PEMBAHASAN UMUM
SIMPULAN DAN SARAN
Dari hasil penelitian dapat diambil beberapa simpulan sebagai berikut: 1. Penuaan fisiologis dan penuaan akibat stres oksidatif menghasilkan penurunan
level glutation hipokampus. Status fungsi hipokampus tikus tertinggi dan terendah hasil penuaan fisiologis dan penuaan akibat stres oksidatif terdapat pada tikus umur 12 bulan dan 24 bulan.
2. Pemberian dipeptida alanil-glutamina 7% pada tikus dengan dosis hasil konversi dosis 1.66 g/kg bb/hari pada manusia menghasilkan peningkatan konsentrasi dipeptida alanil-glutamina dan level glutation tertinggi pada penuaan hipokampus tikus, baik pada penuaan fisiologis atau penuaan akibat stres oksidatif
3. Konsentrasi dipeptida alanil-glutamina dan level glutation optimum di hipokampus pada tikus dapat memperantarai perbaikan secara optimal respons histo-morfologi, struktur mitokondria, kemampuan belajar atau mengingat, dan aktivitas motorik.
4. Penanganan penurunan fungsi pada penuaan hipokampus, baik yang disebabkan oleh peningkatan umur maupun stres oksidatif dapat dilakukan secara kuratif dengan pemberian konsentrasi optimum dipeptida alanil- glutamina.
Secara keseluruhan, konsentrasi dipeptida alanil-glutamina dan level glutation optimum dapat memperantarai perbaikan fungsi pada penuaan hipokampus tikus, baik pada penuaan fisiologis atau penuaan akibat stres oksidatif.
Untuk memperoleh gambaran yang lebih luas dan komprehensif tentang perbaikan fungsi pada penuaan hipokampus disarankan dilakukan penelitian lanjutan tentang penentuan glutation disulfida dalam hipokampus untuk mendapatkan rasio glutation dan glutation disulfida. Selain itu, juga disarankan dilakukan penelitian lebih lanjut tentang pemberian dipeptida alanil-glutamina dengan konsentrasi di atas 7% dan penggunaan dipeptida atau asam amino lain yang merupakan prekursor glutation, seperti dipeptida alanil-sisteina dan dipeptida alanil-glisina. Penggunaan dipeptida-dipeptida ini dapat dilakukan secara preventif maupun kuratif sebagai upaya perbaikan fungsi pada penuaan hipokampus, terutama pada kasus-kasus yang berkaitan dengan penuaan fisiologis, penuaan akibat stres oksidatif, dan kepikunan.
DAFTAR PUSTAKA
Ahmed OJ, Mehta MR. 2009. The hippocampal rate code: anatomy, physiology, and theory. Trends Neurosci 32(6):329-338.
Aliev G, Palacios HH, Walrafena B, Lipsitt AE, Obrenoviche ME, Morales L. 2009. Brain mitochondria as a primary target in the development of treatment strategies for Alzheimer disease. J Biochem Cell Biol 41: 1989-2004.
Andreasen AS, Pedersen ST, Mortensen OH, van Hall G, Moseley PL, Pedersen BK. 2009. The effect of glutamine infusion on the inflammatory response and HSP70 during human experimental endotoxaemia. Critic Care 13(10):1186- 7696.
Anonim. 2001. Benefits ot the amino acid L-glutamine. Sci Mind 28:04-15.
Balaban RS, Nemoto S, Finkel T. 2005. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell 120:483-495.
Barja G. 2004. Aging in vertebrates, and the effect of caloric restriction: a mitochondrial free radical production-DNA damage mechanism. Biol Rev Camb Philosoph Soc 79:235-251.
Beck G, Sugiura Y, Shinzawa K, Kato S, Setou M, Tsujimoto Y, Sakoda S, Akamaru HS. 2011. Neuroaxonal dystrophy in calcium-independent phospholipase A2β deficiency results from insufficient remodeling and degeneration of mitochondrial and presynaptic membranes. J Neurosci 31 (31):11411–11420.
Berg A, Rooyakcers O, Norberg A, Wernerman J. 2006. Elimination kinetics of L-alanyl-L-glutamine in ICU patients. Biomed Life Sci 29(3):221-228.
