BAB V HASIL PENELITIAN
5.5 Identifikasi Metabolit Gendarusin A dalam Urin
Hasil identifikasi metabolit gendarusin A dalam urin menunjukkan hanya subyek dengan inisial C BAY dari 4 subyek yang digunakan teridentifikasi gendarusin A dalam urin dengan konsentrasi yang sangat kecil mendekati LOD dari alat.
Gambar 5.11. Kromatogram LC-MS/MS identifikasi gendarusin A dalam urin subyek [A] AST dan [B] BAG
A
Gambar 5.12. Kromatogram LC-MS/MS identifikasi gendarusin A dalam urin subyek [C] BAY dan [D] DYC.
D C Gendarusin A
BAB VI
PEMBAHASAN
Gendarusin A merupakan komponen mayor dari tanaman Justicia gendarussa Burm. f yang mempunyai efek sebagai antifertilitas dengan aktivitas pencegahan penetrasi spermatozoa dengan mekanisme menghambat enzim hialuronidase pada spermatozoa manusia. Uji identifikasi metabolit menjadi penting berkenaan dengan proses farmakokinetika dari senyawa aktif yang digunakan sebagai marker dari ekstrak daun Justicia gendarussa Burm F yang mempunyai 12 komponen flavonoid glikosida. Struktur dari senyawa gendarusin A tersebut terdiri dari aglikon yang merupakan flavonoid golongan flavon yaitu apigenin yang berikatan dengan gula jenis arabinopiranosil pada atom C nomor 6 dan 8. Dari pengamatan terhadap jenis-jenis flavonoid C-glikosida yang ditemukan Markham mengatakan bahwa flavonoid C-glikosida selalu mempunyai glikosida pada rantai 6 atau 8 atau keduanya. Flavonoid C-glikosida ini juga memiliki sifat yang polar dan tidak mudah terhidrolisis, sehingga sulit terpisah antara aglikon dengan komponen gulanya.
Penelitian tentang deteksi ini digunakan untuk memastikan apakah senyawa marker gendarusin A terekskresi dalam bentuk utuh dalam urin dengan instrumen yang lebih canggih yaitu LC-MS/MS QTRAP. Penelitian ini sangat bermanfaat untuk menafsirkan kemungkinan sifat obat di dalam tubuh yang melewati berbagai membran biologi dan berbagai kompartemen serta menafsirkan struktur kimia hasil biotransformasi metabolisme fase 1 dan fase 2.
Optimasi memakai HPLC merupakan preliminary untuk menentukan kondisi optimal kromatografi dari metode yang digunakan. Kondisi HPLC yang digunakan adalah kolom Novapak Waters C-18 3,9 X 150 mm 60 Å, 4 µm, suhu kolom 30o C, kecepatan alir 1 ml/menit, dan detektor DAD UV/Vis. Hasil optimasi yang diperoleh terdapat pada bab hasil penelitian. Selanjutnya bentuk dari free aglikon atau flavonoid tanpa gula dari gendarusin A adalah apigenin. Sehingga perlu dilakukan elusi terhadap standar tersebut untuk memastikan bahwa analit yang diamati adalah milik gendarusin A. Standar apigenin 100 ppm dalam 45% asetonitril/air diinjekkan ke dalam kolom HPLC dielusi pada panjang gelombang maksimal yaitu 340 nm sama seperti gendarusin A. Standar tersebut dielusi dengan fase gerak terpilih gendarusin A dan fase gerak 30 % asetonitril dalam air. Fase gerak terpilih dari standar apigenin adalah 30 % asetonitril/air karena fase gerak gradien terpilih dari gendarusin A belum bisa mengelusi standar apigenin karena sifatnya yang sedikti kurang polar. Sehingga dapat dipastikan bahwa dengan fase gerak gradien terpilih dari gendarusin A tidak memunculkan peak dari aglikonnya yaitu apigenin. Setelah data-data dari HPLC dipenuhi lalu sampel dibawa ke alat LC-MS/MS triple quadrupole QTRAP 4000 series. Data-data yang diperoleh dari HPLC digunakan sebagai dasar analisis dengan LC-MS/MS.
Sebelum dilakukan kromatografi dengan LC-MS/MS sebelumnya dilakukan tuning dengan standar yang ada yaitu apigenin dan gendarusin A. Kondisi LC-MS/MS yang digunakan adalah sebagai berikut kolom eclipse plus C-18 4,6 x 50 mm 3,5 um, kecepatan alir 1 ml/menit temperatur kolom 50 oC, polaritas negatif dan tipe skanning MRM. Hasil optimasi dari LC-MS/MS dapat dilihat di bab hasil penelitian. Tipe skaning yang digunakan
adalah MRM (Multiple Reaction Monitoring) yaitu fragmentasi dari standar yang menghasilkan kelimpahan ion yang besar. Untuk gendarusin A dipilih MRM dengan m/z 533/353 dan m/z 533/383, sehingga hanya analit yang mempunyai kedua MRM tersebutlah yang dapat diamati di kromatografi LC-MS/MS. Kromatorafi untuk standar gendarusin A menggunakan 2 MRM tersebut (poin identifikasi bernilai 4). Hal tersebut telah diatur dalam
Council Directive 96/23/EC European Community bahwa untuk
LC-MS/MS digunakan 1 ion prekusor dan 2 ion anak menghasilkan poin identifikasi 4.
