Bahan Genetik:
Sebanyak 39 galur jagung pulut koleksi Balitsereal (Tabel 4).
Tabel 4 Materi genetik galur murni jagung pulut (waxy corn) yang digunakan
No. Pedigree Populasi Asal Warna/Tipe biji
1. PTBC4-7-5-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
2. PTBC4-7-11-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
3. PTBC4-17-1-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
4. PTBC4-9-3-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
5. PTBC4-9-5-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
6. PTBC4-10-1-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
7. PTBC4-10-7-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
8. PTBC4-11-6-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
9. PTBC4-11-8-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
10. PTBC4-12-3-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
11. PTBC4-12-12-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
12. PTBC4-13-6-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
13. PTBC4-14-7-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
14. PTBC4-14-12-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
15. PTBC4-15-1-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
16. PTBC4-15-4-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
17. PTBC4-16-2-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
18. PTBC4-16-8-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
19. PTBC4-18-43-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
20. PTBC4-20-1-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
21. PTBC4-21-2-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
22. PTBC4-21-4-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
23. PTBC4-22-2-BB Tuxpeno/Pulut Takalar Putih/Semiflint
24. MSP2(10)-82-1-BB Populasi Pulut Sul-Sel Putih/flint
25. MSP2(10)-90-1-BB Populasi Pulut Sul-Sel Putih/flint
26. MSP2(10)-95-1-BB Populasi Pulut Sul-Sel Putih/flint
27. MSP2(10)-96-1-BB Populasi Pulut Sul-Sel Putih/flint
28. MSP2(10)-103-1-BB Populasi Pulut Sul-Sel Putih/flint
29. MSP2(10)-113-1-BB Populasi Pulut Sul-Sel Putih/flint
30. MSP2(10)-120-1-BB Populasi Pulut Sul-Sel Putih/flint
31. MSP2(10)-122-1-BB Populasi Pulut Sul-Sel Putih/flint
32. MSP2(10)-125-2-BB Populasi Pulut Sul-Sel Putih/flint
33. MSP2(10)-145-1-BB Populasi Pulut Sul-Sel Putih/flint
34. MSP2(10)-149-1-BB Populasi Pulut Sul-Sel Putih/flint
35. MSP2(10)-163-1-BB Populasi Pulut Sul-Sel Putih/flint
36. MSP2(10)-169-1-BB Populasi Pulut Sul-Sel Putih/flint
37. MSP2(10)-182-1-BB Populasi Pulut Sul-Sel Putih/flint
38. MSP2(10)-187-1-BB Populasi Pulut Sul-Sel Putih/flint
Primer mikrosatelit yang digunakan sebanyak 20 primer (forward dan reverse), diperoleh dari Research Genetik, Inc, dan dari Invitrogen. Primer-primer tersebut diseleksi berdasarkan tingkat polimorfisme pada jagung (referensi dari CIMMYT) (Tabel 5).
Tabel 5 Sekuen dari 20 marka mikrosatelit yang digunakan dalam penelitian
No. Primer No
Kromosom Motif Sekuen 5’ – 3’ Primer F Primer R
1. phi109275 1.03 AGCT CGGTTCATGCTAGCTCTGC // GTTGTGGCTGTGGTGGTG 2. phi96100 2.01 ACCT AGGAGGACCCCAACTCCTG //
TTGCACGAGCCATCGTAT 3. phi374118 3.02 ACC TACCCGGACATGGTTGAGC //
TGAAGGGTGTCCTTCCGAT
4. phi079 4.05 AGATG TGGTGCTCGTTGCCAAATCTACGA // GCAGTGGTGGTTTCGAACAGACAA 5. phi109188 5.03 AAAG AAGCTCAGAAGCCGGAGC //
GGTCATCAAGCTCTCTGATCG 6. phi299852 6.07 AGC GATGTGGGTGCTACGAGCC //
AGATCTCGGAGCTCGGCTA 7. phi328175 7.04 AGG GGGAAGTGCTCCTTGCAG // CGGTAGGTGAACGCGGTA 8. phi233376 8.09 CCG CCGGCAGTCGATTACTCC //
CGAGACCAAGAGAACCCTCA
9. phi065 9.03 CACTT AGGGACAAATACGTGGAGACACAG //
CGATCTGCACAAAGTGGAGTAGTC 10. umc1196 10.07 CACACG CGTGCTACTACTGCTACAAAGCGA //
AGTCGTTCGTGTCTTCCGAAACT 11. phi109642 2.03-2.04 ACGG CTCTCTTTCCTTCCGACTTTCC //
GAGCGAGCGAGAGAGATCG 12. phi101049 2.10 AGAT CCGGGAACTTGTTCATCG //