Bisaz R, Conboy L, Sandi C. 2009. Learning under stress: a role for the neural cell adhesion molecule NCAM. Neurobiol Learn Mem 91(4):333-342.
Bjork K, Saarikoski ST, Arlinde C, Kovanen L, Osei-Hyiaman D, Ubaldi M, Reimers M, Hyytia P, Heilig M, Sommer WH. 2006. Glutathione-S- transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. J Fas 4:1826-1835.
Bolanos JP, Moro MA, Lizasoain I, Almeida A. 2009. Mitochondria and reactive oxygen and nitrogen species in neurological disorders and stroke: therapeutic implications. Adv Drug Deliv Rev 30:1-17.
Burke SN, Barnes CA. 2006. Neural plasticity in the aging brain. Nat Rev Neurosci 7:30.
Chang CC, Yi CC, Hui CH, Fa YL, Full YC, Han CL, Cho YC, Sun SW, Shou DL. 2006. Methimazole alleviates hepatic encephalopathy in bile-duct ligated cirrhotic rats. J Chin Med Assoc 69(12):563-568.
Chen XJ, Wu YA, Chen FW, Chen FL, Huang Y, Huang XL, Ma XL, Chen T. 2007. Novel human pathological mutations. Hum Genet 122:548.
Chinopoulos C, Vizi VA. 2009. Mitochondria as ATP consumers in cellular pathology. Biochim Biophys Acta 30:1-7.
Cruzat VF, Tirapegui JO. 2009. Effects of oral supplementation with glutamine and alanyl-glutamine on glutamine, glutamate, and glutathione status in trained rats and subjected to long-duration exercise. Nutrition 25:428-435. Cruzat VF, Rogero MM, Borges MC, Tirapegui J. 2007. Current aspects about
oxidative stress, physical exercise and supplementation. Rev Bras Med Esporte 13(5):304e-210e.
Daren KH, Dhaliwalm R, Andrew DRD, Drover J, Cote H, Wischmeyer P. 2007. Optimizing the dose of glutamine dipeptides and antioxidants in critically ill patients: a phase I dose-finding study. J Parent Ent Nut 31(2):109-118. Djavadian RL. 2004. Serotonin and neurogenesis in the hippocampal dentate
gyrus of adult mammals. Acta Neurobiol Exp 64:189-200.
Dringen R. 2000. Metabolism and functions of glutathione in brain. Neurobiol 62:649-671.
Dringen R, Gutterer JM, Hirrlinger J. 2000. Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem 267:4912-4916.
Feoli AM, Siqueira IR, Almeida L, Tramontina AC, Vanzella C, Sbaraini S, Schweigert ID, Netto CA, Perry ML. 2010. Effects of protein malnutrition on oxidative status in rat brain. Nutrition 22:160-165.
Fernandes V, Rogero MM, Tirapegui J. 2010. Effects of supplementation with free glutamine and the peptide alanyl-glutamine on parameters of muscle damage and inflammation in rats submitted to prolonged exercise. Cell Biochem Funct 28:24-30.
Flaring UB, Rooyackers OE, Wernerman J, Hammarqvist F. 2003. Glutamine attenuates post-traumatic glutathione depletion in human muscle. Clin Sci 104:275-82.
Geinisman Y. 2004. Aging, spatial learning, and total synapse number in the rat CA1 stratum radiatum. Neurobiol Aging 25:407.
Green KN, LaFerla FM. 2008. Linking calcium to Abeta and Alzheimer's disease. Neuron 59:190-194.
Guven A, Kaya N. 2005. Determination of reduced glutathion, glutathione-S- transferase and selenium levels in goose liver cells with damage induced by carbon tetrachloride and ethanol. Turk J Vet Anim Sci 29:1233-1238.
Hand CE. 2007. Investigations into intracellular thiols of biological importance. Ontario, Canada. Hlm.1-195.
Hayes JD, McLellan LI. 1999. Glutathione and glutathione-dependent enzymes represent a co-ordinately regulated defence against oxidative stress. Biomed Res 31(4):273-300.
Hjelle OP, Chaudhry FA, Ottersen OP. 1994. Antisera to glutathione: characterization and immunocytochemical application to the rat cerebellum. Eur J Neurosci 6:793-804.
