4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pembuatan Sampel Uji CCCNS 1 Suhu Pemanasan
4.2.3 Kuantitas Streptococcus mutans
Perhitungan kuantifikasi bakteri menggunakan teknik qRT-PCR dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu metode absolut dan relatif (Yoshida et al.
2003). Pada penelitian ini analisis akan dilakukan dengan menggunakan kedua metode tersebut, hal ini dikarenakan pada analisis dengan menggunakan metode absolut hanya dapat diketahui kuantitas S.mutans dalam saliva tanpa dipengaruhi oleh jumlah total bakteri yang dihitung dalam Log CFU/mL, sedangkan pada analisis dengan metode relatif dapat diketahui nilai proporsi S.mutans yang dipengaruhi oleh total bakteri antar perlakuan terhadap kontrol.
4.2.3.1 Kuantitas S.mutans dengan Metode Absolut
Metode absolut digunakan untuk menentukan jumlah penggandaan sampel yang dimasukkan dengan cara membandingkan sinyal PCR terhadap suatu kurva standar (Pfaffl, 2004). Kurva standar S.mutans terdapat pada Gambar 9.
Gambar 9. Kurva standar S.mutans
Kuantifikasi terhadap S. mutans dilakukan dengan cara mengamati nilai CT yang merupakan data output dari teknik qRT-PCR. Sumbu X menunjukkan nilai CT yang diperoleh dari hasil amplifikasi dan sumbu Y menunjukkan jumlah bakteri dalam bentuk Log CFU/mL. Nilai CT ditentukan sebagai siklus saat perpendaran mulai terdeteksi diatas background dan secara proporsional berbanding terbalik dengan logaritma jumlah molekul DNA awal (Shemesh et al. 2007). Nilai CT yang diperoleh dari hasil amplifikasi setiap perlakuan kemudian dimasukkan kedalam persamaan yang diperoleh dari kurva standar untuk mengetahui jumlah bakteri dari setiap perlakuan. Kuantitas S.mutans tiap perlakuan terhadap kontrol terdapat pada Gambar. 10.
Seperti halnya telah dibahas pada sub-bab sebelumnya, hasil pengujian kuantitas bakteri saliva dengan metode absolut menunjukkan adanya perbedaan nyata antara saliva kontrol dan saliva yang tidak distimulasi. Terjadi peningkatan jumlah S.mutans pada saliva yang tidak distimulasi dibandingkan saliva kontrol. Hal tersebut dikarenakan rentang waktu pengambilan sampel saliva kontrol dan tidak distimulasi adalah 3 jam, yang dimana pada rentang tersebut dimungkinkan telah tumbuhnya bakteri. Menurut Kidd (2004), 0-4 jam pertama bakteri
streptocooci tunggal sebagai koloni awal, telah membentuk koloni pada pelikel yang terbentuk pada permukaan gigi.
y = -0.4025x + 13.987 R² = 0.9714 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 5 10 15 20 25 30 35 Lo g 1 0 CF U /ml Cт Mean
. Gambar 10. Kuantitas S.mutans saliva tidak distimulasi dan distimulasi oleh
cajuputs chewy candy non-sukrosa formula 1 dan formula 2 dengan konsentrasi cajuputs oil flavor x % ( ) dan x + 0.36 % ( ) yang dibandingkan terhadap kontrol
Saliva kontrol yang digunakan pada penelitian ini adalah saliva yang diambil 30 menit setelah menyikat gigi. Menyikat gigi merupakan mekanisme pembersihan plak, remineralisasi gigi, dan pembersihan mikroba di dalam mulut. Hal tersebut dikarenakan pada pasta gigi yang digunakan subjek penelitian untuk menyikat gigi mengandung senyawa fluorida. Cetylpyridinium chloride, chlorhexidine, amina fluoride merupakan senyawa kimia yang biasa digunakan untuk pencegahan dan pengobatan penyakit mulut karena mengandung agen antibakteri (Knoll dan Stiebel, 2002). Fluorida akan masuk ke bakteri dan berakumulasi dalam sel, sehingga menyebabkan transport hidrogen fluorida dan ion fosfor. Fluorida akan meningkatkan permeabilitas sel dan memungkinkan proses difusi keluar bakteri, sehingga mengganggu pelekatan bakteri dan menurunkan sifat asidogenik bakteri (Shashibusan et al., 2008). Sama halnya dengan CCCNS yang memiliki kandungan senyawa antimikroba namun berasal dari minyak kayu putih dan peppermint, sehingga diharapkan stimulasi dengan CCCNS dapat menurunkan jumlah S.mutans penyebab karies gigi seperti halnya pada menyikat gigi.
Pada Gambar 10 saliva yang distimulasi dengan CCCNSformula 1 dengan konsentrasi cajuput oil flavor x % menunjukkan penurunan jumlah S.mutans dari saliva yang tidak distimulasi, namun masih memiliki perbedaan yang nyata dengan saliva kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa stimulasi oleh CCCNS formula 1 dengan konsentrasi FCO x % mampu menurunkan jumlah S.mutans tetapi belum mampu menurunkan hingga mendekati nilai saliva kontrol. Berbeda dengan CCCNSformula 2 dengan konsentrasi cajuput oilflavor x + 0.36 % yang dimana menunjukkan jumlah S.mutans tidak berbeda nyata dengan kontrol, namun berbeda nyata dengan saliva yang tidak distimulasi. Hal ini membuktikan bahwa stimulasi oleh CCCNS formula 2 dengan konsentrasi FCO x + 0.36 % telah mampu menurunkan jumlah S.mutans hingga mendekati nilai kontrol. Sampel CCCNS formula 1 dan formula 2 mengandung minyak kayu putih dan peppermint yang
100 138 124 100 148 114 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Kontrol tanpa Stimulasi dengan Stimulasi
S. m u ta n s per lak ua n ter ha da p K o ntr o l (%) Perlakuan a c a c b ab
memiliki senyawa aktif antimikroba, namun sampel CCCNS formula 2 memiliki konsentrasi FCO yang lebih tinggi dibandingkan CCCNS formula 1, sehingga senyawa aktif antimikroba yang terkandung dalam CCCNS formula 2 juga semakin besar memberikan paparan terhadap S.mutans. Menurut Reichling et al. (2009), komponen 1.8-sineol dari minyak kayu putih, mentol, dan menton dari minyak
peppermint memiliki sifat hidrofobik yang mampu meningkatkan permeabilitas membran sitoplasma, menghambat respirasi sel, mengganggu pembentukan protein pengikat membran dan mengganggu proses transportasi ion yang akhirnya dapat menyebabkan kematian sel.
