PENENTUAN LETHAL DOSE 50 (LD 50 ) ASAP CAIR GRADE 2 PADA MENCIT BETINA
KUALITAS HIMPUNAN BASIS STO-3G DAN 3-21G SEBAGAI METODE
PERHITUNGAN AB INITIO SENYAWA TURUNAN KALANON
Ponco Iswanto, Moch. Chasani dan Eva Vaulina YD
Jurusan Kimia, Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto, Indonesia
Intisari
Penelitian dan pengembangan senyawa Kalanon, hingga saat ini masih dilakukan. Kalanon adalah senyawa bahan alam yang memiliki aktivitas antileukemia. Hingga saat ini, modifikasi struktur senyawa Kalanon dilakukan melalui sentuhan teknologi komputer. Teknik tersebut dikenal dengan analisis QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship), yang merupakan kombinasi antara metode perhitungan kimia komputasi dan statistik. Metode perhitungan kimia komputasi terdiri dari metode mekanika molekular dan struktur elektronik (semiempiris, DFT dan ab initio). Metode perhitungan kimia komputasi yang telah dilakukan untuk analisis QSAR senyawa Kalanon, adalah metode semiempiris AM1 dan PM3. Aplikasi metode perhitungan kimia komputasi semiempiris AM1 menunjukkan bahwa nilai aktivitas antileukemia turunan Kalanon baru, lebih baik daripada Kalanon.
Metode ab initio, dalam banyak hal, terbukti lebih baik daripada semiempiris. Hal ini dibuktikan melalui hasil perhitungan ab initio yang lebih akurat dari hasil semiempiris dan mekanika molekular. Penelitian ini melakukan aplikasi dan seleksi terhadap himpunan basis STO-3G dan 3-21G, yang diharapkan dapat digunakan untuk perhitungan ab initio turunan Kalanon pada analisis QSAR-Ab initio. Cara yang dipakai adalah dengan mencocokkan hasil perhitungan spektra NMR dari kedua himpunan basis tersebut dengan data spektra NMR percobaan senyawa Kalanon induk. Hasil yang didapat adalah himpunan basis STO-3G dapat digunakan untuk perhitungan senyawa Kalanon dan turunannya.
Pendahuluan
Kemajuan teknologi komputer yang pesat, banyak memberikan kontribusi positif terhadap perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi, termasuk Ilmu Kimia. Peran teknologi komputer di dalam Ilmu Kimia sangat besar, hingga memunculkan cabang ilmu baru yang dikenal dengan Kimia Komputasi. Sejak awal perkembangannya hingga hari ini, Kimia Komputasi banyak memberikan kontribusi dalam hal pengembangan teori kimia hingga aspek penerapannya. Salah satu penerapan Kimia Komputasi adalah perancangan struktur senyawa obat baru. Teknik ini dikenal dengan analisis QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship), yang merupakan kombinasi antara metode perhitungan kimia komputasi dan analisis statistik. Jadi, metode perhitungan kimia komputasi dan analisis statistik adalah dua faktor yang mempengaruhi kerja analisis QSAR. Metode perhitungan kimia komputasi yang tersedia adalah metode mekanika molekular (MM) dan struktur elektronik (semiempiris, DFT dan ab initio), sedangkan untuk analisis statistik, telah banyak yang menggunakan MLR (multiple linear regression) dan PCR (principle component regression).
Penelitian tentang analisis QSAR telah banyak dilakukan untuk mendapatkan senyawa baru (turunan) yang memiliki aktivitas lebih baik daripada senyawa induk, seperti analisis QSAR: senyawa antiradikal (Tahir dkk, 2003), turunan Fluorokuinolon sebagai zat antibakteri (Iswanto dkk, 2005), dan turunan Kalanon sebagai zat antileukemia (Iswanto dkk, 2007). Di lain pihak, pengembangan senyawa aktif bahan alam yang berpotensi sebagai obat, terus dilakukan. Modifikasi struktur senyawa induk guna mendapatkan senyawa baru dengan aktivitas lebih baik, merupakan kerja lanjutan dari penemuan senyawa aktif bahan alam. Namun, sebelum dikenalnya teknik QSAR, modifikasi struktur tersebut dilakukan berdasarkan intuisi dan pengalaman perancang, bahkan ada yang bersifat coba-coba dan tidak terarah. Hasil modifikasi dengan cara tersebut tidak selalu menghasilkan senyawa baru yang diharapkan, dan tidak ekonomis. Munculnya teknik QSAR dapat mengarahkan kerja modifikasi struktur, karena teknik ini disertai dengan alasan statistik (kebolehjadian) yang terkuantisasi (Harjono, 2006).
