TINJAUAN PUSTAKA
2.8 Tinjauan Tentang LC-MS/MS
Kromatografi adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran berdasarkan pada perbedaan migrasi masing-masing analit senyawa pada fase diam dibawah pengaruh fase gerak. Dasar pemisahan kromatografi adalah terjadinya perubahan dari sistem kesetimbangan distribusi statik molekul senyawa ke sistem kesetimbangan distribusi dinamik diantara fase diam dan fase gerak yang berkesinambungan. Karena molekul analit pada kondisi variabel kromatografi tertentu mempunyai tetapan kesetimbangan distribusi dinamik yang khas, maka akan terjadi pola pemisahan yang tetap (Yuwono, 2009)
Pengetahuan dasar tentang LC-MS/MS diperoleh dari panduan primer tentang LC-MS yang di keluarkan oleh perusahaan Agilent, yaitu sebagai berikut:
Kromatografi cair merupakan dasar teknik pemisahan di bidang sains dan terkait dengan kimia. Kromatografi cair dapat dengan aman memisahkan senyawa organik dengan rentang yang sangat luas yaitu mulai dari metabolit obat dengan molekul kecil sampai peptida dan protein.
Detektor umum dari kromatografi cair termasuk indeks refraksi, elektrokimia, fluoresensi, dan ultraviolet-visible (UV-Vis). Beberapa dari detector tersebut memberikan data dua dimensi yaitu data yang menunjukkan kekuatan signal sebagai fungsi atas waktu. Detektorfluorosensi dan diode-array UV-Vis menghasilkan data tiga dimensi yaitu tidak hanya kekuatan signal namun data spectra dari masing-masing poin waktu. Mass spectrometers juga menghasilkan data tiga dimensi. Selain kekuatan signal juga menghasilkan data massa spektral yang dapat memberikan informasi berharga tentang struktur, berat molekul, identifikasi, jumlah, dan kemurnian sampel. Data spektral massa menambahkan spesifitas yang meningkatkan kepercayaan dalam hasil dari analisis baik kualitatif dan kuantitatif. Untuk sebagian besar senyawa yang di analisis dengan spektrometer massa jauh lebih sensitif dan lebih spesifik daripada semua LC detektor lainnya. Hal ini dapat menganalisis senyawa yang tidak memiliki kromofor yang cocok. Hal ini juga dapat mengidentifikasi komponen dalam kromatografi dengan peak yang belum terselesaikan, mengurangi kebutuhan untuk kromatografi yang sempurna.
Data spektral massa melengkapi data dari detektor LC lainnya. Sementara ketika dua senyawa mungkin memiliki spektrum UV yang sama atau spektrum massa yang sama, hal ini jarang terjadi bagi mereka untuk memiliki keduanya. Dua set data ortogonal dapat digunakan untuk
mengidentifikasi, mengkonfirmasi, dan mengukur senyawa. Beberapa spektrometer massa (mass spectrometers) memiliki kemampuan untuk melakukan beberapa langkah spektrometri massa pada sampel tunggal. Hal tersebut bisa menghasilkan spektrum massa,memilih secara selektif ion tertentu dari spektrum, fragmen ion, dan menghasilkan spektrum massa lainnya serta mengulang seluruh siklus beberapa kali. Spektrometer massa seperti secara harfiah dapat mendekonstruksi molekul kompleks sepotong demi sepotong sampai struktur dapat ditentukan.
2.8.1 Instrumentasi
Spektrometer massa bekerja dengan molekul peng-ion dan kemudian menyortir dan mengidentifikasi ion sesuai dengan massa-muatan (m/z) rasio. Dua komponen kunci dalam proses ini adalah sumber ion yang menghasilkan ion, dan analiser massa, yang menghasilkan berbagai macam ion. Beberapa berbagai jenis sumber ion umumnya digunakan untuk LC/MS. Masing-masing cocok untuk berbagai kelas senyawa. Beberapa yang berbeda jenis dari analiser massa juga digunakan. Masing-masing memiliki keuntungan dan kerugian tergantung pada jenis informasi yang dibutuhkan.
2.8.2 Sumber Ion.
Pengenalan teknik atmospheric pressure ionization (API) dengan jumlah senyawa yang sangat besar dapat berhasil dianalisis oleh LC / MS. Dalam atmospheric pressure ionization molekul analit yang terionisasi terlebih dahulu pada tekanan atmosfer. Ion analit kemudian secara mekanis dan elektrostatis dipisahkan dari molekul netral. Teknik atmospheric pressure ionization (API) secara umum adalah:
Electrospray ionization (ESI)
Atmospheric pressure chemical ionization (APCI)
Atmospheric pressure photoionization (APPI)
Gambar 2.11 Penerapan berberapa teknik ionisasi LC/MS
2.8.3 Mass Analyzers (Analiser massa).
Meskipun dalam teori apapun jenis analiser massa dapat digunakan untuk LC / MS ada empat jenis:
Quadrupole
Time-of-flight
Ion trap
Fourier transform-ion cyclotron resonance (FT-ICR or FT-MS) paling sering digunakan.
digunakan. Masing-masing memiliki kelebihan dan kerugian tergantung pada persyaratan dari analisis tertentu.
