BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan
Validitas atau sesahihan metode analisis bertujuan untuk membuktikan
metode analisis tersebut secara taat asas dapat memberikan hasil seperti yang
diharapkan. Oleh karena itu diperlukan suatu pedoman mengenai sesahihan metode
analisis (Mulja dan Suharman, 1995). Metode yang valid atau tervalidasi akan
menjamin hasil yang didapat dari percobaan ini dan dapat memberikan hasil dengan
kecermatan dan ketelitian yang memadai dengan menggunakan instrumen yang tepat,
sehingga mampu mengantisipasi permasalahan analisis dalam ketepatan pengukuran
pada kadar senyawa analisis yang kecil didalam matriks sampel. Parameter-parameter
metode yang analisis dalam pengujian antioksidan ini, yaitu akurasi, presisi,
linearitas dan spesifisitas.
Dalam penelitian ini, dilakukan analisis hasil untuk linearitas, akurasi, presisi
dan spesifitas dari metode ini. Validasi analisis ini dilakukan melalui 5 kali
pengerjaan. Untuk analisis validasinya, digunakan data dari kelima pengerjaan yang
Tabel IV. Hasil pengukuran absorbansi seri baku rutin yang direaksikan dengan radikal DPPH
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
Konsentrasi Rutin (µg/mL) Absorbansi Konsentrasi Rutin (µg/mL) Absorbansi Konsentrasi Rutin (µg/mL) Absorbansi 2,65 0,8 2,55 0,751 2,52 0,8 5,3 0,6 5,1 0,622 5,04 0,6 7,95 0,5 7,62 0,512 7,56 0,5 10,6 0,4 10,2 0,402 10,08 0,4 13,25 0,3 12,75 0,296 12,6 0,3 Persamaan regresi linier Persamaan regrei linier Persamaan regrei linier A = 0,0859 A = 0,0855 A = 0,0855 B = -0,041 B = -0,044 B = -0,044 r = -0,9980 r = -0,9992 r = -0,9986 y = -0,041 x + 0,859 y = -0,044 x + 0,89 y = -0,044 x + 0,855 Replikasi 4 Replikasi 5 Konsentrasi Rutin (µg/mL) Absorbansi Konsentrasi Rutin (µg/mL) Absorbansi 2,54 0,8 2,55 0,753 5,08 0,6 5,1 0,624 7,62 0,5 7,65 0,508 10,16 0,4 10,2 0,389 12,7 0,3 12,75 0,296 Persamaan regrei linier Persamaan regrei linier A = 0,0868 A = 0,0858
B = -0,046 B = -0,045 r = -0,9978 r = -0,9985
Tabel V. Hasil pengukuran absorbansi seri fraksi air ekstrak metanolik daun sirih yang direaksikan dengan DPPH
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
Konsentrasi Rutin (µg/mL) Absorbansi Konsentrasi Rutin (µg/mL) Absorbansi Konsentrasi Rutin (µg/mL) Absorbansi 20,16 0,734 20,08 0,733 20,24 0,74 30,24 0,6 30,12 0,595 30,24 0,6 40,32 0,457 40,16 0,455 40,48 0,46 50,4 0,364 50,2 0,34 50,6 0,34 60,48 0,308 60,24 0,203 60,72 0,2 Persamaan regresi linier Persamaan regrei linier Persamaan regrei linier A = 0,927 A = 0,991 A = 0,997 B = -0,010 B = -0,013 B = -0,013 r = -0,9999 r = -0,9995 r = - 0,9997 y = -0,010 x + 0,927 y = -0,013 x + 0,991 y = -0,013 x + 0,997 Replikasi 4 Replikasi 5 Konsentrasi Rutin (µg/mL) Absorbansi Konsentrasi Rutin (µg/mL) Absorbansi 20,32 0,735 20,48 0,735 30,48 0,6 30,72 0,598 40,64 0,462 40,96 0,46 50,8 0,339 51,2 0,341 60,69 0,201 61,44 0,199 Persamaan regrei linier Persamaan regrei linier A = 0,1001 A = 0,998
B = -0,013 B = -0,013 r = 0,9998 r = 0,9997
Data ini digunakan untuk menghitung akurasi dan presisi.