Hobin JA, Ji J, Maren S. 2006. Ventral hippocampal muscimol disrupts context- specific fear memory retrieval after extinction rats. Hippocampus 16:01-10. Hoppins S, Lackner L, Nunnari J. 2007. The machines that divide and fuse
mitochondria. Ann Rev Biochem 76:751-780.
Horner PJ, Gage FH. 2000. Regenerating the damaged central nervous system. Nature 407:963-970.
Humason GL. 1972. Animal Tissue Techniques. San Fransisco: Freeman WH and Co.
Ito HT, Schuman EM. 2011. Functional division of hippocampal area CA1 via modulatory gating of entorhinal cortical inputs. Hippocampus 9:1-15.
Jiang JM, Wang Z, Dong D. 2004. Effects of AGEs on oxidation stress and antioxidation abilities in cultured astrocytes. Biomed Environ Sci 17:79-86. Jun C, Dai CL, Zhang X, Cui K, Xu F, Xu YQ. 2006. Alanyl-glutamine dipeptide
inhibits hepatic ischemia-reperfusion injury in rats. Word J Gastroent 12(9): 1373-1378.
Kordower JH. 2001. Loss and atrophy of layer II entorhinal cortex neurons in elderly people with mild cognitive impairment. Ann Neurol 49:202.
Kiray M. 2005. Deprenyl and the relationship between its effects on spatial memory, oxidant stress and hippocampal neurons in aged male rats. Physiol Res 55:205.
Knierim JJ, Lee I, Hargreaves EL. 2006. Hippocampal place cells: paralles input streams, subregional processing, and implications for episodic memory. Hippocampus 16:755-764.
Kujoth GC, Bradshaw PC, Haroon S, Prolla TA. 2007. The role of mitochondrial DNA mutations in mammalians aging. Plos Genet 23:e24.
Kulkarni C, Kulkarni KS, Hamsa BR. 2005. L-Glutamic acid and glutamine: exciting molecules of clinical interest. Indian J Pharmacol 37(3):148-154. Lemberg A, Fernandez MA. 2009. Hepatic encephalopathy, ammonia, glutamate,
glutamine and oxidative stress. Annals of Hepatol 8(2):95-102.
Liu J, Wanga A, Li L, Huang Y, Xue P, Hao A. 2010. Oxidative stress mediates hippocampal neuron death in rats after lithium–pilocarpine-induced status epilepticus. Seizure 19:165-172.
Lourbopoulos A, Grigoriadis S, Symeonidou C, Deretzi G, Taskos N, Shohami E, Grigoriadis N. 2007. Modified Bielschowsky silver impregnation combined with hematoxylin or cresyl violet counterstaining as a potential tool for the simultaneous study of inflammation and axonal injury in the central nervous system. J Aristotle Univer Med 34(1):31-39.
Markham JA. 2005. Sexually dimorphic aging of dendritic morphology in CA1 of hippocampus. Hippocampus 15:97.
Mates JM, Gomez CP, de Casto IN, Asenjo M, Marquez J. 2002. Glutamine and its relationship with intracellular redox status, oxidative stress and cell proliferation/death. J Biochem Cell Biol 34(5):439-458.
McBride HM, Neuspiel M, Wasiak S. 2006. Mitochondria: more than just a power house. Curr Biol 16:R551–R560.
Melis GCL. 2008. The metabolic pathway of (alanyl-) glutamine into citrulline and arginine in surgical patients (Thesis). The Netherlands: Vrije Universiteitz.
Miller DB, O'Callaghan JP. 2005. Aging, stress and the hippocampus. Ageing Res Rev 4(2):123-40.
Moyer JR, Brown TH. 2006. Impaired trace and contextual fear conditioning in aged rats. Behav Neurosci 120:612.
Munckhof VDP, Kelvin CL, Marie LS, Montgomery J, Blanchet PJ, Sadikot AF, Drouin J. 2003. Pitx3 is required for motor activity and for survival of a subset of midbrain dopaminergic neurons. Develop Disease 130:2535-2542.
Neumann B, Nguyen KCQ, Hall DH, Yakar AB, Hilliard MA. 2011. Axonal regeneration proceeds through specific axonal fusion in transected C. elegans neurons. Develop Dynamics 240:1365-1372.