2.8.4 Collision-Induced Dissociationand Multiple-Stage MS
(Disosiasi induksi tabrakan dan tahap-tahap MS)
Teknik atmospheric pressure ionization (API) yang dibahas adalah semua teknik yang relatif lunak. Terutama menghasilkan:
• Molekul ion M+ atau M -• Molekul terprotonasi [M+H]+ • Ion adisi sederhana [M+Na]+
• Ion yang mewakili kehilangan yang sederhana seperti hilangnya air [M+H-H2O]+
Informasi tentang berat molekul yang dihasilkan sangat berharga, namun informasi struktural pelengkap sering dibutuhkan. Untuk memperoleh informasi struktural, ion analit yang terfragmentasi karena bertabrakan dengan molekul netral dalam proses yang dikenal sebagai
collision induced dissociation (CID) atau collisionally activated dissociation (CAD). Tegangan yang diterapkan pada ion analit untuk menambah energi untuk tabrakan dan menciptakan fragmentasi lebih banyak.
Multiple-stage MS (juga disebut tandem MS atau MS / MS atau MSN) adalah cara yang efektif untuk mendapatkan informasi struktur. Dalam instrumen tiga-quadrupole atau quadrupole / quadrupole / time-of-flight, quadrupole yang pertama digunakan untuk memilih ion prekursor. CID mengambil tempat di tahap kedua (quadrupole atau octopole), yang disebut sel tabrakan (collision cell).
Gambar 2.12 MS/MS dengan spektrometer massa triple-quadrupole. Tahap ketiga (quadrupole atau FPT) maka menghasilkan spektrum yang dihasilkan produk ion. Hal ini juga dapat melakukan pemantauan ion terpilih dari hanya beberapa ion produk ketika mengkuantifikasi senyawa target. Dalam perangkap ion dan FT-ICR spektrometer massa, semua ion kecuali ion prekursor yang diinginkan dikeluarkan dari perangkap. Prekursor ion kemudian diberikan energi dan tabrakan untuk menghasilkan produk ion. Ini adalah teknik yang sangat kuat untuk menentukan struktur molekul.
Keuntungan utama dari multiple-stage MS adalah kemampuan untuk menggunakan tahap pertama dari MS untuk membuang ion non-analit. Pembersihan sampel dan pemisahan kromatografi menjadi kurang kritis. Dengan sampel relatif murni sangatlah umum untuk melakukannya lebih jauh dengan pemisahan kromatografi secara bersamaan dan menginjekkan sampel langsung ke spektrometer massa untuk memperoleh spektrum produk massal untuk karakterisasi atau konfirmasi. Penentuan informasi tentang struktur metabolit dari flavonoid glikosida Gendarusin A secara efektif dapat ditentukan dengan spektrometer massa MS/MS triple-quadrupole ini.
2.8.5. Kolom Kromatografi
Kolom dengan kinerja yang tinggi yang dapat digunakan secara luas untuk pemisahan sampel merupakan jantung dari modern kromatografi cair.
1. Kolom untuk kiral kromatografi yang digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa kiral (isomer) yang mempunyai kolom packing seperti α-acid glycoprotein, cellulose tris
(3,5-dimethylphenylcarbamate), vancomycin. Kolom yang ter-packing
dengan α-acid glycoprotein merupakan jenis kolom kiral yang dapat memisahkan enansiomer (optis aktif) dan dapat bekerja secara stereoselektif (Corre et al, 1988). Vancomycin pada silica yang berfungsi sebagai sebagai chiral stationary phase (CSP) dapat memisahkan enansiomer dengan fase organik yang polar. (Svensson et al, 2000).
2. Kolom silika C-18 merupakan standar emas yang digunakan untuk RP-HPLC dengan material packing alkil yang lebih pendek C12 dan C8, kolom nitril (medium-polarity) untuk analit polar serta alkil yang lebih panjang seperti kolom C30 untuk obat yang hidrofobik. Octadecyl-silica (ODS) atau C-18 dapat digunakan secara luas untuk pemisahan mulai dari mikroanalisis sampai isolasi skala besar (Holcapek et al, 2008).
3. Kolom monolitik memiliki permeabilitas tinggi yang dapat digunakan kecepatan alir yang lebih tinggi sehingga mengurangi waktu kromatografi. Kolom monolitik biasa terbuat dari polimer berpori yang cross-linked atau silica berpori (Nobuo et al, 2003).
