti stres oksidatif menghasilkan level glutation hipokampus terendah, yaitu 0.00063 mg/mg jaringan, menurun sebesar 13.70% dengan tingkat penurunan lebih tinggi dibanding umur tikus lainnya (Gambar 7).
Gambar 7 Level glutation hipokampus hasil interaksi antara level umur tikus (hitam) dan level stres oksidatif (abu-abu)
0.01420 0.01911 0.01149 0.00971 0.00073 0.00098 0.00070 0.00063 0.00000 0.00500 0.01000 0.01500 0.02000 6 12 18 24 Lev e l gl ut at ion (m g/m g ja ri n gan )
Level umur tikus (bulan) Level stres
oksidatif
Level glutation hipokampus (mg/mg bobot basah jaringan)
Umur (bulan) 6 TS 0.01420 ± 0.0071 S 0.00073 ± 0.0008 12 TS 0.01911 ± 0.0020 S 0.00098 ± 0.0040 18 TS 0.01149 ± 0.0030 S 0.00070 ± 0.0001 24 TS 0.00971 ± 0.0020 S 0.00063 ± 0.0001 Faktor utama dan interaksi U * S * U-S *
Dringen et al. (2000) melaporkan bahwa kondisi fisiologis yang optimum dapat mendukung laju sintesis antioksidan glutation di hipokampus. Sintesis glutation melibatkan glutation disulfida dalam sel neuron oleh reaksi yang dikatalisis oleh flavoenzim glutation reduktase. Sintesis glutation juga melibatkan prekursor glutation, seperti asam glutamat, sisteina, dan glisina melalui reaksi yang dikatalisis oleh glutamil-sisteina sintetase dan glutation sintetase. Bukti penelitian lain melaporkan tentang kisaran penurunan level glutation hipokampus yang merupakan indikator terjadinya stres metabolik dan gangguan keseimbangan antara kapasitas antioksidan dan oksidan di dalam otak. Penurunan level glutation pada kisaran 30%- 40% merupakan indikator stres metabolik dan gangguan keseimbangan antara kapasitas antioksidan dan oksidan (Dringen et al. 2000). Secara bebas, peningkatan umur atau stres oksidatif pada penelitian ini menghasilkan stres metabolik dan gangguan keseimbangan antara kapasitas antioksidan dan oksidan, namun dalam kondisi interaksi ditemukan level penurunan glutation yang lebih rendah. Hal ini berarti, tikus umur tua yang mengalami stres oksidatif masih memiliki sistem antioksidan glutation yang dapat bekerja secara efektif. Bukti ini diperkuat oleh hasil penelitian yang melaporkan bahwa sistem antioksidan glutation dapat bekerja efektif di sepanjang umur hewan. Efektivitas sistem ini bergantung pada jenis dan tingkat stres, ketersediaan prekursor glutation atau proses-proses lain yang terlibat dengan sistem ini (Dringen et al. 2000).
Hasil pengamatan level glutation hipokampus pada penelitian lanjutan disajikan pada Tabel 2. Berdasarkan data pada Tabel 2 terlihat bahwa umur dan stres oksidatif menurunkan level glutation hipokampus secara signifikan, dan ditemukan interaksi antara umur dengan stres oksidatif (P<0.05). Pada tikus umur 24 bulan terlihat bahwa level glutation hipokampus mengalami penurunan signifikan mencapai 26.34% dibanding tikus umur 12 bulan. Penurunan level glutation hipokampus juga terjadi pada tikus yang mengalami stres oksidatif dengan tingkat penurunan sebesar 7.05% dibanding tikus tanpa stres oksidatif. Hasil ini lebih rendah dibanding penurunan level glutation pada tikus dengan kondisi yang sama pada penelitian pendahuluan, yaitu 94.42%. Perbedaan ini dapat disebabkan oleh jumlah level umur tikus, jumlah ulangan, variasi potensi fisiologis pada setiap umur tikus, maupun faktor-faktor lain yang tidak diketahui. Adapun peningkatan umur tikus,
yaitu 24 bulan dari 12 bulan yang diikuti stres oksidatif menghasilkan penurunan level glutation hipokampus sebesar 24.77%.