Analisis presisi (nilai Coefficient of variation) dan akurasi (nilai recovery) seri baku
rutin menggunakan persamaan linear regresi dari replikasi 2 dengan persamaan
y = -0,044 x + 0,859 (Tabel IV) karena nilai r yang dihasilkan merupakan yang paling
baik ( 1 atau -1) dari kelima replikasi yang telah dilakukan.
Berdasarkan hasil lima persamaan regresi linier dalam tabel V dipilih satu
persamaan dengan nilai r yang paling mendekati 1 atau -1. Persamaan replikasi 1
dengan persamaan y = -0,010 x + 0,927 dengan nilai r = 0,9999 yang digunakan
untuk menghitung recovery dan coefficient of variation (CV) untuk fraksi air ekstrak
metanol daun sirih.
1. Lineritas metode uji antioksidan
Linearitas menunjukkan kemampuan metode untuk menghasilkan hasil uji
yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit dalam sampel. Dari 5
repikasi yang dilakukan untuk validasi metode analisis rutin , didapatkan bahwa hasil
dari repliksi 2 mempunyai harga koefisien korelasi yang paling baik,
dimana r = 0,9992. Nilai r yang memenuhi persyaratan linearitas yang baik menurut
Mulja dan Hanwar (2003) adalah lebih besar dari 0,999, sehingga nilai r yang
dihasilkan dalam penelitian ini masih dapat diterima karena masih berada di atas nilai
r yang dipersyaratkan. Hal ini menunjukkan bahwa metode yang digunakan dalam
Persamaan regresi linier fraksi air ekstrak metanolik daun sirih, dari 5
replikasi yang dilakukan didapatkan hasil dari replikasi 4 yang paling baik, dengan
nilai r = 0,9998. Nilai r yang memenuhi persyaratan linearitas yang baik menurut
Mulja dan Hanwar (2003) adalah lebih besar dari 0,999, sehingga nilai r yang
dihasilkan dalam penelitian ini masih dapat diterima karena masih berada di atas nilai
r yang dipersyaratkan. Jadi metode ini memiliki linieritas yang baik untuk
menganalisis fraksi air ekstrak metanol daun sirih.
2. Akurasi metode uji antioksidan
Akurasi merupakan analisis kedekatan hasil analisis yang diperoleh dengan
menggunakan metode analisis tertentu, dengan nilai yang sebenarnya. Penentuan
akurasi metode analisis dapat dilakukan dengan membandingkan kadar terukur
dengan kadar teoritisnya. Hasil perbandingan tersebut disebut % perolehan kembali
(recovery) (Dirjen POM, 1995). Suatu metode analisis dikatakan mempunyai akurasi
yang baik apabila memberikan hasil recovery antara 75-125% untuk analit dengan
konsentrasi kurang dari 0,1% (b/v) (Kingstone, 2004)
Tabel VI. Nilai perolehan kembali (% recovery) uji aktivitas antioksidan rutin
% Recovery
Replikasi Konsentrasi terkecil Konsentrasi tengah Konsentrasi tertinggi
I 90,0377 90,6289 93,8264 II 96,2745 103,0850 100,3530 III 96,5079 104,6560 101,0560 IV 92,8740 103,8320 100,2600 V 92,7059 104,2750 99,8667
Berdasarkan tabel VI, ketiga macam konsentrasi yang diuji dalam validasi
metode ini mempunyai rata-rata nilai recovery 93,680%, 101,29538%, dan
99,07242% berturut turut untuk konsentrasi terkecil, tengah, dan tinggi, sehingga
semua seri konsentrasi DPPH yang diuji mempunyai nilai rata-rata perolehan kembali
yang masuk dalam rentang nilai recovery yang dipersyaratkan (antara 75-125%). Hal
ini berarti bahwa untuk menganalisis rutin metode ini sudah mempunyai akurasi yang
baik untuk penelitian ini.