Senyawa Kalanon, salah satu senyawa bahan alam yang terdapat di Indonesia, pengembangannya masih dilakukan hingga saat ini. Kalanon memiliki bobot molekul 424,1283 g/mol dan titik leleh 172 0C, serta mempunyai aktivitas antileukemia terhadap sel L1210 (Chasani, 2002). Modifikasi struktur senyawa Kalanon telah dilakukan baik melalui
cara konvensional (intuisi dan pengalaman) maupun melalui sentuhan teknologi komputer (teknik QSAR). Hasil dari teknik QSAR dengan metode perhitungan semiempiris AM1, menunjukkan bahwa nilai aktivitas senyawa turunan lebih baik dari Kalanon induk (Iswanto dkk, 2007). Informasi ini mendorong kegiatan penelitian ke arah penggunaan metode perhitungan kimia komputasi yang lebih akurat, tetapi tetap tidak berbiaya mahal.
Metode ab initio, dalam banyak hal, terbukti lebih baik daripada semiempiris. Hal ini dibuktikan melalui hasil perhitungan ab initio yang sangat dekat dengan nilai percobaan (lebih akurat) (Foresman, 1996). Berdasarkan informasi hasil metode semiempiris tersebut dan keunggulan ab initio, maka perlu dilakukan penelitian analisis QSAR turunan Kalanon dengan metode perhitungan ab initio. Langkah pertama untuk melakukan penelitian ini adalah pemilihan himpunan basis yang sesuai untuk perhitungan turunan Kalanon secara ab initio. Kata “sesuai” mengandung arti bahwa himpunan basis yang dipilih harus dapat menghasilkan data hasil yang mendekati data percobaan, dan tidak mahal secara komputasi (durasi proses perhitungan yang cepat). Penelitian ini melakukan kajian dan seleksi terhadap himpunan basis STO-3G dan 3-21G sebagai metode perhitungan kimia komputasi untuk senyawa Kalanon dan turunannya.
Metode Penelitian Bahan
Penelitian ini merupakan penelitian teoretik yang menggunakan data spektra NMR
1
H dan 13C milik senyawa Kalanon sebagai senyawa induk dari turunan Kalanon yang sudah ada. Data lain yang digunakan adalah rekaman hasil perhitungan kimia komputasi semiempiris yang telah dilakukan terhadap senyawa Kalanon (Iswanto, 2007).
Peralatan
Peralatan yang digunakan pada penelitian ini adalah:
1. Satu unit komputer dengan spesifikasi: Prosesor Pentium IV 1,6 GHz, RAM 256 MB.
2. Operating System: Windows XP.
3. Perangkat lunak Gaussian98W, MS notepad dan MS Excel
Cara kerja
Model senyawa Kalanon induk dihitung geometri (struktur) optimumnya dengan menggunakan himpunan basis STO-3G. Setelah diperoleh struktur optimum, dengan himpunan basis yang sama, koordinat atom-atomnya digunakan untuk menghitung spektra NMR teoretik. Langkah optimasi geometri dan perhitungan spektra NMR teoretik juga dilakukan untuk tetrametilsilan (TMS). Kemudian, untuk mendapatkan nilai pergeseran kimia senyawa Kalanon, nilai perhitungan spektra NMR atom C Kalanon dikurangi nilai atom C TMS. Demikian pula dengan nilai perhitungan atom H, yaitu nilai atom H Kalanon dikurangi nilai atom H TMS. Hasil koreksi dengan TMS tersebut merupakan nilai pergeseran kimia Kalanon.
Setelah penerapan himpunan basis STO-3G selesai, maka perhitungan optimasi struktur dan spektra NMR kembali dilakukan untuk himpunan basis 3-21G. Kemudian, hasil perhitungan kedua himpunan basis dibandingkan dan dipilih himpunan basis yang paling mendekati data percobaan. Himpunan basis yang terpilih dapat digunakan untuk perhitungan kimia komputasi senyawa Kalanon secara ab initio.
Hasil dan Pembahasan
Kalanon adalah senyawa bahan alam yang memiliki massa molekul relatif (Mr) dan bentuk struktur yang besar. Struktur molekul Kalanon dapat dilihat pada Gambar 1.
