BAB III METODOLOGI PENELITIAN …
F. Tata Cara Penelitian
NaOH sebanyak 2 g ditimbang seksama dan dimasukkan ke dalam gelas Beaker kemudian dilarutkan dengan aquabidest. Larutan NaOH tersebut dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL dan dilarutkan dengan aquabidest sampai batas tanda, sehingga diperoleh larutan NaOH dengan konsentrasi 1 N.
2. Pembuatan larutan baku asam kafeat
Asam kafeat lebih kurang 25,0 mg ditimbang seksama dan dimasukkan ke dalam gelas Beaker, kemudian dilarutkan dengan aquabidest panas bersuhu ± 80C di atas kompor listrik. Larutan berisi baku dimasukkan ke dalam labu ukur 25,0 mL dan di add dengan aquabidest sampai batas tanda, sehingga diperoleh larutan baku asam kafeat dengan konsentrasi 1 mg/mL.
b. Pembuatan seri larutan baku
Diambil 0,8; 1,3; 1,8; 2,3; 2,8; 3,3 mL larutan stok asam kafeat 1 mg/mL (a) dengan menggunakan makropipet dan masing-masing dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL kemudian diencerkan dengan aquabidest sampai batas tanda. Maka didapatkan larutan dengan konsentrasi asam kafeat masing-masing 0,08; 0,13; 0,18; 0,23; 0,28; dan 0,33 mg/mL.
3. Preparasi sampel
Sejumlah biji kopi diambil dari dalam wadah kaca yang telah digojog sebelumnya untuk menghomogenkan biji kopi yang ada di dalam stoples. Biji kopi diambil dari dalam stoples untuk digiling menggunakan coffee grinder hingga menjadi serbuk dan diayak dengan ayakan mesh 50 agar mendapatkan serbuk yang lebih halus. Hasil ayakan diambil dan ditimbang sejumlah yang diinginkan.
a. Metode ekstraksi I (ekstraksi serbuk biji kopi arabika dengan metode infusion)
Serbuk yang telah didapat dari proses pemisahan sebelumnya ditimbang dengan seksama sebanyak 6 g dan diekstraksi dengan 250 mL aquabidest panas menggunakan syphon. Aquabidest yang telah dipanaskan terlebih dahulu dengan menggunakan kompor listrik hingga mencapai suhu ± 90C dimasukkan ke labu
alas bulat di bagian bawah syphon. Lampu spiritus yang terdapat pada bagian bawah syphon dinyalakan untuk mendidihkan aquabidest panas pada bagian bawah syphon hingga menjadi uap air dan naik ke tabung di bagian atas syphon.
Aquabidest panas yang naik ke bagian atas syphon diukur suhunya sampai ± 95C kemudian serbuk kopi yang telah ditimbang dimasukkan ke dalam tabung pada bagian atas syphon yang telah berisi aquabidest panas yang naik dari bagian bawah syphon dan ditunggu sampai 1 menit, kemudian air beserta serbuk kopi diaduk dan lampu spiritus dimatikan. Ekstrak air seduhan serbuk kopi yang berada pada bagian atas tabung syphon ditunggu sampai turun kembali ke labu alas bulat pada bagian bawah syphon melalui saringan yang berada di tengah-tengah antara tabung dan labu alas bulat untuk memisahkan endapan serbuk kopi dari cairan hasil ekstraksi. Ekstrak air seduhan yang didapat diambil untuk dilanjutkan dengan proses hidrolisis sebelum dilakukan penotolan diatas lempeng KLTKT.
b. Metode ekstraksi II (ekstraksi serbuk biji kopi arabika dengan metode decoction)
Serbuk biji kopi yang telah didapat dari proses pemisahan sebelumnya ditimbang dengan seksama sebanyak 6 g kemudian diekstraksi dengan 250 mL aquabidest pada suhu ± 95C di atas kompor listrik dengan bantuan magnetic stirrer (5000 rpm) selama 30 menit. Hasil ekstraksi kemudian disaring degan menggunakan kertas saring dengan bantuan corong Buchner dan pompa vakum. Hasil ekstraksi yang telah disaring kemudian dimasukkan ke dalam gelas Beaker untuk kemudian dilanjutkan dengan proses hidrolisis sebelum digunakan untuk penotolan diatas lempeng KLTKT.
4. Hidrolisis sampel
Sampel hasil kedua ekstraksi (3a dan 3b) serta replikasinya dipanaskan di atas waterbath bersuhu ± 85C selama 15 menit dengan sebelumnya diukur pHnya menggunakan pH meter. Masing-masing sampel kemudian ditambahkan 4 mL larutan NaOH 1 N. Kemudian dipanaskan kembali selama 15 menit di atas waterbath. Setelah itu, masing-masing sampel dan replikasinya diukur kembali pHnya menggunakan pH meter sampai pH ±12 (Checker® HI 1270).