Analisis dengan LC-MS/MS ini menggunakan ESI (Electrospray Ionization) sebagai sumber ion dengan mode negative dan menggunakan ion trap di quaduprole ketiganya untuk menyeleksi produk ion (daughter ion). Karena analit yang dianalisis bersifat polar maka fase gerak yang digunakan sistem gradien antara A (10 mM ammonium asetat dan 0,1 % asam format dalam air) dan B (10 mM ammonium asetat dan 0,1 % asam format dalam metanol). Fase gerak tersebut digunakan aditif ammonium asetat dan asam format. Pemisahan analit polar dan metabolit yang polar dalam suatu kromatografi memang biasanya menggunakan fase gerak gradien dan sering ditambahkan aditif ionic modifier untuk meningkatkan konjugat yang polar (Samuel et al, 2003). Namun penambahan aditif haruslah seminimal mungkin untuk menjaga waktu retensi yang selektif dan menghindari efek ion supressi karena MRM membutuhkan fragmentasi ion untuk identifikasi analitnya. Biasanya ditambahkan asam organik seperti asam format atau asam asetat dalam konsentrasi kurang dari 0,1 % kadang juga lebih tinggi sesuai kebutuhan (Groff et al, 2006). Amonium asetat atau
format merupakan garam volatile yang sering digunakan di HPLC-MS dengan rentang konsentrasi 2 sampai 10 mmol/L (Ferrer et al, 2005).
Dari hasil optimasi awal ternyata kromatogram gendarusin A memiliki dua peak kecil dan besar. Peak yang kecil ada di depan peak yang besar. Kemungkinan hal tersebut terjadi karena masih adanya isomer dari gendarusin A yang tercampur dengan standar karena isolasi yang kurang sempurna. Karena standar gendarusin A tersebut di dapatkan dari isolasi dari ekstrak daun Justicia gendarussa Burm. f. Deteksi dengan menggunakan MS tidak bisa membedakan antara isomer karena fragmentasi yang terjadi di tuning awal menghasilkan kelimpahan ion yang sama. Sehingga untuk memisahkan analit yang mempunyai isomer seperti 12 flavonoid dari ekstrak daun Justicia gendarussa Burm F ini yang kemungkinan berisomer bisa digunakan kolom kiral. Kromatografi yang dilakukan adalah kromatografi kiral dengan kolom packing seperti α-acid glycoprotein, cellulose tris, vancomycin (Liu et al 2007) dsb. Kolom yang digunakan di LC-MS/MS juga lebih pendek dari kolom di HPLC yaitu
novapak waters 3,9 x 150 mm sedangkan di LC-MS/MS digunakan kolom
eclipse plus C-18 4,6 x 50 mm karena tren di analisis farmasetik adalah dengan mengurangi waktu analisis dan meningkatkan hasil sampel tanpa meninggalkan selektivitas analisis. Hal tersebut bisa dicapai dengan memendekkan panjang kolom dan mengurangi diameter partikel (Holcapek et al, 2008). Dari keputusan Council Directive 96/23/EC European
Community juga menyebutkan untuk melakukan metode kualitatif
persyaratan LOD, LOQ dan selektifitas juga harus dipenuhi. Untuk selektifitas LC-MS/MS sudah memiliki selektifitas yang tinggi karena menggunakan MRM. Untuk LOD/LOQ dapat dilihat di bab hasil penelitian.
Ketika kondisi yang ada pada LC-MS/MS sudah siap maka dapat dilakukan treatmen kepada 4 orang subyek. Dari hasil pengumpulan urin terhadap 4 orang subyek dilakukan preparasi dari poin-poin waktu pengeluaran urin subyek yang dipergunakan untuk membuat profil eliminasi dari analit dan akumulasi urin 24 jam untuk identifikasi metabolit yang berada di urin. Masing-masing poin waktu pengumpulan urin diambil 2 ml urin untuk dipreparasi sedangkan dari akumulasi urin 24 jam diambil 5 ml urin untuk dipreparasi. Preparasi yang dilakukan sama dengan preparasi yang dioptimasi menggunakan HPLC.
