BAB III METODOLOGI PENELITIAN
D. Cara Kerja
Penelitian dimulai pada tanggal 24 Maret-12 April 2017 di
Laboratorium Hayati Imuno, Fakultas Farmasi, Kampus III Universitas Sanata
Dharma, Yogyakarta.
1. Tahap Persiapan
a. Pengajuan Ethical Clearance
Ethical clearance (keterangan kelayakan etika) merupakan
surat yang menyatakan bahwa penelitian telah memenuhi prinsip-
prinsip dasar kesejahteraan hewan coba. Penelitian ini telah
mendapatkan persetujuan dari Komisi Ethical Clearance,
Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu, Universitas Gadjah
Mada, Yogyakarta pada tanggal 22 Maret 2017 (Lampiran V).
b. Penentuan Dosis Kopi dan Konversi Dosis
Variasi dosis kopi yang diberikan kepada manusia adalah 25
g, 12.5 g, dan 6.25 g/50 kgBB/hari. Penentuan dosis yang diberikan ke
Rumus 4.1 Konversi dosis manusia 70 kg ke dosis tikus 200 g
Keterangan:
Berat badan manusia standar Internasional = 70 kg
Berat badan manusia standar Indonesia = 50 kg
Berat badan tikus = 200 g
Faktor konversi dari manusia ke tikus g = 0.018
Jadi, variasi dosis bubuk kopi Robusta Manggarai yang
diberikan ke tikus putih adalah 0.15 g, 0.3 g, dan 0.6 g/200gBB dengan
konsentrasi kafein secara berurutan adalah 0.6 mg, 1.2 mg, dan 2.4
mg.
c. Penetapan Konsentrasi Seduhan Peroral
Dasar penetapan konsentrasi seduhan untuk gambir, kopi
Robusta, dan Dulcolax, diperoleh melalui rumus sebagai berikut:
Rumus 4.2 Konsentrasi seduhan
D x BB = C X V
C = (D x BB)/V
Dosis manusia 50 kg = 12.5 g/hari (dosis perlakuan kelompok 2)
Untuk manusia 70 kg = x 12.5 g = 17.5 g/hari
Untuk tikus 200 g = 17.5 g/hari x 0.018
Keterangan:
D = dosis seduhan, g/gBB
BB = bobot maksimum tikus, gBB
C = konsentrasi seduhan, g/ml
V = volume pemberian seduhan peroral, ml
Volume dosis peroral untuk setiap tikus berbeda-beda
bergantung pada bobotnya. Perhitungan volume dosis peroral/tikus
adalah sebagai berikut:
Rumus 4.3 Volume seduhan peroral
d. Adaptasi Hewan Coba
Tikus putih betina (Ratus norvegicus) sebanyak 20 ekor
diadaptasi selama 10 hari yaitu sejak tanggal 24 Maret - 3 April 2017.
Satu ekor tikus putih ditempatkan pada satu kandang metabolik yang
telah dilabeli dengan kode RAL (Lampiran IV, no.8). Selama masa
adaptasi, tikus diberi 20 g BR2/ekor/hari dan air minum RO di setiap
pagi hari. BR2 merupakan jenis pakan standar yang mengandung
nutrisi yang dibutuhkan oleh tikus.
V =
x vol. seduhan peroral yang telah ditetapkan (ml) V = x vol. seduhan peroral yang telah ditetapkan (ml)
e. Induksi Gambir
Induksi gambir dilakukan dua hari sebelum diberikan
perlakuan bahan uji. Peneliti menimbang berat feses tikus (terhitung
sejak pukul 12:30-08:30 WIB) terlebih dahulu untuk memperoleh data
kondisi feses normal. Hal ini dilakukan karena pada pukul 12:00 tikus
diinduksi dengan ekstrak gambir lalu di hari ketiga pada pukul 09:30
diberikan perlakuan bahan uji. Dengan demikian, peneliti dapat
mengetahui efek sembelit dengan membandingkan kondisi feses
sebelum dan sesudah diinduksi gambir dalam rentang waktu yang
sama. Tahap-tahap induksi gambir antara lain:
1) Penimbangan bobot setiap tikus
2) Perhitungan volume dosis peroral/tikus
Volume dosis peroral untuk seduhan ekstrak gambir adalah 5 ml.