Nicholson DA. 2004. Reduction in size of perforated postsynaptic densities in hippocampal axospinous synapses and age-related spatial learning impairments. J Neurosci 24:7648.
Owen KN, Cunningham DE, Macdonald G, Rubel EW, Raible DW, Pujol R. 2007. Ultrastructural analysis of aminoglycoside-induced hair cell death in the zebrafish lateral line reveals an early mitochondrial response. J Comp Neurol 502:522-543.
Pamplona R, Portero-Otin M, Sanz A, Requena J, Barja G. 2004. Modification of the longevity-related degree of fatty acid unsaturation modulates oxidative damage to proteins and mitochondrial DNA in liver and brain. Exp Gerontol 39:725-733.
Petit RJ, Hampe A. 2006. Some evolutionary consequences of being a tree. Ann Rev Eco Evol Syst 37:187-214.
Reas ET, Gimbel S, Hales JB, Brewer JB. 2011. Search-related suppression of hippocampus and default network activity during associative memory retrieval. Front Hum Neurosci 112:1-13.
Reddy PH. 2009. Amyloid beta, mitochondrial structural, and functional dynamics in Alzheimer's disease. Exp Neurol 218:286-292.
Ricklefs RE. 2008. The evolutionary ecology of senescence: the evolution of senescence from a comparative perspective. Funct Ecol 22:379-392.
Rosenzweig ES, Barnes CA. 2003. Impact of aging on hippocampal function: plasticity, network dynamics, and cognition. Prog Neurobiol 69:143.
Roth R. 2008. Non nutritive effects of glutamine. J. Nut 138:2025S-2031S.
Roth E, Oehler R, Manhart N, Exner R, Wessner B, Strasser E, Spittler A. 2002. Regulative potential of glutamine relation to glutathione metabolism Nutrition 18(3):217-221.
Salim S, Sarraj N, Taneja M, Saha K, Tejada SMV, Chugh G. 2010. Moderate treadmill exercise prevents oxidative stress-induced anxiety-like behavior in rats. Behav Brain Res 208:545-552.
Schade RSM, Grundling M, Pavlovic D, Starke K, Wendt M, Retter S, Murphy M, Suchner U, Spassov A, Gedrange T, Lehmann CH. 2009. Glutamine and alanyl-glutamine dipeptide reduce mesenteric plasma extravasation, leukocyte
adhesion and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) release during experimental endotoxemia. J Physiol Pharmacol 60(8):19-24.
Schimanski LA, Barnes CA. 2010. Neural protein synthesis during aging: effects on plasticity and memory. Front Aging Neurosci 2:26.
Schneider T, Turczak J, Przewłocki R. 2006. Environmental enrichment reverses
behavioral alterations in rats prenatally exposed to valproic acid: issues for a therapeutic approach in autism. Neuropsychopharmacol 31:36-46.
Schulz JB, Lindenau J, Seyfried J, Dichgans J. 2000. Glutathione, oxidative stress, and neurodegeneration. Eur J Biochem 267:904-4911.
Schuster H, Blanc MC, Rousselot DB, Nakib S, Tourneau AL, Furst P, Cynober
L, Bandt JPD. 2009. Protective effects of glutamine dipeptide and
α-tocopherol against ischemia-reperfusion injury in the isolated rat liver. Clinic Nut 28(3):331-337.
Serra V, Zglinicki T, Lorenz M, Saretzki G. 2003. Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. J Biol Chem 278:6824-6830.
Serrano F, Klann E. 2004. Reactive oxygen species and synaptic plasticity in the aging hippocampus. Ageing Res Rev 3:431.
Shukitt HB. 2004. Effect of age on the radial arm water maze-a test of spatial learning and memory. Neurobiol Aging 25:223.
Sohal RS, Weindruch R. 1996. Oxidative stress, caloric restriction, and aging. Science 273:59-63.
Speakman JR, Talbot DA, Selman C, Snart S, McLaren JS, Redman P, Krol E, Jackson DM, Johnson MS, Brand MD. 2004. Uncoupled and surviving: individual mice with high metabolism have greater mitochondrial uncoupling and live longer. Aging Cell 3:87-94.
Sultana R, Perluigi M, Butterfield DA. 2006. Protein oxidation and lipid peroxidation in brain of subjects with Alzheimer's disease: insights into mechanism of neurodegeneration from redox proteomics. Antioxid Redox Sign 8:2021-2037.