Tabel VII. Nilai perolehan kembali (% recovery) uji aktivitas antioksidan fraksi air
% Recovery Replikasi Konsentrasi terkecil (%) Konsentrasi tengah (%) Konsentrasi tertinggi (%) I 95,734 116,567 102,348 II 96,613 117,530 120,186 III 94,861 116,354 119,730 IV 94,488 114,419 119,624 V 93,750 114,014 118,490
Berdasarkan data dari tabel VII. recovery fraksi air ekstrak metanolik daun
sirih ada pada rentang 93,750 – 120,186 % . Hasil ini masih berada pada rentang
recovery yang masih bisa diterima yaitu antara 75-125% % untuk analit dengan
konsentrasi kurang dari 0,1% (b/v) (Kingstone, 2004). Kesimpulannya metode ini
3. Presisi metode uji antioksidan
Parameter presisi menunjukkan keterulangan dan ketertiruan hasil yang
diperoleh. Presisi dari metode analisis dinyatakan dalam CV (Coeffisien of Variant),
dimana dalam menghitung CV dilihat dari hasil yang didapat pada tiga tingkatan
konsentrasi dalam lima kali replikasi. Semakin kecil nilai CV yang didapat semakin
baik presisi metode yang dipakai dengan kata lain makin kecil simpangan relatif yang
dihasilkan oleh suatu metode maka validitas metode tersebut semakin terjamin.
Presisi merupakan simpangan baku dari beberapa kali penentuan kuantitatif terhadap
sampel yang dianalisis dengan metode terpilih. Harga simpangan relatif tergantung
dari besar kecilnya kadar zat yang dianalisis, panjang tahapan prosedur analisis, jenis
zat yang dianalisis dan kecanggihan alat yang digunakan. Menurut Kingstone (2004),
CV yang baik adalah CV≤ 20% untuk konsentrasi analit <0,1%b/v.
Tabel VIII. Nilai CV uji aktivitas antioksidan rutin
Konsentrasi Konsentrasi rata-rata SD % CV Terkecil 2,3992 0,04247 1,7701
Tengah 7,7784 0,32229 4,1433 Terbesar 12,6852 0,144 1,1351
Tabel IX. Nilai CV uji aktivitas antioksidan fraksi air
Konsentrasi Konsentrasi rata-rata SD % CV Terkecil 19,26 0,0894 0,4642
Tengah 46,9 0,2872 0,6124 Terbesar 70,48 4,7986 6,8085
Berdasarkan tabel VIII dan tabel IX, ketiga macam konsentrasi yang diuji
dalam uji aktivitas antioksidan ini mempunyai nilai CV 1,7701 %, 1,4133 %, 1,1351
% dan untuk uji antioksidan rutin mempunyai nilai 0,4642%, 0,6124%, 6,8085%
berturut turut untuk konsentrasi terkecil, tengah, dan tertinggi, sehingga semua seri
konsentrasi DPPH yang diuji mempunyai nilai CV yang masuk dalam rentang nilai
CV yang dipersyaratkan untuk konsentrasi analit <0,1% (b/v), yaitu CV ≤ 20%. Hal ini menunjukkan bahwa metode yang digunakan mempunyai presisi yang baik.
3. Spesifisitas metode uji antioksidan
Spesifisitas adalah kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara
tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen lain dalam matriks sempel
seperti ketidakmurnian, senyawa lain, produk degradasi dan komponen lain.
Pengukuran spesifisitas untuk tujuan identifikasi dan uji senyawa tertentu, spesifisitas
ditunjukan dengan kemampuan suatu metode analisis untuk membedakan antara
senyawa yang mempunyai struktur molekul yang hampir sama (Mulja dan Suharman,
1995). Pada pengukuran menggunakan spektrofotometri visibel pada pengukuran
rutin dan fraksi air, spesifikasi metode dapat dilihat dari ada tidaknya serapan dari
sampel sebelum ditambah DPPH pada panjang gelombang pengukuran yaitu 515,8
nm. Serapan dari sampel akan mempengaruhi hasil pengukuran karena absorbansi
Hasil scanning pada larutan pembanding rutin (Lampiran 6e ) dan larutan uji
fraksi air (Lampiran 6g ) pada panjang gelombang 515,8 nm tidak terdapat serapan,
sehingga ketika rutin direaksikan dengan radikal DPPH maka yang terbaca hanya
absorbansi DPPH hasil reaksi. Dapat disimpulkan metode uji aktivitas antioksidan
untuk rutin dan fraksi air memiliki spesisitas yang baik. Hasil dari validasi metode
analisis yang dilakukan menunjukkan bahwa metode penangkapan radikal bebas
DPPH oleh rutin dan fraksi air ekstrak metanolik daun sirih sebagai antioksidan
terbukti sudah baik dalam linearitas, akurasi, presisi dan spesifisitas sehingga hasil
yang diperoleh dapat dipercaya.