O
O HO
O
O
Gambar 1. Struktur molekul Kalanon
Berdasarkan jumlah atom pada Kalanon, metode perhitungan kimia komputasi yang dapat menghitung dengan cepat adalah metode MM. Tetapi, metode MM ini tidak dapat menghasilkan data yang terkait dengan sifat elektronik senyawa seperti muatan atom dan momen dwi kutub. Karena reaksi-reaksi kimia yang terjadi di alam ini umumnya berkaitan erat sifat elektron yang ada di dalam struktur molekul, maka metode perhitungan struktur elektronik harus digunakan untuk menghasilkan data tersebut.
Kualitas perhitungan kimia komputasi yang dibutuhkan dalam aplikasi QSAR, adalah metode yang terdapat parameterisasi data percobaan sehingga data hasil perhitungan kimia komputasi diharapkan tidak jauh berbeda dengan percobaan. Metode perhitungan struktur elektronik yang terdapat parameterisasi data percobaan adalah metode semiempiris, sehingga metode ini banyak digunakan untuk mendukung teknik QSAR. Namun, banyak pula hasil penelitian yang membuktikan bahwa metode ab initio lebih akurat atau tidak jauh berbeda dengan data percobaan. Karena metode ab initio membutuhkan penerapan salah satu himpunan basis yang ada di dalamnya, maka perlu dilakukan seleksi guna memilih himpunan basis yang sesuai untuk senyawa Kalanon. Proses seleksi ini dilakukan dengan menggunakan data percobaan yang mampu menggambarkan senyawa Kalanon dengan spesifik dan akurat. Proses ini dikenal dengan parameterisasi metode perhitungan dengan data percobaan. Salah satu data percobaan yang dapat digunakan adalah spektra NMR.
Faktor lain yang harus dipertimbangkan dalam seleksi himpunan basis adalah waktu yang dibutuhkan dalam proses perhitungan. Lebih singkat proses perhitungan, lebih baik. Oleh sebab itu, penelitian ini hanya mengambil dua himpunan basis yang akan diseleksi, yaitu STO-3G dan 3-21G. Himpunan basis STO-3G adalah singkatan dari Slater- Type-Orbitals yang disimulasi oleh 3 fungsi Gaussian. Himpunan basis 3-21G adalah nama lain dari himpunan basis split valence, yang terdiri dari 3 fungsi Gaussian inti dan 2 bagian basis split (2 Gaussian pada orbital dalam dan 1 Gaussian untuk orbital luar). Kedua himpunan basis ini merupakan himpunan basis yang sederhana, sehingga tidak memerlukan waktu lama dalam proses perhitungannya (Pranowo, 2001).
Proses seleksi himpunan basis dilakukan dengan membandingkan hasil perhitungan NMR Kalanon dari kedua himpunan basis, kemudian memilih himpunan basis yang paling dengan dengan data NMR Kalanon percobaan. Berikut adalah data perhitungan dan seleksi himpunan basis.
O O HO O O C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C12 C11 C13 C14 C15 C16 C18 C19 C20 C21 C22 C23 C24 C25 C26 C27 C28 C29 C1
Gambar 2. Penomoran atom pada Kalanon
Data hasil perhitungan spektra NMR dengan menggunakan perangkat lunak Gaussian98W dapat dilihat pada Tabel 1 dan Tabel 2. Tabel-tabel ini terdiri dari delapan kolom. Kolom ke-3 menggambarkan data hasil perhitungan pergeseran kimia (δ) teoretik senyawa Kalanon, sedangkan kolom ke-4 merupakan nilai pergeseran kimia atom-atom yang ada di dalam senyawa tetrametilsilan (TMS). Nilai akhir pergeseran kimia Kalanon dapat diperoleh dengan cara mengurangi nilai δ TMS dengan nilai δ Kalanon (lihat kolom ke-5). Kemudian seleksi terhadap dua himpunan basis dilakukan dengan menghitung nilai PRESS (Prediction Sum of Square), yaitu jumlah nilai kuadrat dari selisih antara nilai perhitungan/prediksi dan nilai percobaan (kolom ke-6). Himpunan basis terpilih adalah himpunan basis yang memiliki nilai PRESS terendah (lihat kolom ke-8).