Sunarno, Manalu W, Kusumorini N, Agungpriyono DR. 2012. Peran alanin- glutamin dipeptida dalam mengoptimlakan level glutation di hipokampus dan hubungannya dengan status fungsi hipokampus pada penuaan fisiologis dan penuaan akibat stres oksidatif. Sains Med 4(1):157-165.
Turner PR, O'Connor K, Tate WP, Abraham WC. 2003. Roles of amyloid precursor protein and its fragments in regulating neural activity, plasticity and memory. Prog Neurobiol 70(1):1-32.
Twig G, Elorza A, Molina AJ, Mohamed H, Wikstrom JD, Walzer G, Stiles L, Haigh SE, Katz S, Las G, Alroy J, Wu M, Py BF, Yuan J, Deeney JT, Corkey BE, Shirihai OS. 2008. Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy. Embo J 27:433-446.
Villarreal JS, Dykes JR, Barea-Rodriguez EJ. 2004. Fischer 344 rats display age- related memory deficits in trace fear conditioning. Behav Neurosci 118:1166. Wallace DC. 2005. A mitochondrial paradigmof metabolic and degenerative
diseases, aging, and cancer: a dawn for evolutionary medicine. Annu Rev Genet 39:359-407.
Wang H, Jia G, Huang L, Wu C, Wang K. 2010. Study on the absorption and transport of different glutamine dipeptides in small intestine of weaned piglets. J Anim Plant Sci 7(1):751-759.
Wang L, Maher TJ, Wurtman, Richard J. 2007. Oral L-glutamine increases GABA level in striatal tissue and extracelluler fluid. Fas J 21:1227-1232. Wati H. 2006. A decreased survival of proliferated cells in the hippocampus is
associated with a decline in spatial memory in aged rats. Neurosci 399:171. Wedzony K, Mackowiak M, Zajaczkowski W, Fijal K, Chocyk A, Czyrak A.
2000. An antagonist of 5-HT1A serotonin receptors, attenuates psychotomimetic effects of MK-801. Neuropsychopharmacology 23:547-59. Wolf OT. 2005. Subjective memory complaints in aging are associated with
elevated cortisols levels. Neurobiol Aging 26:1357.
Xavier GF, Costa VCI. 2009. Dentate gyrus and spatial behaviour. Neurosci 33:768-769.
Zeevalk GD, Bernard LP, Guilford FT. 2010. Liposomal glutathione provides maintenance of intracellular glutathione and neuroprotection in mesencephalic neuronal cells. Neurochem Res DOI 10.1007/s11064-010- 0217-0.
Zhu JH, Zhang X, Mcclung JP, Lei XG. 2006. Impact of Cu,Zn-superoxide dismutase and Se-dependent glutathione peroxidase-1 knockouts on acetaminophen-induced cell death and related signaling in murine liver. Exp Biol Med 231:1726-1732.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Prosedur penentuan level glutation hipokampus (Feoli et al. 2010) Preparasi dan penentuan level glutation hipokampus diawali dengan pengambilan dan penyiapan sampel hipokampus. Sampel hipokampus ditimbang, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang memiliki volume 10 mL. Sampel hipokampus dalam tabung reaksi dihomogenisasi dengan menggunakan vorteks untuk mendapatkan homogenat. Larutan asam metafosfat 2% sebanyak 0.75 mL ditambahkan ke dalam tabung reaksi yang berisi homogenat dan selanjutnya dijenuhkan dengan NaCl jenuh sebanyak 0.25 mL. Larutan dikocok dan disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit, dilanjutkan proses filtrasi untuk mendapatkan filtrat berupa supernatan. Filtrat diambil 0.5 mL dilanjutkan dengan penentuan level glutation sesuai prosedur preparasi pembuatan blanko.
