BAB III METODOLOGI PENELITIAN
E. Tatacara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman sirih dilakukan di Laboratorium
Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma menurut van Steenis (1980).
2. Pengumpulan bahan
Daun sirih diperoleh dari kebun obat “MERAPI FARMA” daerah KM 21,5
bulan Mei. Pemanenan dilakukan pada tanaman yang sebelum berbunga saat pagi
hari.
3. Preparasi daun sirih
Sebanyak 1 kg daun sirih segar, dibersihkan ,dan dihaluskan dengan blender.
Ketika dihaluskan, daun tersebut ditambahkan sedikit cairan penyari (metanol).
Simplisia yang telah dihaluskan ditimbang sebanyak 30 gram dan dituang kedalam
bejana maserasi, ditambah metanol sampai terendam sempurna, dan dicampur
homogen. Campuran dimasersi pada suhu ruangan selama dua hari. Filtrat diperoleh
melalui penyaringan dengan corong Buchner. Ampas penyaringan diremaserasi
dengan metanol secukupnya selama 2 hari. Kemudian disaring. Lalu hasil
penyaringan filtrat diuapkan pelarutnya hingga diperoleh ekstak metanol daun sirih.
Ekstrak metanol daun sirih ditambahkan 300 mL air hangat dan di ekstraksi
cair-cair menggunakan wasbensin dengan perbandingan larutan ekstrak wasbensin
(1:1 v/v), kemudian didiamkan hingga terpisah sempurna. Fase air akan berada pada
paling bawah, sedangkan fase washbensin berada pada bagian atas.
Dari hasil partisi diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi wasbensin dan fraksi air.
Selanjutnya, fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat dengan
perbandingan larutan fraksi air-etil asetat (1:1 v/v) sehingga didapatkan fraksi air dan
dan waterbath hingga didapakan ekstrak kental. Lalu hasil fraksi tersebut digunakan
analisis lebih lanjut.
4. Pembuatan larutan pembanding dan uji
a. Pembuatan larutan DPPH
Sejumlah DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a sehingga diperoleh
larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan
alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.
b. Pembuatan larutan stok rutin
Sebanyak 2,5 mg rutin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL.
c. Pembuatan larutan pembanding
Diambil sebanyak 0,5; 1,0; 1,5; 2,5; 3,0 mL larutan stok rutin, kemudian
ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan
standar rutin sebesar 12,5; 25,0; 37,5; 50,0; dan 62,5 μg/mL.
d. Pembuatan larutan uji
i. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan
Sejumlah 25,0 fraksi air ditimbang dan di ad metanol p.a sampai 25,0
mL. Diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 mL larutan tersebut, kemudian
ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi
ii. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total
Sebanyak 7,5 mg fraksi airt ditimbang, lalu ditambahkan metanol p.a
sampai diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 750,0 µg/mL.
e. Pembuatan larutan asam galat
Dibuat larutan asam galat dengan konsetrasi 500 µg/mL dalam akuades :
methanol p.a (1:1). Diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL larutan
tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a (1:1) sampai 10,0 mL,
sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125;
dan 150 µg/mL.
5. Uji pendahuluan
a. Uji fenolik
Sejumlah 0,5 mL larutan uji 750,0 µg/mL dan larutan pembanding asam
galat 150,0 µg/mL ditambahkan 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah
diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) kedalam tabung reaksi. Diamkan selama 10
menit. Tambahkan 7,5 mL larutan natrium karbonat 1 M. Kemudian amati warna
larutan tersebut.
b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukan ke dalam masing-masing tiga
tabung reaksi. Ditambahkan masing-masing dengan 1 mL metanol p.a, larutan
tersebut ditambahkan dengan 3 mL metanol p.a. Larutan tersebut kemudian
divortex selamam 30 detik. Setelah 30 menit, amati warna pada larutan tersebut.
6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
a. Penentuan operating time (OT)
Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing-masing tiga
labu ukur 5 mL, ditambahkan masing-masing dengan 1 mL larutan pembanding
rutin 12,5; 37,5 dan 62,5 μg/mL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan
dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex
selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya denga spektrofotometer
visibel pada panjang gelombang 517 nm selama 1 jam. Dilakukan demikian
juga untuk larutan uji 100; 200; 300 μg/mL.
b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Pada 3 labu ukur 10 mL, dimasukan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL
larutan DPPH. Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda
batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080. Larutan
tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Diamkan selama OT. Lalu
dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.
7. Uji aktivitas antioksidan
Uji aktivitas antioksidan ditentukan dengan menggunakan metode
a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol)
Pada labu ukur 10 mL, dimasukan sebanyak 2 mL larutan DPPH.
Ditambahan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian
larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang
maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak 5 kali. Larutan ini digunakan sebagai
kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji
Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi
bertutup kemudian ditambah dengan 1 mL larutan pembanding dan uji pada
berbagai seri konsentrasi telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut ditambah
dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex
selama 30 detik dan diamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi.
Pengujian dilakukan dengan 5 kali replikasi.
c. Validasi metode uji aktivitas antioksidan
Hasil dari prosedur 7 a dan b, divalidasi akurasi (% recovery), presisi (%CV)
spesipisitas (spektra kontrol), dan linearitas (nilai r).
% Recovery = 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑟𝑢𝑡𝑖𝑛 𝑎𝑡𝑎𝑢 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖 𝑎𝑖𝑟𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟
𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑟𝑢𝑡𝑖𝑛 𝑎𝑡𝑎𝑢 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖 𝑎𝑖𝑟𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 x 100%
% CV = 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝐷𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 𝑆𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟
d. Estimasi aktivitas antioksidan
Hasil dari prosedur 7 a dan b, dihitung nilai % IC dan IC50 untuk rutin dan
fraksi air ekstrak metanol daun sirih.
8. Optimasi metode penetapan kandungan fenolat total
Optimasi metode penetapan kandungan fenolat total ditentukan dengan
menggunakan metode spektrofotometri sesuai dengan penelitian Nusarini ( 2007).
a. Penentuan OT
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μg/mL ditambahkan
dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v).
Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu,
dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750
nm selama 30 menit.
b. Penentuan panjang gelombang maksimum
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μg/mL ditambahkan
dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:1 v/v).
Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan
selama OT,absorbansinya dibaca pada λ maksimum dengan spektrofotometer visibel
9. Penetapan kandungan fenolat total
a. Pembuatan kurva baku asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 μg/mL
ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:1
v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1M. Setelah OT,
absorbansinya dibaca pada λ maksimum terhadap blanko yang terdiri atas akuades :
metanol p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1M.
Pengerjaan dilakukan 5 kali.
b. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total
Hasil dari prosedur 9 a , divalidasi akurasi (%recovery), presisi (%CV),
spesipisitas (spektra kontrol), dan linearitas (nilai r).
% Recovery = 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑟𝑢𝑡𝑖𝑛 𝑎𝑡𝑎𝑢 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖 𝑎𝑖𝑟𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟
𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑟𝑢𝑡𝑖𝑛 𝑎𝑡𝑎𝑢 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖 𝑎𝑖𝑟 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 x 100%
% CV = 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝐷𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 𝑆𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟
𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 x 100%
c. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Diambil 0,5 mL larutan uji 750 μg/mL, lalu masing-masing dimasukan ke dalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan
kurva baku asam galat . Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai gram ekivalen