Dari masing-masing poin waktu pengumpulan urin yang di analisis, tidak ditemukan sama sekali analit berupa apigenin maupun gendarusin A. Analisis terhadap urin 24 jam hanya ditemukan satu sampel dari subyek C (BAY) yang ditemukan analit berupa gendarusin A dengan kadar yang sangat kecil sekali dengan tinggi maksimal 100 cps. Kromatogram LC-MS/MS dari subyek D (DYC) juga menampilkan waktu retensi yang sama dengan gendarusin A hanya pada 1 MRM saja. Dari kromatogram tersebut tidak dapat disimpulkan bahwa senyawa yang terdeteksi pada waktu retensi tersebut merupakan gendarusin A karena tidak memenuhi kriteria yaitu 2 MRM untuk poin deteksi. Senyawa marker gendarusin A golongan C-glycosyl flavonoid merupakan senyawa baru yang belum secara jelas diketahui model farmakokinetikanya di dalam tubuh. Beberapa jurnal menyebutkan bahwa flavonoid golongan ini yaitu C-glycosyl flavonoid absorbsinya tidak berdasarkan proses deglikosilasi dari gugus gulanya namun melalui transport aktif dengan bantuan transporter membran. Hal ini sesuai dengan penelitian tentang aspalathin yang terabsorbsi, lalu termetabolisme secara mayor dalam bentuk termetilasi dan
terglukoronidasi tanpa kehilangan gugus gulanya di dalam urin manusia yang menggunakan 6 subyek (Courts et al, 2009). Hal tersebut menjadi dasar bahwa flavonoid C-glikosida seperti gendarusin A mengalami metabolisme dalam tubuh dengan bentuk terkonjugasi dan didapatkan dalam bentuk utuh (tidak berupa aglikon) di dalam urin. Sehingga hanya sebagian kecil saja yang berada dalam bentuk utuh. Hal ini sesuai dengan penelitian tentang aspalathin yang terabsorpsi sebagai C-glycoside di usus babi (Kreuz et al, 2008). Dan didukung penelitian lain yang menggunakan flavon C-glikosida yang sama sejenis dengan gendarusin A dari HLF (hawthorn leaf flavonoid) sebagai obat kardiovaskular dengan marker yang diamati yaitu vitexin-4”-O-glucoside (VOG) dan vitexin-4”-O-rhamnoside (VOR) yang dikuantifikasi menggunakan HPLC-UV. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi plasma maksimal dari VOG dan VOR dicapai dalam waktu hanya 0,75 jam. Hal ini menunjukkan bahwa flavonoid C-glikosida langsung menembus membran intestinal tanpa deglikosilasi terlebih dahulu. Rekoveri rata-rata dari VOR dengan dosis 342,36 mg/kg pada 6 grup mencit (n = 4 per grup) selama 24 jam treatmen adalah 64,91 % (0,70 % di urin; 64,21 % feses) (Liu et al, 2010). Berdasarkan penelitian ini bahwa kemungkinan juga C-glycosyl flavonoid juga terekskresi dalam urin namun dengan konsentrasi yang sangat kecil seperti bentuk utuh gendarusin A yang terekskresi dalam urin subyek BAY menunjukkan sedikit gendarusin A yang masih utuh terdeteksi dalam urin. Karena jumlah ekskresi urin subyek (C) BAY paling kecil yaitu 2.148 ml sehingga lebih besar kemungkinan kadar gendarusin A dalam urin. Sedangkan 3 subyek lain yaitu AST 4.117 ml, BAG 2895 ml, dan DYC 2.259 ml.
Mekanisme absorpsi dari flavonoid C-glikosida sudah terdefinisi, namun belum ada informasi yang secara jelas menyebutkan jenis transporter yang berpartisipasi di dalam mekanisme transport ini. Hal ini menjadi dasar bahwa flavonoid C-glikosida tidak terglikosilasi di dalam tubuh dan kemungkinan bisa di dapatkan dalam bentuk utuh di dalam urin tanpa terkonjugasi dengan senyawa xenobiotik tubuh namun dalam kadar yang sangat kecil.
Mekanisme biotransformasi flavonoid C-glikosida berbeda dengan flavonoid O-glikosida. Deglikosilasi merupakan cara flavonoid O-glikosida dapat terabsorbsi menembus sel intestinal dengan berinteraksi dengan protein lactase phlorizin hydrolase (LPH) yang terdapat di dinding lumen usus serta cytosolic B-glucosidase (CBG) yang terdapat di enterosit sitosol. Telah diketahui juga bahwa aglikon flavonoid seperti apigenin dapat secara pasif berdifusi melewati epitel intestinal karena peningkatan lipofilisitas karena kehilangan gugus gula yang polar. Namun tipe absorbsi tersebut juga terdapat dalam mekanisme transport aktif yang melibatkan transporter. Hal tersebut menjadi bagian mekanisme absorbsi dari flavonoid-glikosida untuk melewati dinding apikal dari lumen usus. SGLT1 merupakan transporter yang dari lumen ke enterosit sitosol yang diikuti oleh deglikosilasi dari CBG dan multi-drug resistance protein 2 (MRP2) yang memefasilitasi efflux dari enterosit sitosol ke lumen intestinal ((Bageta et al, 2012).
Sehingga saran untuk penelitian ini adalah perlu mencoba melakukan penelitian tentang identifikasi metabolit mayor dari gendarusin A dengan subyek hewan. Dosis yang dipakai juga lebih tinggi agar dapat terdeteksi di dalam instrumen yang digunakan. Penggunaan kolom kiral
juga diperlukan untuk memisahkan isomer yang kemungkinan terdapat di dalam ekstrak maupun di dalam metabolit mengingat ada 12 komponen flavonoid dengan berat molekul yang mirip yang terdapat dalam ekstrak etanol daun Justicia gendarussa Burm F ini.
BAB VII