Tabel 1. Kualitas perhitungan 13C dan 1H NMR dengan himpunan basis STO-3G NO URUT ATOM δ KALANON δ TMS δ
RELATIF EKSP. SELISIH (SELISIH)2
1 2 3 4 5 6 7 8 1 C1 124,5487 249,4347 124,886 127,5 2,614 6,832996 2 C2 125,9865 249,4347 123,4482 127,2 3,7518 14,076003 3 C3 118,0423 249,4347 131,3924 139,7 8,3076 69,016218 4 C6 125,1546 249,4347 124,2801 127,8 3,5199 12,389696 5 C7 114,0017 249,4347 135,433 15,3 -120,133 14431,938 6 C8 143,4254 249,4347 106,0093 102,4 -3,6093 13,027046 7 C9 99,1213 249,4347 150,3134 155,9 5,5866 31,2101 8 C11 110,1842 249,4347 139,2505 158 18,7495 351,54375 9 C12 139,8716 249,4347 109,5631 112,6 3,0369 9,2227616 10 C13 100,3548 249,4347 149,0799 156,4 7,3201 53,583864 11 C14 140,5373 249,4347 108,8974 105,7 -3,1974 10,223367 12 C15 93,6893 249,4347 155,7454 161,5 5,7546 33,115421 13 C16 138,6974 249,4347 110,7373 103,8 -6,9373 48,126131 14 C18 181,6059 249,4347 67,8288 79,1 11,2712 127,03995 15 C19 137,3569 249,4347 112,0778 127 14,9222 222,67205 16 C20 132,2364 249,4347 117,1983 115,2 -1,9983 3,9932029 17 C21 72,4167 249,4347 177,018 198,8 21,782 474,45552 18 C22 118,749 249,4347 130,6857 140,3 9,6143 92,434764 19 C25 122,7035 249,4347 126,7312 132,3 5,5688 31,011533 20 C26 125,1302 249,4347 124,3045 128,2 3,8955 15,17492 21 C27 125,5119 249,4347 123,9228 128,2 4,2772 18,29444 22 C28 222,0507 249,4347 27,384 27,4 0,016 0,000256 23 C29 221,5333 249,4347 27,9014 27,4 -0,5014 0,251402 TOTAL 16069,633 24 H pd C12 27,1064 33,7527 6,6463 5,88 -0,7663 0,5872157 25 H pd C19 28,1495 33,7527 5,6032 5,42 -0,1832 0,0335622 26 H pd C20 25,9714 33,7527 7,7813 6,64 -1,1413 1,3025657 27 H pd C28 33,0169 33,7527 0,7358 0,98 0,2442 0,0596336 28 H pd C28 32,8756 33,7527 0,8771 0,98 0,1029 0,0105884 29 H pd C28 32,8561 33,7527 0,8966 0,98 0,0834 0,0069556 30 H pd C29 33,2414 33,7527 0,5113 0,98 0,4687 0,2196797 31 H pd C29 32,7476 33,7527 1,0051 0,98 -0,0251 0,00063 32 H pd C29 32,657 33,7527 1,0957 0,98 -0,1157 0,0133865 33 OH pd C9 22,1839 33,7527 11,5688 12,46 0,8912 0,7942374 TOTAL 3,0284549 Keterangan: δ = pergeseran kimia (ppm)
EKSP. = data percobaan pergeseran kimia kalanon
Berdasarkan data pada Tabel 1 dan Tabel 2, himpunan basis STO-3G memiliki nilai PRESS yang paling rendah. Nilai PRESS himpunan basis STO-3G untuk spektra 1H NMR sebesar 16069,633 dan untuk 13C NMR sebesar 3,0284549, sehingga himpunan basis ini dapat dipilih untuk digunakan pada perhitungan senyawa Kalanon dan turunannya.