Tabel 2 Rataan level glutation hipokampus pada tikus yang mengalami penuaan fisiologis dan penuaan akibat stres oksidatif hasil pemberian dipeptida alanil-glutamina
Stres oksidatif Ala-Glu (%) Level lutation hipokampus (mg/mg bobot basah jaringan)
TS 0 3 5 0.0105 ± 0.00016 0.0111 ± 0.00088 0.0112 ± 0.00084 12 7 0.0158 ± 0.00056 S 0 3 5 0.0088 ± 0.00065 0.0099 ± 0.00042 0.0108 ± 0.00032 Umur (bulan) 7 0.0149 ± 0.00027 TS 0 3 5 0.0065 ± 0.00039 0.0068 ± 0.00051 0.0076 ± 0.00020 24 7 0.0142 ± 0.00038 S 0 3 5 0.0058 ± 0.00045 0.0064 ± 0.00017 0.0074 ± 0.00027 7 0.0138 ± 0.00053 U * Faktor utama S * A * U-S * Interaksi A-U * A-S * A-U-S TN
Keterangan: Data yang ditampilkan merupakan nilai rataan ± standar deviasi. Ala-Glu: dipeptida alanil-glutamina, TS: tanpa stres oksidatif, S: stres oksidatif, A: dipeptida alanil-glutamina, U: umur. Tanda * (P<0.05): berpengaruh signifikan, TN: tidak signifikan.
Penurunan level glutation hipokampus pada tikus umur 24 bulan, tikus stres oksidatif, dan interaksinya menandakan bahwa peningkatan umur dan stres oksidatif terkait interaksinya berpengaruh pada perubahan-perubahan morfologi dan biokimiawi di hipokampus yang memicu penurunan level glutation. Beberapa penelitian telah menunjukkan hasil yang mendukung pendapat tersebut. Balaban et al. (2005) melaporkan stres oksidatif dan peningkatan umur mempunyai dampak pada perubahan struktur, jumlah, dan penurunan efisiensi mitokondria. Sultana et al. (2006) melaporkan bahwa penurunan efisiensi mitokondria dapat menyebabkan
penurunan aktivitas enzim-enzim dalam siklus Krebs dan rantai transpor elektron. Kondisi ini dapat menyebabkan penurunan energi seluler dan gangguan metabolisme glutation di hipokampus (Speakman et al. 2004). Gangguan metabolisme glutation menyebabkan penurunan level glutation di hipokampus (Schulz et al. 2000).
Pengamatan level glutation hipokampus oleh pengaruh dipeptida alanil- glutamina memperlihatkan peningkatan hasil signifikan dan ditemukan interaksi antara dipeptida alanil-glutamina dengan umur atau stres oksidatif (P<0.05). Data pada Tabel 2 menunjukkan bahwa pemberian dipeptida alanil-glutamina mampu meningkatkan level glutation hipokampus. Level glutation tertinggi terlihat pada pemberian dipeptida alanil-glutamina 7%, meningkat 85.76% dibanding kontrol dan lebih tinggi dibanding hasil konsentrasi lainnya. Bukti penelitian ini menunjukkan bahwa level glutation hipokampus sangat dipengaruhi oleh tingkat ketersediaan prekursor glutation. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Cruzat dan Tirapegui (2009) yang melaporkan bahwa dipeptida alanil-glutamina sebagai prekursor glutation dapat meningkatkan konsentrasi glutamina intraseluler dan level glutation. Berg et al. (2006) melaporkan bahwa dipeptida alanil-glutamina mampu melintasi sawar darah otak, dapat dimanfaatkan neuron, dan secara efektif dapat meningkatkan level glutation hipokampus. Dalam neuron hipokampus, dipeptida alanil-glutamina akan dihidrolisis oleh ektopeptidase neuron menjadi glutamina yang secara bertahap akan diambil sebagai prekursor untuk sintesis glutation (Dringen et al. 2000).
Gambar 8 Level glutation hipokampus hasil interaksi antara dipeptida alanil-
glutamina 0% (biru), 3% (hijau), 5% (biru muda), dan 7% (ungu) dengan level umur tikus.