CCACGTCCATGATCACACC 13. phi102228 3.06 AAGC ATTCCGACGCAATCAACA //
TTCATCTCCTCCAGGAGCCTT
14. phi093 4.08 AGCT AGTGCGTCAGCTTCATCGCCTACAAG //
AGGCCATGCATGCTTGCAACAATGGATACA 15. umc1153 5.09 (TCA)4 CAGCATCTATAGCTTGCTTGCATT //
TGGGTTTTGTTTGTTTGTTTGTTG 16. phi423796 6.01 AGATG CACTACTCGATCTGAACCACCA //
CGCTCTGTGAATTTGCTAGCTC
17. phi114 7.03 GCCT CCGAGACCGTCAAGACCATCAA //
AGCTCCAAACGATTCTGAACTCGC 18. phi420701 8.00 CCG GATGTTTCAAAACCACCCAGA //
ATGGCACGAATAGCAACAGG 19. phi448880 9.06-9.07 AAG CGATCCGGAGGAGTTCCTTA //
CCATGAACATGCCAATGC
20. phi96342 10.02 ATCC GTAATCCCACGTCCTATCAGCC // TCCAACTTGAACGAACTCCTC * Sumber: Applied Biotechnology Center at CIMMYT, Mexico
Pelaksanaan Percobaan di Laboratorium
Biji ditanam sebanyak 10 individu untuk masing-masing galur pada baki menggunakan media tanah. Materi tanaman yang digunakan untuk ekstraksi DNA adalah tanaman yang berumur 10 sampai 15 hari setelah tanam. Bagian tanaman yang diambil adalah daun muda yang telah membuka sempurna sebanyak 5 - 10 individu tanaman dipotong-potong kecil, dicampur kemudian ditimbang 0.4 g per sampel, dimasukkan ke dalam mortal dan ditambahkan larutan buffer CTAB 1,7 ml sebagai pengganti nitrogen cair mengikuti prosedur Khanet al. (2004).
Isolasi DNA
Sampel digerus sampai halus, masukkan ke dalam tabung mikro, tambahkan 2-mercaptoethanol 10µl, masukkan ke dalam water bath (CTAB panas) dengan suhu berkisar 60º-65º C selama 60 menit dan setiap 15 menit membolak-balik tabung atau cukup menjentikkannya dengan jari agar larutan tecampur dengan baik agar proses perusakan sel berjalan sempurna. Protein diekstraksi menggunakan chloroform-isoamil alkohol dan kompleks CTAB-DNA diendapkan menggunakan isopropanol 700 µl. Protein diekstraksi dengan menggunakan chloroform-isoamil alkohol dan kompleks CTAB-DNA diendapkan dengan menggunakan isopropanol atau etanol absolut. Pelet DNA dihasilkan melalui sentrifuge, kemudian dicuci, dikeringkan dan dilarutkan kembali. Pemurnian dilakukan untuk memisahkan DNA dari RNA, polisakarida, polifenol, dan kotoran-kotoran lain yang ikut di dalamnya. Prosedur pemurnian dengan perlakuan RNAse dan pengendapan ammonium asetat sehingga akan mengeluarkan RNA dan beberapa polisakarida. Kuantitas dan kualitas DNA hasil ekstraksi diukur berdasarkan standar λ-DNA melalui proses elektroforesis horizontal, dengan menggunakan gel agarose 0,9%.
Amplifikasi dan Visualisasi Pola Pita DNA
Komposisi reaksi PCR, konsentrasi akhir, dan volume (Lampiran 1). Reaksi PCR (coctail) dibuat pada mikroplate mikrotiter 96-sumur dengan menggunakan mesin PCR dari Biorad. Reaksi PCR diambil 8,5 μl dengan pipet mikro (multichannel) dan dimasukkan ke dalam sumur yang telah berisi DNA dari genotipe-genotipe yang diuji masing-masing 1,5 μl. Larutan tersebut masing-masing ditutup dengan satu tetes
mineral oil, kemudian mikroplate ditutup dengan plester aluminium. Proses amplifikasi terdiri atas beberapa tahap (Lampiran 2) yaitu tahap denaturasi 1 menit pada 94oC yang diikuti oleh touch downprofil. Profil ini dimulai dengan 2 siklus selama 1 menit pada 94oC, 1 menit pada 65oC, dan 2 menit pada 72oC. Temperatur annealing kemudian diturunkan dari 1oC setiap dua siklus hingga berakhir pada saat temperatur annealing tercapai. Siklus terakhir diulang 29 kali dan berakhir dengan siklus pemanjangan pada 4oC. Setelah amplifikasi selesai maka dikeluarkan dari mesin PCR. Reaksi dihentikan dengan memasukkan 4lloading dyeataustop solution (70% glicerol, 20 mM EDTA, 0,2% SDS, 0,6 mg/ml bromphenol blue) pada masing-masing sumur. Proses amplifikasi, pemisahan DNA pada PAGE 4,5% (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) menggunakan sistem sequigen 38 x 40 cm dan protokol Bio-Rad Laboratories Inc. Hercules, CA, USA. Pita-pita DNA dideteksi melalui proses silver staining
menggunakan protokol sistem sekuensing DNAPromega Silver Sequence.