Tabel 2. Kualitas perhitungan 13C dan 1H NMR dengan himpunan basis 3-21G NO URUT ATOM δ KALANON δ TMS δ
RELATIF EKSP. SELISIH (SELISIH)2
1 2 3 4 5 6 7 8 1 C1 94,6179 214,6395 120,0216 127,5 7,4784 55,92646656 2 C2 94,646 214,6395 119,9935 127,2 7,2065 51,93364225 3 C3 80,764 214,6395 133,8755 139,7 5,8245 33,92480025 4 C6 94,7762 214,6395 119,8633 127,8 7,9367 62,99120689 5 C7 66,1712 214,6395 148,4683 15,3 -133,1683 17733,79612 6 C8 122,1381 214,6395 92,5014 102,4 9,8986 97,98228196 7 C9 63,3883 214,6395 151,2512 155,9 4,6488 21,61134144 8 C11 66,1791 214,6395 148,4604 158 9,5396 91,00396816 9 C12 111,6847 214,6395 102,9548 112,6 9,6452 93,02988304 10 C13 63,2404 214,6395 151,3991 156,4 5,0009 25,00900081 11 C14 120,3758 214,6395 94,2637 105,7 11,4363 130,7889577 12 C15 58,2279 214,6395 156,4116 161,5 5,0884 25,89181456 13 C16 117,8628 214,6395 96,7767 103,8 7,0233 49,32674289 14 C18 144,8531 214,6395 69,7864 79,1 9,3136 86,74314496 15 C19 102,8686 214,6395 111,7709 127 15,2291 231,9254868 16 C20 102,5408 214,6395 112,0987 115,2 3,1013 9,61806169 17 C21 18,3116 214,6395 196,3279 198,8 2,4721 6,11127841 18 C22 86,1239 214,6395 128,5156 140,3 11,7844 138,8720834 19 C25 87,9058 214,6395 126,7337 132,3 5,5663 30,98369569 20 C26 97,1102 214,6395 117,5293 128,2 10,6707 113,8638385 21 C27 89,6153 214,6395 125,0242 128,2 3,1758 10,08570564 22 C28 186,7513 214,6395 27,8882 27,4 -0,4882 0,23833924 23 C29 187,1862 214,6395 27,4533 27,4 -0,0533 0,00284089 TOTAL 19101,66071 24 H pd C12 28,0713 33,8329 5,7616 5,88 0,1184 0,01401856 25 H pd C19 28,4167 33,8329 5,4162 5,42 0,0038 1,444E-05 26 H pd C20 26,4624 33,8329 7,3705 6,64 -0,7305 0,53363025 27 H pd C28 32,2199 33,8329 1,613 0,98 -0,633 0,400689 28 H pd C28 32,9461 33,8329 0,8868 0,98 0,0932 0,00868624 29 H pd C28 32,5424 33,8329 1,2905 0,98 -0,3105 0,09641025 30 H pd C29 32,739 33,8329 1,0939 0,98 -0,1139 0,01297321 31 H pd C29 32,9651 33,8329 0,8678 0,98 0,1122 0,01258884 32 H pd C29 32,3167 33,8329 1,5162 0,98 -0,5362 0,28751044 33 OH pd C9 22,9247 33,8329 10,9082 12,46 1,5518 2,40808324 TOTAL 3,77460447 Keterangan: δ = pergeseran kimia (ppm)
EKSP. = data percobaan pergeseran kimia kalanon
Kesimpulan
Himpunan basis yang dapat digunakan untuk menghitung senyawa Kalanon dan turunannya adalah himpunan basis STO-3G.
Ucapan Terimakasih
Ucapan terimakasih ditujukan kepada Kementerian Negara Riset dan Teknologi melalui Program Insentif Riset Dasar, dan Austria – Indonesia Center for Computational Chemistry (AIC), Jurusan Kimia FMIPA Universitas Gadjah Mada.
Daftar Pustaka
Chasani, M. 2002. Sintesis senyawa turunan Kalanon dan uji aktivitas biologinya. Tesis Magister. Universitas Indonesia. Jakarta.
Foresman, J. B. and Ællen Frisch. 1996. Exploring chemistry with electronic structure methods. 2nd ed. Gaussian, Inc., Pittsburgh.
Harjono. 2006. Kajian hubungan kuantitatif struktur-aktivitas (HKSA/QSAR) senyawa kalanon dan turunannya sebagai antileukemia dengan pendekatan PCR (Principal Component Regression). Skripsi. Universitas Jenderal Soedirman.
Iswanto, P. dan Heny Ekowati. 2005. Pemodelan senyawa fluorokuinolon baru sebagai zat antibakteri E. Coli. Mandala of Health: Scientific Journal. Fakultas Kedokteran Universitas Jenderal Soedirman.
Iswanto, P., Moch. Chasani, dan Eva Vaulina. 2007. Sintesis senyawa turunan Kalanon sebagai zat antileukemia dengan pendekatan QSAR (Quantitative Structure- Activity Relationship). Laporan Penelitian. MENRISTEK RI. Jakarta.
Pranowo, H. D. 2001. Kimia komputasi. Austria-Indonesia Center for Computational Chemistry. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.
Tahir, I., K. Wijaya, B. Purwono, dan D. Widianingsih. 2003. Analisis QSAR Turunan Flavon/Flavonol sebagai Senyawa Antiradikal Berdasarkan Analisis Hansch. Indo.J.Chem. 3(1). 48-54.