0.0097 0.0062 0.0105 0.0066 0.0110 0.0075 0.0154 0.0140 0.000 0.004 0.008 0.012 0.016 12 24 Lev e l gl ut at ion (m g/m g ja ri n gan )
Pengamatan lebih lanjut menunjukkan bukti bahwa tikus umur 12 bulan dan 24 bulan mengalami peningkatan signifikan level glutation hipokampus setelah diberi dipeptida alanil-glutamina (P<0.05). Level glutation tertinggi terlihat pada tikus umur 12 bulan setelah diberi dipeptida alanil-glutamina 7%, meningkat 58.76% dibanding kontrol, sedangkan tikus umur 24 bulan memiliki peningkatan level glutation lebih tinggi, yaitu 125.81% (Gambar 8). Perbedaan level glutation pada tikus umur 12 bulan dan 24 bulan setelah diberi dipeptida alanil-glutamina menunjukkan adanya interaksi antara kedua faktor tersebut.
Hasil penelitian ini memberi bukti bahwa tikus umur tua yang mengalami penurunan fungsi hipokampus masih mampu memberi respons pada dipeptida alanil- glutamina yang diberikan. Kemampuan dalam merespons dipeptida alanil-glutamina eksogen diduga berkaitan dengan upaya sel-sel neuron hipokampus dalam mempertahankan homeostasis glutation atau mengembalikan fungsi sistem antioksidan glutation dalam rangka memperlambat terjadinya penurunan fungsi hipokampus. Mekanisme ini melibatkan ketersediaan dipeptida alanil-glutamina dalam jumlah banyak yang digunakan untuk mendukung laju sintesis glutation di hipokampus.
Dringen et al. (2000) dan Shulz et al. (2000) melaporkan bahwa hipokampus otak memiliki mekanisme untuk mengembalikan fungsi sistem antioksidan sebagai upaya untuk memperlambat proses penuaan. Salah satu sistem antioksidan yang dapat kembali bekerja secara efektif ialah sistem antioksidan glutation. Namun, efektivitas antioksidan ini sangat bergantung pada tingkat ketersediaan prekursor glutation di dalam otak melalui pemberian prekursor glutation, jumlah dan aktivitas enzim yang terlibat dalam sintesis glutation, dan penurunan tingkat gangguan intraseluler. Secara umum, hasil penelitian memberi gambaran bahwa pemberian dipeptida alanil-glutamina dapat meningkatkan level glutation dan memperbaiki fungsi hipokampus. Meningkatnya level glutation hipokampus mempunyai keterkaitan dengan meningkatnya harapan hidup (Dringen et al. 2000). Dengan demikian, pemberian dipeptida alanil-glutamina efektif dapat memperlambat penuaan hipokampus yang berkaitan dengan penuaan fisiologis.
Pada penelitian ini juga diamati level glutation hipokampus pada tikus tanpa atau dengan stres oksidatif setelah diberi dipeptida alanil-glutamina. Diperoleh bukti
bahwa dipeptida alanil-glutamina dapat meningkatkan level glutation secara signifikan, baik pada tikus stres oksidatif atau tanpa stres oksidatif (P<0.05). Tikus tanpa stres oksidatif memiliki level glutation hipokampus lebih tinggi dibanding tikus dengan stres oksidatif setelah diberi dipeptida alanil-glutamina, namun memiliki peningkatan level yang lebih rendah. Level glutation tertinggi terdapat pada tikus tanpa stres oksidatif setelah diberi dipeptida alanil-glutamina 7%, meningkat 76.47% dibanding kontrol, sedangkan tikus dengan stres oksidatif memiliki peningkatan level glutation sebesar 97.26% (Gambar 9).
Gambar 9 Level glutation hipokampus hasil interaksi antara dipeptida alanil- glutamina 0% (biru), 3% (hijau), 5% (biru muda), dan 7% (ungu) dengan level stres oksidatif.