Pengamatan Data Molekuler
Analisis data molekuler dilakukan berdasarkan hasil skoring pita DNA yang muncul pada plate. Pita DNA diberi skor berdasarkan penampilan pita DNA ditransformasi ke dalam kode data biner dengan cara: jika ada pita diberi skor satu (1) dan jika tidak ada pita diberi skoring nol (0). Pita yang tidak sempurna dan tidak jelas diberi skor 9 (missing data). Jika ada galur yang menghasilkan banyak pita maka pita yang paling jelas diberi skor ‘1’ sedangkan yang lainnya diberi skor ‘9’. Data pada kolom menunjukkan inbrida sedangkan baris menunjukkan lokus SSRs.
Analisis Data Genotipik
Analisis data molekuler dilakukan berdasarkan hasil skoring pita DNA yang muncul pada plate,hasil skoring dalam bentuk data biner. Tingkat polimorfisme (PIC = Polimorphism Information Content) dari primer yang digunakan dihitung untuk masing-masing marka SSRs (Smithet al. 1997), dengan formula: PIC
n fi1 2
1 i =
1, 2, 3,………n , dimana fi2 adalah frekuensi alel ke-i. Koefisien korelasi kofenitik (r)
Analisis Tingkat Heterosigositas
Salah satu kelebihan dari metode SSRs adalah deteksinya kodominan sehingga lokus yang heterozigot akan dapat dibedakan dari lokus homozigot. Lokus yang homozigot akan mucul hanya satu pita/alel per primer per genotipe. Jika lebih dari satu alel berarti lokus tersebut heterozigot. Analisis ini penting untuk menghindari terseleksinya genotipe-genotipe dengan tingkat heterosigositas yang tinggi dimana pada pengamatan secara fenotipik tidak terdeteksi karena pengaruh faktor lingkungan. Tingkat heterosigositas untuk setiap genotipe dapat diketahui dengan formula:
100% x digunakan yang SSRs lokus Total t heterozigo lokus Jumlah sitas heterozigo Persentase
Untuk memperoleh hasil analisis data yang lebih akurat, maka dalam penelitian ini hanya genotipe yang mempunyai tingkat heterozigositas <20% yang dianalisis lebih lanjut.
Estimasi Kekerabatan Genetik dan Analisis Klaster
Tingkat kemiripan genetik (GS=genetik similarity) diestimasi dengan menggunakan koefisien Jaccard (Rohlf 2000) dengan formula:
n u
m S
, dimana m = jumlah pita (alel) DNA yang sama posisinya, n = total pita (alel) DNA, dan u = jumlah pita (alel) DNA yang tidak sama posisinya. Kemiripan genetik dianalisis dengan menggunakan software NTSYS-pc versi 2.1 (Rohlf 2000). Analisis matriks jarak genetik diperoleh dari hasil analisis kemiripan genetik (Lee 1998), dengan formula: S = 1 – GS, dimana S = jarak genetik, GS = Kemiripan genetik (genetik similarity). Analisis Boot-Strapping dilakukan untuk mengetahui tingkat kepercayaan pengelompokan dengan menggunakan program WinBoot. Koefisien korelasi kofenetik (r) juga dihitung yang dilanjutkan dengan uji Mantel (Mantel 1967) untuk melihat
goodness of fitdari hasil analisis klaster. Principal Coordinate Analysis(PCA) (Dillon and Goldstein 1984), dilakukan untuk mengetahui posisi relatif dari galur yang dianalisis pada ruang dua dimensi.
Analisis Komponen Utama (Principal Component Analysis= PCA)
Analisis komponen utama digunakan untuk menggambarkan posisi relatif dari genotipe yang diidentifikasi melalui program NTSYS. Namun jika ada missing data maka yang digunakan adalah analisis koordinat utama (Principal Coordinate Analysis = PCOORDA) (Prasanna 2002), yang merupakan bagian dari analisis komponen utama. Selain itu analisis komponen utama digunakan untuk mengetahui primer-primer yang berperanan dalam pembentukan dendrogram. Komponen utama dari peubah data asal diperoleh dari matriks varians-kovarians peubah asalnya. Skor komponen utama untuk setiap pengamatan dihitung melalui persamaan:
x x
Y a
x x
a
Yh1 1 h ,... hk k h dimana Yh1 = skor komponen ke-1 dari obyek pengamatan ke-h, a1= vektor pembobot komponen utama ke-1 dan Xh= vector data pengamatan dari obyek ke-h dan X = vektor nilai rata-rata dari variabel asal (Dillon dan Goldstein, 1984).
Percobaan 2: Korelasi Antara Tingkat Kemiripan Berdasarkan Penampilan