KARAKTERISASI ENZIM KITINOLITIK Escherichia coli-inactive KPU 2.1.8 DARI LIMBAH PENGOLAHAN UDANG
Miftahul Ilmi1*, Ekowati Chasanah2, Wibowo Mangunwardoyo3
1
Fakultas Biologi UGM
2Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi, DKP RI 3
Departemen Biologi, FMIPA UI
*
Korespondensi ke email [email protected]
Abstract
Applications of chitinolytic enzyme have been carried out in recent years. Information of the enzyme is important for industrial applications. The purpose of this study was to investigate the effect of pH, temperature, and metal ions to the activity of chitinolytic enzyme from E. coli-inactive KPU 2.1.8. Thermostability of the enzyme was also determined by incubating the enzyme at various temperature and the residual activity was assayed. The optimal pH of the chitinolytic enzyme from strain KPU 2.1.8 ranged from 4 – 8, and the optimal temperature ranged from 40 – 55 oC. The enzyme was able to maintain its residual activity above 50% for six hours at 40 oC, for four hours at 45 oC, and for one hour at 50 oC. The enzyme lost its activity after one hour incubation at 55 oC. Fe2+ increased the enzyme activity by 12.1% and 17% at 1 mM and 5 mM concentration, while Zn2+, Ca2+, and Mn2+ increased enzyme activity by 17.8, 11, and 14.7% at 5 mM concentration. Cu2+ decreased enzyme activity by 25.3% and 43.6% at 1 mM and 5 mM concentration, while EDTA decreased enzyme activity by 59.1% at 5 mM concentration. Further study to purify and determine further characteristics of chitinolytic enzymes from strain KPU 2.1.8 was suggested.
Keywords: Chitinolytic Enzyme, Colloidal Chitin, Escherichia Coli-Inactive, Metal Ions, Ph, Stability, Temperature
Pendahuluan
Enzim kitinolitik adalah enzim yang mampu menghidrolisis ikatan β-1,4-glikosida pada rantai polimer kitin menjadi oligomer atau monomer (Fukamizo, 2000). Enzim kitinolitik dihasilkan oleh berbagai organisme, antara lain bakteri, fungi, protozoa, invertebrata, serta beberapa tumbuhan dan vertebrata (Patil et al., 2000). Menurut Bade and Hickey (1989) Gooday (1990), dan Gohel et al. (2006), Nomenclature Commitee of International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) membagi kelompok
enzim kitinolitik menjadi dua, yaitu enzim 1,4-β-poli-N-asetilglukosaminidase (EC 3.2.1.14) yang juga disebut endokitinase; dan enzim β-N-asetilheksosaminidase (EC 3.2.1.52) yang juga disebut enzim eksokitinase. Enzim endokitinase menghidrolisis secara acak ikatan β-1,4-glikosida pada rantai kitin dan menghasilkan diasetilkitobiosa, sedangkan enzim eksokitinase menghidrolisis ikatan β-1,4-glikosida gula non-pereduksi pada diasetilkitobiosa dan menghasilkan N-asetilglukosamin. Henrisatt dan Bairoch membagi enzim kitinolitik menjadi dua berdasarkan struktur proteinnya, yaitu enzim kitinolitik Famili 18 yang umumnya dihasilkan oleh bakteri, dan enzim kitinolitik Famili 19 yang umumnya dihasilkan oleh tumbuhan (Fukamizo, 2000; Patil et al., 2000).
Enzim kitinolitik dari bakteri telah banyak diaplikasikan, antara lain sebagai agen biokontrol terhadap fungi dan serangga (Chernin et al., 1995; Patil et al., 2000; Chien-Jui Huang et. al., 2005), serta pembuatan oligomer kitin dari polimer kitin dan pembuatan protein sel tunggal dari khamir (Patil et al., 2000; Sørbotten et al., 2005). Informasi karakteristik enzim, antara lain pengaruh suhu, pH, dan ion logam, diperlukan dalam aplikasi enzim tersebut (Reed, 1975).
Penelitian sebelumnya telah berhasil mengisolasi strain Escherichia coli-inactive KPU 2.1.8 dari limbah pengolahan udang, namun karakteristik enzim kitinolitik yang dihasilkan strain tersebut belum diketahui. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui pengaruh suhu, pH, dan ion logam terhadap aktivitas enzim kitinolitik dari strain E. coli-inactive KPU 2.1.8 asal limbah pengolahan udang.
Bahan dan Cara Kerja Mikroorganisme
Isolat Escherichia coli-inactive KPU 2.1.8 merupakan hasil isolasi dan skrining bakteri kitinolitik dari limbah pengolahan udang yang telah dioptimasi produksi enzim kitinolitiknya.