3) Pelabelan spoit-spoit berdasarkan volume dosis peroral
4) Penyeduhan gambir
Hasil perhitungan konsentrasi untuk seduhan ekstrak
gambir berdasarkan rumus 4.2 adalah 600 mg ekstrak gambir
diseduh dalam 5 ml air mendidih. Penyeduhan (lama ekstraksi)
dilakukan selama 8 menit agar diperoleh kadar tanin maksimum.
Setelah 8 menit, dilakukan penyaringan dengan kain saring untuk
memisahkan ampas gambir. Hal ini dilakukan agar seduhan dapat
Seduhan didiamkan hingga suhu 400C kemudian dimasukkan ke
dalam spoit-spoit yang telah dilabeli.
5) Seduhan gambir diberikan kepada tikus secara oral menggunakan
sonde oral yang dipasangkan pada spoit setiap pukul 12:00 WIB.
Pemberian oral dilakukan selama 1 menit untuk 1 ekor tikus.
6) Pada hari kedua, setelah diberikan seduhan ekstrak gambir, tikus
juga dipuasakan yaitu dengan tidak memberi minum selama 18 jam
terhitung sejak pukul 15:30-09:30. Tikus tetap diberi pakan BR2.
Hal ini merupakan perlakuan tambahan untuk mengurangi asupan
cairan sehingga tikus mengalami sembelit.
2. Tahap Pemberian Bahan Uji
Sebelum pemberian bahan uji, peneliti memastikan bahwa tikus
sedang mengalami sembelit dengan cara membandingkan berat feses tikus
di pagi hari (terhitung sejak pukul 12:30-08:30 WIB) antara sebelum dan
sesudah diinduksi seduhan ekstrak gambir selama dua hari. Penurunan
berat feses di pagi hari berkorelasi dengan berkurangnya frekuensi
defekasi pada tikus. Hal inilah yang mengindikasikan bahwa tikus sedang
mengalami konstipasi (sembelit).
Penelitian ini menggunakan 4 ulangan hewan coba sehingga
diperlukan 4 hari untuk memberikan bahan uji untuk setiap ulangan.
Setiap ulangan terdiri atas 5 ekor, yang merupakan perwakilan dari kelima
medium, dan minimum serta kontrol positif (Dulcolax) dan negatif (air
hangat). Tahap-tahap pemberian bahan uji sebagai berikut:
a. Penimbangan bobot setiap tikus
b. Perhitungan volume dosis peroral/tikus
Dosis tertinggi kopi Robusta Manggarai yaitu 0.6 g/200gBB,
diberikan kepada tikus peroral dengan volume maksimum yaitu 5 ml.
Dosis kedua yaitu 0.3 g/200gBB, diberikan kepada tikus dengan
membagi 2 nilai volume dosis maksimum sehingga diperoleh volume
dosis peroral yaitu 2.5 ml. Dosis ketiga yaitu 0.15 g/200gBB, diberikan
kepada tikus dengan membagi 4 nilai volume dosis maksimum
sehingga diperoleh volume dosis peroral yaitu 1.25 ml. Dulcolax dan air
hangat diberikan kepada tikus dengan volume dosis peroral adalah 5 ml.
c. Pelabelan spoit-spoit berdasarkan volume dosis peroral
d. Tikus dipuasakan yaitu dengan tidak memberi pakan selama 1 jam
sebelum pemberian bahan uji.
e. Air sebanyak 1000 ml direbus hingga mendidih. Air ini digunakan
untuk membuat seduhan kopi dan Dulcolax serta didiamkan hingga
suhu 400C untuk kontrol negatif.
