y = 0,062ln(x) + 0,101 R² = 0,994 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0 10 20 30 40 50 L ua s Z o na B ening ( cm 2 ) Aktivitas (mU)
0 20 40 60 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Ak tiv it a s re la tif (%) % Amonium sulfat Supernatant Pelet y = -1,311x + 5,460 R² = 0,960 0 1 2 3 4 5 6 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 lo g B M Rf (cm)
y = 0,339x + 4,461 R² = 0,990 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7 pH Ak tua l Titik Potong
Kurva Standar pI
RINGKASAN
DIANA NUR AFIFAH. Protease Fibrinolitik dari Mikroba Pangan Fermentasi Oncom Merah dan Tempe Gembus. Dibimbing oleh MAGGY T. SUHARTONO, DAHRUL SYAH, dan YANTI.
Penyakit kardiovaskuler seperti penyakit jantung, tekanan darah tinggi, dan stroke adalah penyebab utama kematian di dunia, termasuk Indonesia. Dasar patofisiologi proses infark miokardial dan stroke adalah pembentukan bekuan fibrin atau trombus yang melekat pada dinding pembuluh darah yang terluka. Fibrin merupakan komponen protein utama dari pembekuan darah, yang terbentuk dari fibrinogen oleh trombin.
Enzim fibrinolitik dari mikroba pangan telah menarik perhatian untuk diteliti lebih jauh sebagai agen trombolitik. Genus Bacillus dari pangan fermentasi dapat menghasilkan enzim fibrinolitik kuat, seperti Bacillus natto dari natto, pangan fermentasi kedelai asal Jepang yang menghasilkan nattokinase (NK). Beberapa genus Bacillus lainnya dari berbagai pangan fermentasi juga telah ditemukan mampu menghasilkan enzim fibrinolitik kuat. Diantaranya adalah B. amyloliquefaciens DC-4 dari douchi, pangan fermentasi kedelai dari Cina,
Bacillus sp. CK dari chungkookjang, saus kedelai fermentasi dari Korea, Bacillus sp. strains DJ-2 dan DJ-4 dari doenjang, Korea, dan Bacillus sp. KA38 dari
jeotgal, ikan asin fermentasi dari Korea.
Penelitian ini berhasil mengisolasi bakteri penghasil protease fibrinolitik dari pangan fermentasi Indonesia, oncom merah dan tempe gembus. Empat puluh tiga isolat menunjukkan aktivitas proteolitik pada media skim milk agar (SMA), dan 38 diantaranya menunjukkan aktivitas fibrinolitik baik berdasarkan uji cakram fibrin maupun zimogram dengan substrat fibrinogen. Dua isolat terbaik, yaitu RO3 dari oncom merah dan 2.g dari tempe gembus, dipilih untuk diidentifikasi menggunakan kit API 50 CHB dan analisis 16S rRNA. Hasil uji biokimia menggunakan kit API 50 CHB khusus untuk Bacillus spp, menunjukkan bahwa isolat RO3 teridentifikasi sebagai B. licheniformis (99,9%) dan isolat 2.g sebagai
B. pumilus (99,7%). Identifikasi molekuler berdasarkan gen 16S rRNA telah dilakukan dan isolat RO3 teridentifikasi sebagai B. licheniformis (96%) dan isolat 2.g sebagai B. pumilus (97%). Urutan nukleotida telah didaftarkan di GenBank
dengan nomor akses AB968524 untuk isolat RO3 dan AB968523 untuk isolat 2.g. Tingginya biaya produksi enzim merupakan salah satu hambatan untuk keberhasilan penerapan enzim dalam industri. Pemilihan media merupakan faktor penting untuk produksi enzim. Bacillus licheniformis RO3 ditumbuhkan pada tiga jenis media yang berbeda, yaitu Luria-Bertani broth (LB), ½ LB + susu skim 1% (b/v) (LBS), dan ½ LB + tepung oncom merah 1% (b/v) (LBO). Dalam media LB, B. licheniformis RO3 mampu menghasilkan protease dengan aktivitas tertinggi 0,024 U/ml atau 0,157 U/mg pada jam ke-36. Dalam media LBS, aktivitas tertinggi 0,022 U/ml atau 0,152 U/mg tercapai pada jam ke-48. Hasil terbaik ditunjukkan pada B. licheniformis RO3 yang ditumbuhkan pada media LBO dengan aktivitas protease tertinggi 0,051 U/ml atau 0,283 U/mg setelah 48 jam fermentasi. Hasil ini menunjukkan bahwa tepung oncom merah dapat digunakan sebagai media yang baik untuk produksi protease fibrinogenolitik.