Hasil penelitian ini memberi bukti bahwa meningkatnya stres metabolik pada hipokampus akan diikuti oleh kemampuan sel-sel neuron hipokampus untuk mengembalikan fungsi sistem antioksidan glutation. Mekanisme ini melibatkan ketersediaan prekursor glutation dalam jumlah yang banyak untuk mendukung laju sintesis glutation di hipokampus. Andreasen et al. (2009) dan Schade et al. (2009) melaporkan bahwa tingkat ketersediaan prekursor glutation yang optimum yang didukung oleh jumlah dan aktivitas enzim alanil-glutamina sintetase atau glutation sintetase dapat meningkatkan laju sintesis glutation dan level glutation di hipokampus (Dringen et al. 2000; Schulz et al. 2000). Berdasarkan hal tersebut, pemberian dipeptida alanil-glutamina 7% sangat berperan dalam menyediakan prekursor glutation di hipokampus dalam mendukung peningkatan laju sintesis
0.0085 0.0073 0.0090 0.0082 0.0094 0.0091 0.0150 0.0144 0.0000 0.0040 0.0080 0.0120 0.0160 TS S Lev e l gl ut at ion (m g/m g ja ri n gan )
glutation dan level glutation pada tikus stres oksidatif. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian yang melaporkan bahwa dipeptida alanil-glutamina dan berbagai sistem yang mendukung kapasitas antioksidan glutation dapat memelihara homeostasis dan meningkatkan level glutation pada berbagai jaringan tubuh yang mengalami stres metabolik akibat stres oksidatif (Roth et al. 2002; Balaban et al. 2006; Jun et al. 2006). Dengan demikian, pemberian dipeptida alanil-glutamina secara efektif dapat meningkatkan level glutation di hipokampus dan dapat memperantarai perlambatan penuaan hipokampus yang berkaitan dengan stres oksidatif.
Sistem antioksidan glutation mempunyai mekanisme kerja sangat efisien dalam menghambat, mencegah, dan memutus produksi radikal bebas atau rantai reaksi radikal bebas. Antioksidan ini mempunyai peran penting dalam pemeliharaan kapasitas ambang antara level antioksidan dan oksidan di dalam jaringan, baik akibat peningkatan umur atau stres oksidatif. Pemeliharaan ini melibatkan peran antioksidan katalase, superoksida dismutase, dan tingkat ketersediaan prekursor yang menopang level glutation di dalam jaringan (Dringen et al. 2000; Schulz et al. 2000). Semakin tinggi tingkat ketersediaan prekursor glutation maka level glutation akan semakin meningkat. Kondisi ini berpengaruh pada penurunan radikal bebas dan kerusakan oksidatif pada komponen biologis membran sel. Penurunan radikal bebas mempunyai korelasi dengan peningkatan integritas membran, jumlah dan stabilitas molekul reseptor membran, protein-protein yang berinteraksi dengan reseptor, pemeliharaan proses-proses seluler yang berhubungan dengan integritas sitoskelet, ekspresi gen, maupun aktivitas enzim yang terlibat dalam proses-proses di sitosol maupun proses respirasi seluler (Bjork et al. 2006; Cruzat dan Tirapegui 2009). Dalam kondisi optimal, siklus pembentukan glutation dan penurunan radikal bebas berjalan sangat efisien dengan melibatkan enzim alanil-glutamina sintetase, glutation sintetase, akseptor gugus glutamil, glutation-S-transferase, glutation peroksidase, glutation reduktase, dan kofaktor NADPH (Dringen et al. 2000; Schulz et al. 2000). Secara keseluruhan, hasil penelitian ini memberi bukti bahwa dipeptida alanil-glutamina secara efektif dapat meningkatkan level glutation hipokampus, baik pada tikus umur 12 bulan atau 24 bulan, pada tikus normal atau stres oksidatif. Level glutation yang meningkat setelah diberi dipeptida alanil-glutamina menunjukkan bahwa sistem antioksidan glutation pada hipokampus masih dapat bekerja secara
efektif, baik pada tikus umur tua atau stres oksidatif. Pemberian dipeptida alanil- glutamina 7% memberi hasil tertinggi pada level glutation di hipokampus, lebih tinggi dibanding konsentrasi lainnya. Hal ini berarti, pemberian dipeptida alanil- glutamina 7% memberi hasil terbaik pada perbaikan fungsi pada penuaan hipokampus, baik pada penuaan fisiologis maupun penuaan akibat stres oksidatif.
SIMPULAN
Penuaan fisiologis dan penuaan akibat stres oksidatif memberi penurunan level glutation hipokampus. Status fungsi hipokampus tertinggi dan terendah hasil penuaan fisiologis dan penuaan akibat stres oksidatif terdapat pada tikus umur 12 bulan dan 24 bulan mengacu pada level glutation tertinggi di hipokampus. Pemberian dipeptida alanil-glutamina 7% memberi hasil terbaik pada level glutation hipokampus yang dapat memperantarai perbaikan fungsi pada penuaan hipokampus tikus, baik penuaan fisiologis maupun penuaan akibat stres oksidatif.