f. Penyeduhan kopi Robusta Manggarai
Penyeduhan dilakukan untuk dosis tertinggi saja. Hal ini
bertujuan untuk mempermudah pembagian volume dosis peroral untuk
ketiga kelompok dosis kopi Robusta Manggarai. Hasil perhitungan
berdasarkan rumus 4.2 adalah 0.6 g bubuk kopi Robusta diseduh dalam
5 ml air yang nilainya setara dengan 6 g bubuk kopi Robusta diseduh
dalam 50 ml air mendidih (93-950C). Dari hasil penyeduhan ini
diambil tiga variasi volume dosis peroral kopi Robusta Manggarai
yaitu 5 ml, 2.5 ml, dan 1.25 ml. Penyeduhan (lama ekstraksi)
dilakukan selama 5 menit lalu dilakukan penyaringan dengan kain
saring untuk memisahkan ampas kopi. Hal ini dilakukan agar seduhan
dapat masuk ke dalam spoit dan sonde oral yang akan digunakan.
Seduhan didiamkan hingga suhu 400C kemudian dimasukkan ke dalam
spoit-spoit yang telah dilabeli.
g. Melarutkan Dulcolax
Dulcolax dihaluskan terlebih dahulu dengan menggunakan
mortar. Hasil perhitungan konsentrasi untuk seduhan Dulcolax
berdasarkan rumus 4.2 diperoleh 0.252 mg Dulcolax diseduh dalam 5
ml air mendidih. Dulcolax dilarutkan selama 5 menit kemudian
didiamkan hingga suhu 400C lalu dimasukkan ke dalam spoit-spoit
yang telah dilabeli.
h. Sebanyak 5 ml air mendidih suhu 400C dimasukkan ke dalam spoit
untuk kontrol negatif.
i. Seduhan bubuk kopi Robusta Manggarai, Dulcolax, dan air hangat
diberikan kepada tikus secara oral menggunakan sonde oral yang
dipasangkan di ujung spoit pada pukul 09:30-11:30 WIB. Pemberian
3. Tahap Pengambilan Data
a. Pengamatan frekuensi defekasi
Frekuensi defekasi diamati selama 6 jam terhitung dari waktu
pemberian seduhan bahan uji. Berikut adalah lembar pengambilan
data frekuensi defekasi pada tikus:
Tabel 3.1 Lembar pengambilan data frekuensi defekasi tikus putih
Hari, tanggal: Tikus 1 Waktu perlakuan:--:-- Tikus 2 Waktu perlakuan:--:-- Tikus 3 Waktu perlakuan:--:-- Tikus 4 Waktu perlakuan:--:-- Tikus 5 Waktu perlakuan:--:-- Waktu Defekasi Berat Basah Feses (g) Waktu Defekasi Berat Basah Feses (g) Waktu Defekasi Berat Basah Feses (g) Waktu Defekasi Berat Basah Feses (g) Waktu Defekasi Berat Basah Feses (g) Dst ∑ berat basah feses= ∑ berat basah feses= ∑ berat basah feses= ∑ berat basah feses= ∑ berat basah feses= ∑ berat kering feses= ∑ berat kering feses= ∑ berat kering feses= ∑ berat kering feses= ∑ berat kering feses=
b. Pengamatan konsistensi feses
Konsistensi feses ditentukan oleh kandungan air dalam feses
dengan menghitung selisih berat feses basah dengan berat feses kering
normal (n) dengan kadar air 45-56 % agak lembek (al) dengan kadar air 57-68 % lembek (l) dengan kadar air 69-80 % cair (c) dengan kadar air > 80 %
Feses tikus yang dikeluarkan setiap defekasi ditimbang berat
basahnya lalu dikeringkan selama 19 jam terhitung sejak pukul 16:00-
11:00 pada suhu 24.9 - 28.4 0C. Berikut adalah lembar pengambilan
data konsistensi feses:
Tabel 3.2 Lembar pengambilan data konsistensi feses tikus putih
Kelompok Dosis
Total berat feses basah dr ke-4 tikus-
A (gram)
Total berat feses kering dr ke-4 tikus -B (gram) Kadar air feses-C (A-B) (gram) Kadar air yg hilang (%) (C/A x 100 %) Ket.* 0.15 g/200gBB 0.3 g/200gBB 0.6 g/200gBB Dulcolax Akuades
*Ket. diisi dengan kategori konsistensi feses