Pada penelitian ini CCCNS mampu menurunkan jumlah S.mutans yang merupakan bakteri gram positif. Pada penelitian Sari (2013), juga menunjukkan CCS dan CCNS mampu menghambat biofilm multispesies S. sanguinis dan
S.mutans. Kedua bakteri tersebut merupakan bakteri gram positif. Pada penelitian Soeharso (2014) menunjukkan konsumsi CCS dan CCNS dapat menurunkan jumlah S.mutans dan total bakteri pada plak manusia. Pada penelitian Rachmatillah
et al. (2014), CCS dapat menghambat viabilitas khamir Candida albicans. Berdasarkan penelitian-penelitian tersebut diduga mikroba yang dapat dihambat oleh stimulasi CCS, CCNS, dan CCCNS adalah bakteri gram positif dan khamir
Candida albicans. CCS, CCNS, dan CCCNS mampu menghambat S.mutans
disebabkan adanya komponen α-terpineol dan -terpinen yang dapatmenyebabkan kebocoran membran luar bakteri gram positif yang akhirnya menyebabkan kematian sel (Oyedemi et al., 2009).Bakteri gram positif diketahui lebih rentan terhadap minyak esensial dibandingkan bakteri gram negatif (Farag et al, 1989;. Smith-Palmer et al., 1998). Aktivitas antibakteri terhadap bakteri gram negatif yang lemah disebabkan karena adanya membran luar, yang dimana memiliki rantai polisakarida hidrofilik sebagai pertahanan terhadap minyak esensial yang bersifat hidrofobik (Mann et al., 2000;. Tassou dan Nychas, 1995).
4.2.3.2 Proporsi S.mutans terhadap Kontrol (Metode Relatif)
Perhitungan proporsi S.mutans pada saliva yang tidak distimulasi dan distimulasi terhadap kontrol dilakukan menggunakan metode relatif. Metode relatif mengaitkan sinyal PCR dari transkripsi target pada suatu kelompok perlakuan dengan transkripsi kelompok lain yang tidak diberikan perlakuan (Lifetechnologies, 2012). Pada metode relatif, proporsi S.mutans terhadap kontrol dipengaruhi oleh jumlah total bakteri. Kuantitas total bakteri diperoleh dari hasil interpolasi sinyal PCR terhadap kurva standar total bakteri. Kurva standar total bakteri terdapat pada Gambar 11. Proporsi S.mutans pada saliva yang tidak distimulasi dan distimulasi oleh CCCNS terhadap kontrol terdapat pada Tabel 7.
Hasil pengujian proporsi S.mutans dengan menggunakan metode relatif menunjukkan saliva yang tidak distimulasi mengalami kelipatan relatif sebesar 1.12 - 1.35 kali lipat dari kontrol. Pada saliva yang distimulasi dengan CCCNS formula 1 mengalami penurunan sebesar 0.95 kali lipat dari kontrol. Pada saliva yang distimulasi dengan CCCNS formula 2 mengalami penurunan sebesar 0.77 kali lipat dari kontrol. Hal ini menunjukkan stimulasi CCCNS formula 1 maupun 2 dapat menurunkan proporsi S.mutans dalam saliva. Menurut Livak dan Schmittgen (2008), perubahan berupa penurunan proporsi suatu gen target ditunjukkan dengan nilai kelipatan relatif (N) dibawah 1 (N < 1). Namun stimulasi CCCNS formula 2
mengalami penurunan proporsi yang lebih besar dibandingkan formula 1. Hal tersebut dikarenakan CCCNS formula 2 memiliki kons.flavor cajuput oil yang lebih besar, yaitu x + 0.36 %. Tingginya konsentrasi FCO pada CCCNS formula 2 menyebabkan peningkatan flow rate saliva yang lebih besar akibat rangsangan
flavor, peningkatan pH yang lebih besar akibat terjadinya peningkatan ion bikarbonat, dan peningkatan paparan senyawa aktif antimikroba yang lebih besar pula terhadap S.mutans. Hal tersebutlah yang diduga menyebabkan penurunan proporsi S.mutans.
Gambar 11. Kurva Standar Total Bakteri
Tabel 7. Proporsi S.mutans pada saliva yang tidak distimulasi dan distimulasi oleh cajuput chewy candy non-sukrosa formula 1 dan formula 2 dengan cajuputs oil flavor x % dan x + 0.36 % terhadap kontrol
Sampel Kontrol Tanpa Stimulasi Dengan Stimulasi p-value CCCNS formula 1 1.00±0.00 1.12±0.91 0.95±2.68 0.535 CCCNS formula 2 1.00±0.00 1.35±1.89 0.77±1.32 0.461 Ket: Perbedaan notasi pada baris yang sama menunjukkan sampel berbeda nyata pada taraf kepercayaan 95% (α = 0.05)