5. Penentuan panjang elusi
Sampel hasil hidrolisis beserta ketiga replikasinya serta larutan baku 1 mg/mL, masing-masing ditotolkan ke atas lempeng KLTKT sebanyak 1,0 L menggunakan Autosampler Camag KLT aplikator, Linomat 5 dengan kecepatan penotolan 30 nL/sec pada lempeng KLTKT silika gel 60 F254 dengan panjang totolan 6 mm dan penotolan diposisikan 15 mm dari bagian bawah lempeng dan 15 mm dari bagian samping lempeng yang kemudian dikembangkan dalam bejana
kromatografi dengan fase gerak toluen p.a. : etil asetat p.a.: asam format p.a. (7 : 2 : 1). Volume fase gerak yang digunakan adalah 50 mL. Pengembangan
dilakukan setinggi 5 cm dan 8 cm. Lempeng KLTKT silika gel 60 F254 kemudian dikeluarkan dan dikeringkan di dalam oven bersuhu ± 50C selama 5 menit. Bercak dideteksi pada panjang gelombang 330 nm (Rivelli et al., 2007), 325 nm dan 335 nm dengan menggunakan densitometer Camag KLT Scanner 3.
6. Optimasi metode KLTKT-Densitometri
a. Pembuatan fase gerak
Masing-masing fase gerak yang digunakan, diambil dengan perbandingan voume dan jenis fase gerak seperti yang tertera pada tabel IV dan dicampur dalam erlenmeyer bertutup kemudian digojog, yaitu:
Tabel IV. Jenis dan komposisi fase gerak
Campuran Fase Gerak Kloroform p.a (mL) Toluen p.a (mL) Etil asetat p.a (mL) Asam format p.a (mL) Komposisi 1 35 - 10 5 Komposisi 2 - 25 15 10 Komposisi 3 - 35 10 5
b. Optimasi pemisahan asam kafeat dalam larutan ekstrak biji kopi 1)Larutan baku asam kafeat 1 mg/mL beserta sampel dari masing-masing ekstraksi yang telah dihidrolisis (pelarut aquadest panas), ditotolkan sebanyak 2,0 L menggunakan Autosampler Camag KLT aplikator, Linomat 5 dengan kecepatan penotolan 50 nL/sec pada lempeng KLT silika gel 60 F254 dengan panjang totolan 6 mm. Lempeng silika segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi dengan menggunakan fase gerak yang telah dibuat sesuai dengan komposisi 1 pada tabel IV. Setelah mencapai jarak elusi (8 cm), Lempeng KLT silika gel 60 F254 dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan di dalam oven bersuhu ± 50C selama lima menit. Bercak yang muncul dideteksi pada panjang gelombang 330 nm (Rivelli et al., 2007) dengan menggunakan densitometer Camag KLT Scanner 3.
2)Larutan baku asam kafeat 1 mg/mL beserta sampel dari masing-masing ekstraksi yang telah dihidrolisis (pelarut aquadest panas), ditotolkan sebanyak 2,0 L menggunakan Autosampler Camag KLT aplikator, Linomat 5 dengan kecepatan penotolan 50 nL/sec pada lempeng KLT silika gel 60 F254 dengan panjang penotolan 4 mm. Lempeng silika segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi dengan menggunakan fase gerak yang telah dibuat sesuai dengan komposisi 2 pada tabel IV. Setelah mencapai jarak elusi (8 cm), Lempeng KLT silika gel 60 F254 dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan di dalam oven bersuhu ± 50C selama lima menit. Bercak yang muncul dideteksi pada panjang gelombang 330 nm (Rivelli et al., 2007) dengan menggunakan densitometer Camag KLT Scanner 3.
3)Larutan baku asam kafeat 0,08; 0,13; 0,18; 0,23; 0,28; dan 0,33 mg/mL beserta sampel hasil hidrolisis ditotolkan sebanyak 1,0 L menggunakan Autosampler Camag KLT aplikator, Linomat 5 dengan kecepatan penotolan 30 nL/sec pada lempeng KLTKT silika gel 60 F254 dengan panjang totolan 6 mm. Lempeng silika segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi dengan menggunakan fase gerak yang telah dibuat sesuai dengan komposisi 3 pada tabel IV. Setelah mencapai jarak elusi (8 cm), Lempeng KLTKT silika gel 60 F254 dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan di dalam oven bersuhu ± 50C selama lima menit. Bercak yang muncul dideteksi pada panjang gelombang 330 nm (Rivelli et al., 2007) dengan menggunakan densitometer Camag KLT Scanner 3.
c. Ripitabilitas fase gerak hasil optimasi
Larutan baku asam kafeat 0,08; 0,13; 0,18; 0,23; 0,28; dan 0,33 mg/mL direplikasi sebanyak tiga kali beserta sampel hasil hidrolisis dan ketiga replikasinya ditotolkan sebanyak 1,0 L menggunakan Autosampler Camag KLT aplikator, Linomat 5 dengan kecepatan penotolan 30 nL/sec pada lempeng KLTKT silika gel 60 F254 dengan besar penotolan 6 mm. Lempeng silika segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi dengan menggunakan densitometer Camag KLT Scanner 3.menggunakan fase gerak hasil optimasi hingga mencapai jarak elusi (8 cm), Lempeng KLTKT silika gel 60 F254 dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan di dalam oven bersuhu 500C selama lima menit. Bercak yang muncul dideteksi pada panjang gelombang 330 nm (Rivelli et al., 2007) 325 nm dan 335 nm dengan menggunakan densitometer Camag KLT Scanner 3. Parameter optimal dihitung berdasarkan nilai faktor retardasi (Rf); nilai faktor asimetris (As) dan % KV nilai AUC.