Protease fibrinogenolitik kasar yang dihasilkan dari B. licheniformis RO3 dengan media produksi LBO memiliki pH optimum 8 dan suhu optimum 60oC.
Bacillus pumilus 2.g menghasilkan beberapa fraksi protease yang memiliki aktivitas fibrinolitik kuat. Enzim fibrinolitik dengan berat molekul 20 kDa telah dimurnikan dari supernatan kultur B. pumilus 2.g dengan tahapan pengendapan amonium sulfat 80%, kromatografi penukar ion menggunakan matriks CM-
Sephadex C-50, dan kromatografi hidrofobik menggunakan matriks Phenyl Sepharose 6-FF. Kemurnian enzim meningkat 16 kali lipat dengan yield 25% pada tahap akhir pemurnian. Enzim fibrinolitik murni stabil antara pH 5 hingga pH 9 dan suhu kurang dari 60℃. Aktivitas fibrinolitik meningkat dengan adanya 5 mM MgCl2 dan 5 mM CaCl2 tetapi dihambat oleh 1 mM PMSF, 1 mM SDS, dan
1 mM EDTA. Enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g mampu menghidrolisis substrat sintetik N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, substrat untuk subtilisin dan kimotripsin, secara efisien. Hasil ini menunjukkan bahwa enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus 2.g termasuk dalam golongan protease serin kelompok subtilisin. Enzim fibrinolitik murni dari B. pumilus β.g dapat mendegradasi rantai α dan β
dari fibrinogen dengan cepat tetapi tidak dapat mendegradasi rantai .
Bacillus licheniformis RO3 dan B. pumilus 2.g menghasilkan beberapa protease ekstraseluler. Dari tiga fraksi protease ekstraseluler B. licheniformis RO3 yang dipisahkan menggunakan elektroforesis 2D dan identifikasi menggunakan MALDI-TOF-MS, diperoleh satu fraksi dengan BM 48 kDa dan pI 4.80 yang memiliki kemiripan dengan bacillopeptidase F dari B. licheniformis DSM 13 dengan skor protein 27. Tiga fraksi dari B. pumilus 2.g yang dipisahkan menggunakan SDS-PAGE dan identifikasi menggunakan MALDI-TOF-MS, dengan BM masing-masing 23, 20, dan 15 kDa juga hanya memiliki kemiripan dengan protein database dengan skor protein ≤ 74. Kemungkinan beberapa fraksi protein tersebut adalah baru atau belum pernah dilaporkan sebelumnya.
Kata kunci: protease fibrinolitik, oncom merah, tempe gembus, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus
SUMMARY
DIANA NUR AFIFAH. Fibrinolytic protease from fermented food red oncom and
tempeh gembus microorganisms. Supervised by MAGGY T. SUHARTONO, DAHRUL SYAH, and YANTI.
Cardiovascular diseases such as heart disease, high blood pressure, and stroke are the leading cause of death in the world, including Indonesia. Basic pathophysiology of myocardial infarction and stroke is the formation of fibrin clot or thrombus attached to an injured blood vessel walls. Fibrin is the major protein component of blood clots, which are formed from fibrinogen by thrombin.