Prosedur preparasi pembuatan blanko diawali dengan menyiapkan reagen blanko, yaitu 0.75 mL larutan asam metafosfat 2% yang telah ditambah dengan NaCl jenuh sebanyak 0.25 mL. Tabung reaksi kemudian dimasukkan ke dalam penangas air pada suhu 60ºC selama 5-10 menit. Larutan natrium nitroprusida 5 mM sebanyak 0.25 mL ditambahkan ke dalam tabung reaksi dan kemudian dihomogenisasi dengan menggunakan vorteks. Larutan dalam tabung reaksi yang sudah homogen kemudian ditambah dengan larutan campuran natrium karbonat dan kalium sianida (Na2CO3:KCN) dengan perbandingan 1:1 sebanyak 0.25 mL dan dihomogenisasi kembali. Larutan yang sudah homogen digunakan untuk penentuan absorbansi dari sampel dan beberapa level glutation standar dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm. Pembuatan level glutation standar berada pada kisaran antara 0-10 mM dengan cara melarutkan glutation standar dengan akuades. Masing-masing sebanyak 0.5 mL dari level glutation standar digunakan untuk penentuan absorbansi dan dilanjutkan dengan pembuatan kurva standar untuk menentukan level glutation pada sampel hipokampus.
Lampiran 2 Prosedur penentuan konsentrasi dipeptida alanil-glutamina plasma dan hipokampus (Wang et al. 2010).
Preparasi dan penentuan konsentrasi dipeptida alanil-glutamina pada plasma darah dan hipokampus diawali dengan anestesi tikus. Tikus percobaan yang sudah dianestesi menggunakan kloroform dikorbankan dan dilanjutkan dengan pengambilan darah dan hipokampus. Pengambilan hipokampus dilakukan dengan cara memotong hipokampus yang terletak di bagian ventral medio-lateral. Sampel hipokampus kemudian dimasukkan ke dalam botol yang berisi larutan garam fisiologis (NaCl 0.9%). Hipokampus yang sudah dipotong dibilas dengan larutan Krebs. Larutan Krebs mengandung komposisi bahan (g/L), meliputi: NaCl, 8.0; KCl, 0.3; CaCl2, 0.2; MgCl2, 0.2; glucose, 7.0; HEPES, 6.0, pH7.2. Sampel plasma darah dan hipokampus, masing-masing dimasukkkan ke dalam tabung reaksi (volume 10 mL) secara terpisah yang mengandung larutan Krebs. Setiap tabung reaksi kemudian diinkubasi selama 1 jam pada temperatur 37ºC menggunakan water bath tunggal. Larutan inkubasi dari setiap tabung reaksi kemudian dididihkan selama 5 menit, didinginkan dan dihomogenasi dengan homogenizer untuk mempersiapkan cairan homogenat jaringan hipokampus. Selanjutnya, cairan homogenat jaringan hipokampus dididihkan kembali dalam air mendidih selama 5 menit, kemudian dideproteinasi dengan asam perklorat 6%, dan disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm/menit selama 15 menit. Supernatan diambil dan disimpan pada suhu -70ºC untuk pendeteksian dipeptida alanil- glutamina. Konsentrasi dipeptida alanil-glutamina jaringan hipokampus dideteksi menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 630 nm. Prosedur preparasi pembuatan blanko sesuai prosedur preparasi sampel tanpa menggunakan sampel darah dan hipokampus.
Pembuatan konsentrasi dipeptida alanil-glutamina standar berada pada kisaran antara 0.1-1.0 mM dengan cara melarutkan dipeptida alanil-glutamina standar dengan akuades. Masing-masing sebanyak 0.5 mL dari konsentrasi dipeptida alanil-glutamina standar digunakan untuk penentuan absorbansi dan dilanjutkan dengan pembuatan kurva standar untuk menentukan konsentrasi dipeptida alanil-glutamina plasma darah dan hipokampus.