Medium kitin
Medium kitin cair dibuat berdasarkan Nasran et al. (2003). Komposisi medium kitin cair adalah sebagai berikut: K2HPO4 0,1% (b/v), MgSO4.7H2O 0,01% (b/v), NaCl
Produksi dan preparasi enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 218
Starter produksi dibuat dengan menginkubasi 50 ml medium kitin cair yang telah diinokulasikan dengan 5 ml suspensi sel bakteri E. coli-inactive KPU 218 berumur 24 jam (A600 = 1,138 ± 0,245) dalam Erlenmeyer 125 ml selama 16 jam pada suhu 25 oC dan pH 5
dengan agitasi 100 rpm. Sebanyak 30 ml starter dimasukkan ke dalam 300 ml medium kitin cair dalam Erlenmeyer 500 ml pada suhu 25 oC dan pH 5 dengan agitasi 100 rpm diinkubasi selama 30 jam. Sel dan supernatan dipisahkan dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 6.000x g selama 10 menit. Supernatan dipekatkan hingga tiga kali lipat konsentrasi awal menggunakan ultrafiltrasi UFP-10-C-3MA (10 kDa).
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 ditentukan dengan menguji aktivitas enzim menggunakan bufer fosfat-sitrat 0,2 M (pH 4, 5, 6), bufer fosfat 0,1 M (pH 6, 7, 8), dan bufer borat 0,2 M (pH 8, 9, 10) pada suhu 30 oC. Aktivitas enzim diuji menggunakan reagen Schales menurut Nasran et al. (2003), sedangkan konsentrasi protein diuji menggunakan metode Lowry (Bollag and Edelstein, 1991).
Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8
Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 ditentukan dengan menguji aktivitas enzim pada suhu inkubasi 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, dan 70 oC pada pH aktivitas optimal. Ketahanan enzim terhadap suhu diuji dengan memaparkan enzim pada suhu 40, 45, 50, dan 55 oC selama tujuh jam. Setiap jam enzim tersebut diuji aktivitasnya pada kondisi optimum. Aktivitas enzim diuji menggunakan reagen Schales menurut Nasran et al. (2003), sedangkan konsentrasi protein diuji menggunakan metode Lowry (Bollag and Edelstein, 1991).
Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 218
Ion logam yang digunakan dalam pengujian adalah Mg2+, Ca2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Ba2+, Mn2+, dan EDTA. Pengaruh ion logam diuji dengan menguji aktivitas enzim pada suhu dan pH aktivitas optimum menggunakan substrat yang telah ditambahi ion-ion logam tersebut dalam bentuk garam klorida dengan konsentrasi akhir 1 mM dan 5 mM. Aktivitas enzim diuji menggunakan reagen Schales menurut Nasran et al. (2003)
Hasil dan Pembahasan
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8
Hasil karakteristik pH menunjukkan aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 memiliki rentang pH optimum yang luas, yaitu antara 5 hingga 8 (Gambar 1.). Penelitian-penelitian sebelumnya menunjukkan enzim kitinolitik dari bakteri memiliki rentang pH optimum yang sempit, antara lain enzim kitinase yang dihasilkan Vibrio sp. 98J11027 (pH optimum 6) (Shin Hye Park et al., 2000), Enterobacter sp. NRG4 (pH optimum 5,5) (Dahiya et al., 2005), Enterobacter aglomerans (pH optimum 6,5) (Chernin et al., 1995), Stentrophomonas maltophila C3 (pH optimum 6) (Zhang et al., 2001), dan Pseudomonas aeruginosa (pH optimum 4,5 – 5) (Folders et al., 2001).
Luasnya rentang pH optimum enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 diduga disebabkan adanya perlindungan dari substrat saat reaksi katalitik terjadi. Menurut Fukamizo (2000) dan van Aalten et al. (2001), pengikatan kitin dengan enzim kitinolitik dapat menyebabkan perubahan konformasi enzim. Perubahan tersebut dapat meningkatkan ketahanan enzim terhadap denaturasi oleh pH (Segel, 1975).
Aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 menurun pada pH 4 dan 10 diduga karena struktur enzim mengalami denaturasi. Creighton (1993) menyatakan bahwa denaturasi enzim umumnya terjadi pada pH di bawah 5 dan di atas 10. Denaturasi tersebut disebabkan dua hal, yaitu: (i) terionisasinya asam-asam amino penyusun struktur enzim yang awalnya berada dalam kondisi tidak terionisasi, sehingga terjadi ketidakstabilan elektrostatik pada struktur enzim; (ii) rusaknya ikatan ionik penghubung dua asam amino yang terionisasi karena salah satu asam amino tidak lagi terionisasi.