Fibrinolytic enzyme from food microbes has attracted attention for thrombolytic agent. The genus Bacillus from fermented food can produce a strong fibrinolytic enzyme, such as Bacillus natto from natto, a fermented soy food from Japan that produce nattokinase (NK). The other Bacillus from various fermented food are B. amyloliquefaciens DC-4 from douchi, fermented soy food from China,
Bacillus sp. CK from chungkookjang, soy sauce fermentation of Korea, Bacillus
sp. DJ-2 strains and DJ-4 from doenjang, Korea, and Bacillus sp. KA38 from
jeotgal, fermented salted fish from Korea.
This study was able to isolate bacteria producing fibrinolytic proteases from Indonesian fermented food, red oncom and tempeh gembus. Forthy-three isolates showed proteolytic activities on skim milk agar, while thirthy-eight of them showed fibrinolytic activities both on fibrin plate and fibrinogen zymography. Two isolates, i.e. RO3 from red oncom and 2.g from tempeh gembus, were selected and identified using API CHB kit and 16S rRNA. The results of biochemical tests using API 50 CHB kit specifically for Bacillus spp, revealed that isolate RO3 was identified as B. licheniformis (99.9%) and isolate 2.g as B. pumilus (99.7%). Molecular identification based on 16SrRNAs gene was performed and isolate RO3 was confirmed as B. licheniformis (96%) and isolate 2.g was confirmed as B. pumilus (97%). The nucleotide sequences were deposited at GenBank with accession number AB968524 for isolate RO3 and AB968523 for isolate 2.g.
The high cost of enzyme production is one of the barriers to successful application of enzyme in the industry. Selection of media is a critical factor for the enzyme production. Bacillus licheniformis RO3 was screened from red oncom, an Indonesian fermented food. Three types of media were analyzed, i.e. Luria-bertani broth (LB), ½ LB + 1% skim milk (LBS), and ½ LB + 1% red oncom powder (LBO). In LB media, B. licheniformis RO3 was able to produce protease with activity of 0.024 U/ml or 0.157 U/mg at 36 h fermentation. In LBS media, the highest activity was 0.022 U/ml or 0.152 U/mg at 48 h fermentation. The best result was shown when B. licheniformis RO3 was grown on LBO media with the highest protease activity was 0.051 U/ml or 0.283 U/mg at 48 h. These results indicate that red oncom flour can be used as a good media for fibrinogenolytic protease production. Crude fibrinogenolytic protease enzyme from B. licheniformis RO3 had an optimum pH and temperature at 8.0 and 60°C.
Bacillus pumilus 2.g secretes several proteases that have strong fibrinolytic activities. A fibrinolytic enzyme with an apparent molecular weight of 20 kDa was purified from the culture supernatant of B. pumilus 2.g by sequential
application of ammonium sulfate precipitation 80%, ion-exchange chromatography by using CM-Sephadex C-50, and hydrophobic chromatography by using Phenyl-Sepharose 6-FF. After Phenyl-Sepharose chromatography step, the final purification fold was 16.0, and the yield was 25%. The partially purified enzyme was stable between pH 5 and pH 9 and temperature of less than 60℃. Fibrinolytic activity was increased by 5 mM MgCl2 and 5 mM CaCl2 but inhibited
by 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM sodium dodecyl sulfate (SDS), and 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). The partially purified enzyme quickly degrades the α and β chains of fibrinogen but cannot degrade the
chain.
Bacillus licheniformis RO3 and B. pumilus 2.g secretes several extracellular proteases. Three B. licheniformis RO3 extracellular protease fractions was separated by 2D electrophoresis and identified by MALDI-TOF-MS. One fraction with molecular weight of 48 kDa and pI 4.80 had similiarity to bacillopeptidase F from B. licheniformis DSM 13 in protein score, that is 27. The three fraction of B. pumilus 2.g was separated by MALDI-TOF-MS. Each fraction of it has molecule weight of 23, 20 and 15 kDa and protein score ≤ 74 compared protein database. The results showed that there are some new protein fraction found in both extracellular fibrinolytic proteases produced by Bacillus licheniformis RO3 and B. pumilus 2.g.
Keywords: fibrinolytic protease, red oncom, tempeh gembus, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus