BAB II PUSTAKA
F. Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi …
Kromatografi lapis tipis kinerja tinggi adalah teknik analisis instrumental yang didasari kemampuan kromatografi lapis tipis yang lebih maksimal dan baik (Srivastava, 2011). Kromatografi lapis tipis adalah kromatografi planar yang fase diamnya berupa lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang
didukung oleh lempeng kaca, lempeng aluminium, ataupun lempeng plastik. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending) (Gandjar dan Rohman, 2007).
Pada KLTKT metode pemisahan jauh lebih baik dibanding dengan KLT karena KLTKT dapat melakukan pemisahan dengan lebih efisien karena lempeng KLTKT memiliki ukuran partikel yang lebih kecil, waktu yang dibutuhkan untuk pengembangan lempeng lebih singkat dan tidak membutuhkan banyak fase gerak karena ukuran lempeng KLTKT yang lebih kecil yaitu 10 x 10 atau 10 x 20 cm, sehingga hanya diperlukan pengembangan selama 7-20 menit yang membuat metodel KLTKT menjadi metode yang efisien dalam pelaksanaannya. (Srivastava, 2011).
Untuk identifikasi suatu senyawa, bercak hasil pemisahan yang dilakukan oleh fase gerak akan dikarakterisasi berdasarkan nilai faktor retensinya (Rf). Nilai Rf adalah rasio jarak yang dipindahkan oleh pelarut pada suatu zat terlarut yang dibandingkan terhadap jarak yang dipindahkan oleh garis depan pelarut selama waktu yang sama. Nilai batas Rf adalah 1 ≤ Rf ≥ 0, karena ketika Rf = 0, berarti noda tidak berpindah dari posisi awalnya dan jika Rf = 1 maka noda tidak tertahan oleh fase diam dan berpindah bersama tarikan terdepan pelarut (Day dan Underwood, 2002 ; Poole, 2003).
Terdapat dua tipe fase pemisahan di dalam kromatografi yang didasarkan pada perbedaan polaritas antara fase diam dan fase gerak. Tipe yang pertama adalah
kromatografi fase normal dimana fase diam akan cenderung lebih polar dibandingkan dengan fase gerak. Fase diam polar yang biasa digunakan antara lain alumina serta silika dengan fase gerak seperti heksan ataupun propileter. Tipe kedua adalah kromatografi fase terbalik dimana fase diam akan cenderung lebih non-polar dibandingkan dengan fase gerak. Fase diam non polar yang biasa digunakan antara lain adalah hidrokarbon dengan fase gerak yang relatif polar seperti air, metanol, atau asetonitril (Skoog, 1986).
Pada kromatografi fase normal, komponen yang bersifat non polar akan terbawa fase gerak terlebih dahulu. Sebaliknya, pada kromatgrafi fase terbalik, komponen yang bersifat lebih polar akan cenderung terbawa oleh fase gerak terlebih dahulu (Skoog, 1986).
1. Fase Diam
Pada KLTKT, fase diam yang digunakan berukuran sangat halus serta memiliki pori-pori seragam serta ketebalan lapisannya hanya 0,1 mm, ukuran partikel fase diam pada KLTKT juga lebih kecil, dan juga lebih tipis. Sampel yang digunakan untuk penotolan hanya sedikit. Bercak penotolannya berdiameter antara 0,1-0,5 mm sehingga dengan lempeng 10 x 10 saja sudah dapat melakukan analisis. Pada KLTKT resolusi pemisahan sudah dapat terlihat jelas pada jarak pengembangan sampel antara 3-6 cm yang menunjukkan pemisahan yang lebih cepat, mengurangi zona difusi, efisiensi pemisahan yang lebih baik, batas deteksi yang lebih kecil, dan dapat menotolkan banyak sampel dalam satu lempeng (Gandjar dan Rohman, 2007; Sherma and Fried, 1996).
Tabel II. Jenis fase diam yang digunakan pada tahun 1979-1985 (Spangernberg, Poole, and Weins, 2011)
Dalam sistem KLTKT fase diam yang biasa digunakan adalah uncoated silica gel. Fase diam lain selain silica gel adalah aluminium oksida, kieselguhr, magnesium oksida dan magnesium silica (Florisil®) juga merupakan fase diam yang sering digunakan dalam KLT (Spangernberg et al., 2011).
Gambar 4. Struktur Silika gel (Eastman, 2010)
Tabel III. Karakteristik lempeng yang biasa digunakan dalam KLT (Spangernberg et al., 2011) Parameter TLC HPTLC UTLC ukuran lempeng (cm) 20 x 20 10 x 10 6 x 3,6 ketebalan lempeng (m) 100–250 100–200 10 ukuran partikel (m) 8–10 6–8 - volume penotolan (mL) 1–5 0,1-5 0,01-0,1 jarak pemisahan (cm) 6-15 3-7 1-3
maksimal diameter penotolan (mm) 3–6 1–1,5 0,5–1 waktu pemisahan (menit) 30–200 3–20 1–5
tinggi lempeng (m) 35–75 23–25 -
totolan per lempeng 10 9–18 6
limit deteksi dalam reflektan (ng) 1–5 0,5–1 0,5 limit deteksi dalam fluoresens (pg) 50–100 5–10 5
Tipe Fase Diam TLC (%) HPTLC (%)
Gel Silika G dan H 73,3 73,5
Selulosa 5,2 3,1 Poliamida 1,8 1,4 Fase Terikat 5,5 22,0 Aluminium Oksida 2,6 kieselguhr 0,3 Gel 0,4
Gugus silanol tunggal
Dua gugus silanol
2. Fase Gerak
Pelarut dalam kromatografi memiliki dua fungsi yaitu sebagai pembawa sampel dan untuk memfasilitasi suatu sistem pemisahan. Fase gerak akan mengaliri fase diam dan memfasilitasi transpor sampel yang ditotolkan. Oleh karena itu, kekuatan pelarut mempengaruhi kemampuannya untuk membawa sampel melalui sistem dan selektivitasnya dalam menentukan apakah pemisahan dapat dilakukan. Sebagai pembawa, sampel harus terlarut ke dalam fase gerak dan untuk terjadinya pemisahan, sampel harus tertahan oleh fase diam. Pada keadaan elusi yang ideal, setiap perpindahan dari sampel tidak saling mempengaruhi dengan sampel lain yang ditotolakan pada lempeng tersebut (Bollinger, Brenner, Ganshirt, Mangold, Seiler, Stahl, Waldi, 1962; Spangernberg et al., 2011).
Untuk mendapatkan komposisi fase gerak yang optimal yang dapat memisahkan campuran, pemilihan pelarut dapat didasari atas beberapa alasan, antara lain:
a. Komposisi pelarut harus dapat memisahkan analit sampai dengan nilai Rf yang baik yang terlihat berdasarkan kekuatan pelarutnya.
b. Komposisi pelarut yang selektif yang terlihat dari resolusi dua campuran yang sama-sama dapat terpisah. Parameter selektivitas akan mempengaruhi nilai resolusinya.
c. Difusi harus sekecil mungkin selama pemisahan dan waktu yang diperlukan untuk memisah juga harus sesingkat mungkin.
Beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak:
a. Fase gerak harus memiliki kemurnian yang sangat tinggi karena KLT adalah metode yang sangat sensitif.
b. Daya elusi fase gerak harus diatur untuk membentuk Rf yang berkisar antara 0,2-0,8 agar pemisahannya maksimal.
c. Untuk pemisahan dengan fase diam polar seperti silika gel, polaritas larutan akan mempengaruhi kecepatan migrasi sampel yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan meningkatkan nili Rf secara signifikan.
d. Sampel-sampel ionik dan sampel-sampel polar lebih baik menggunakan campuran pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu.
(Gandjar dan Rohman, 2007)