0,00 0,50 1,00 1,50 4 5 6 7 8 9 10 pH A k ti v ita s S p e s if ik (U /m g )
Bufer Phosphat sitrat Bufer Phosphat Bufer Borat 0,10 ± 0,04 1,04 ± 0,07 1,05 ± 0,02 1,03 ± 0,001 1,03 ± 0,01 1,09 ± 0,04 1,01 ± 0,004 0,91 ± 0,004 0,73 ± 0,004
Gambar 1. Aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 pada berbagai pH.
Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8
Hasil karakteristik suhu aktivitas menunjukkan enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 memiliki suhu optimum 40 hingga 55 oC (Gambar 2.). Hasil pengujian ketahanan terhadap suhu menunjukkan enzim tersebut mampu mempertahankan aktivitas residu di atas 50% saat terpapar suhu 40 oC selama enam jam, suhu 45 oC selama empat jam, dan suhu 50 oC selama satu jam. Enzim kehilangan aktivitas setelah pemaparan pada suhu 55 oC selama satu jam (Gambar 3.).
Suhu optimum enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 berada pada rentang 40 – 55 oC. Hasil tersebut sesuai dengan hasil penelitian lain yang menunjukkan bahwa enzim kitinolitik umumnya memiliki suhu optimum di atas 40 oC, antara lain enzim kitinase Vibrio sp. 98CJ11027 (45 oC) (Shin Hye Park et al., 2000), Enterobacter sp. NRG4 (45 oC) (Dahiya et al., 2005), Enterobacter aglomerans (40 oC) (Chernin et al., 1995), Stentrophomonas maltophila C3 (50 oC) (Zhang et al., 2001), dan Pseudomonas aeruginosa (50 oC) (Folders et al., 2001).
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Suhu (0C) Akt iv it a s sp esi fi k (U /m g ) 0,3 ± 0,05 0,42 ± 0,07 0,54 ± 0,02 0,6 ± 0,02 0,81 ± 0,01 0,96 ± 0,04 1,05 ± 0,01 1,07 ± 0,04 1,08 ± 0,08 1,04 ± 0,06 0,68 ± 0,00 0,38 ± 0,01 0,14 ± 0,01
Gambar 2. Aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 pada berbagai suhu.
Pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 memperlihatkan aktivitas enzim meningkat sejalan dengan peningkatan suhu dari 10 – 40 oC. Energi aktivasi pada suhu 10 oC diperkirakan telah tercapai karena aktivitas enzim dapat diukur pada suhu tersebut. Apabila energi aktivasi belum tercapai, maka tidak akan ada aktivitas karena komplek enzim-substrat tidak terbentuk (Segel, 1975; Perez and Tutor, 1998). Aktivitas yang rendah pada suhu 10 oC disebabkan belum tercapainya energi kinetik yang memungkinkan frekuensi tumbukan optimum antara enzim dengan substrat (Segel, 1975).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 4 5 6 7 Waktu (jam) Ak ti vi tas r e si d u (% ) 40 oC 45 oC 50 oC 55 oC
Gambar 3. Aktivitas residu enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 setelah pemaparan dengan berbagai suhu selama tujuh jam.
Aktivitas enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 mencapai optimum pada suhu 40 oC dan bertahan hingga suhu 55 oC. Pada rentang suhu tersebut diperkirakan terjadi frekuensi tumbukan optimum, namun karena konsentrasi substrat dan enzim tetap maka frekuensi tersebut tidak meningkat sehingga aktivitas enzim juga tidak meningkat. Menurut Segel (1975), selain dipengaruhi oleh energi kinetik, frekuensi tumbukan antara substrat dengan enzim juga dipengaruhi oleh konsentrasi reaktan.
Aktivitas stabil enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8 pada suhu 40 – 55 oC disebabkan enzim tersebut mampu menjaga keseimbangan antara rigiditas dengan fleksibilitas konformasi sehingga sisi aktif dapat merubah bentuk untuk berlekatan dengan substrat dan melakukan aktivitas katalitiknya (D’Amico et al., 2003; Zoldak et al., 2003). Keseimbangan antara rigiditas dan fleksibilitas konformasi tersebut dapat diganggu oleh kenaikan suhu lingkungan (Fields et al., 2001). Substrat koloidal kitin diperkirakan memegang peranan penting dalam menjaga kestabilan enzim kitinolitik E. coli-inactive KPU 2.1.8. Ikatan antara substrat dan enzim akan memperkuat struktur enzim, selain itu substrat juga menyerap energi dari lingkungan sehingga melindungi enzim dari kelebihan