Lampiran 3 Prosedur pemrosesan sediaan histologi hipokampus dengan pewarnaan hematoksilin-eosin (Humason 1972) dengan beberapa modifikasi
Prosedur pemrosesan sediaan histologi hipokampus dengan pewarnaan hematoksilin-eosin diawali dengan pengambilan dan penyiapan sampel hipokampus bagian kiri. Sampel hipokampus kemudian difiksasi dalam larutan buffer formalin 10% selama 24 jam, diikuti proses dehidrasi menggunakan alkohol bertingkat masing-masing selama 2 jam dan clearing dengan silol minimal 2 jam sebelum dilakukan embedding dalam parafin. Blok jaringan dipotong setebal 10 µm menggunakan mikrotom, kemudian diletakkan di atas gelas objek sehingga diperoleh irisan jaringan yang dikehendaki. Irisan jaringan pada slide selanjutnya dideparafinasi pada silol dengan 3x ulangan masing-masing selama 3 menit, diikuti rehidrasi dengan memasukkan ke dalam alkohol bertingkat. Sebelum pewarnaan, potongan jaringan pada slide dicuci dengan air mengalir selama 1 menit diikuti pencelupan singkat ke dalam akuades. Pewarnaan preparat dengan prosedur pewarnaan hematoksilin-eosin meliputi, pencelupan ke dalam larutan hematoksilin, pencucian dengan air dilanjutkan pencelupan ke dalam pewarna eosin selama ¼-2 menit. Kemudian, dilakukan dehidrasi dengan alkohol bertingkat, diikuti dengan pencelupan ke dalam silol 3x ulangan masing- masing selama 20 detik, kemudian ditetesi dengan entellan dan ditutup dengan gelas penutup.
Sediaan yang sudah diwarnai dengan pewarnaan hematoksilin-eosin diamati dan didokumentasikan dengan mikroskop cahaya yang dilengkapi dengan kamera. Penentuan viabilitas dan mortalitas neuron dengan menggunakan software MacBiophotonics ImageJ pada 5 lapang pandang yang merupakan bagian utama hipokampus dengan luas setiap lapang pandang ± 0.1 mm2. Viabilitas neuron ditentukan berdasarkan afinitas optimal neuron pada pewarnaan hematoksilin-eosin yang memberi respons warna ungu atau biru pada bagian inti dan merah muda pada sitoplasma. Mortalitas neuron ditentukan berdasarkan afinitas pada satu pewarnaan saja yaitu hematoksilin yang memberi respons warna biru pada seluruh bagian neuron.
Lampiran 4 Prosedur pemrosesan sediaan histologi hipokampus dengan pewarnaan perak nitrat Bielschowsky (Lourbopoulos et al. 2007). Prosedur pemrosesan sediaan histologi hipokampus dengan pewarnaan perak nitrat Bielschowsky mengacu pada prosedur yang dilakukan oleh Lourbopoulos et al. (2007) dengan beberapa modifikasi. Pemrosesan sediaan histologi hipokampus bagian kiri dengan pewarnaan khusus perak nitrat diawali dengan pembuatan larutan stok dan reagen. Larutan stok dan reagen yang dipersiapkan meliputi, larutan stok perak nitrat (perak nitrat 5 g dengan akuades 50 mL), larutan amonium hidroksida 1% (ammonium hidroksida 1 mL dengan akuades 100 mL), larutan stok pengembang (formaldehid 20 mL, asam sitrat atau trisodium dihidrat 0.5 g, asam nitrat 2 tetes, akuades 100 mL), dan larutan kerja pengembang (larutan stok pengembang 8 tetes, ammonium hidroksida 8 tetes, akuades 50 mL).
Tahap berikutnya adalah mempersiapkan irisan jaringan pada slide dengan
ketebalan 10 μm. Irisan jaringan pada slide kemudian dideparafinasi dan
direhidrasi dengan menggunakan silol 3x ulangan, alkohol absolut, alkohol 96%, alkohol 70% dilanjutkan dicuci 3 kali dalam akuades masing-masing selama 3 menit. Slide dimasukkan ke dalam 50 mL larutan perak nitrat 10% hangat temperatur 40ºC (dalam inkubator) dan pewarnaan selama semalam. Irisan jaringan menjadi berwarna cokelat terang atau gelap. Slide-slide dimasukkan kembali ke dalam akuades dan dicuci sebanyak 3x, masing-masing selama 3 menit. Ke dalam larutan perak nitrat ditambahkan amonium hidroksida setetes demi setetes secukupnya sampai terbentuk presipitasi dan warna mendung. Slide- slide dimasukkan ke dalam larutan perak nitrat yang sudah ditambah amonium hidroksida dan diinkubasi kembali dalam inkubator pada temperatur 40ºC selama 1-2 jam sampai irisan jaringan berwarna cokelat. Slide-slide dimasukkan ke dalam larutan kerja pengembang kurang lebih selama 1 menit atau kurang dari 1 menit