Kurva Standar Marker Protein
RIWAYAT HIDUP
1 PENDAHULUAN Latar Belakang
Penyakit kardiovaskular yang meliputi infark miokardial akut, penyakit jantung iskemik, penyakit jantung valvular, aritmia, tekanan darah tinggi, dan stroke adalah penyebab utama kematian di dunia, termasuk Indonesia. Pada tahun 2008, sekitar 17,3 juta orang meninggal karena penyakit kardiovaskular, atau 30% dari semua penyebab kematian global. Dari jumlah ini, 7,3 juta disebabkan oleh penyakit jantung koroner dan 6,2 juta disebabkan oleh stroke. Pada tahun 2030 diperkirakan jumlahnya akan meningkat hingga 23,6 juta orang (WHO 2011). Dasar patofisiologi proses infark miokardial dan stroke adalah pembentukan trombus atau bekuan fibrin yang melekat pada dinding pembuluh darah yang terluka. Akumulasi fibrin dalam pembuluh darah dapat mengganggu aliran darah dan merusak jaringan pada jantung, menyebabkan denyut jantung tidak teratur, serangan jantung, dan kematian.
Fibrin merupakan komponen protein utama dari pembekuan darah, yang terbentuk dari fibrinogen oleh trombin (Voet & Voet 1990). Serat fibrin yang tidak larut dapat dihidrolisis menjadi produk degradasi fibrin oleh plasmin, yang dihasilkan dari plasminogen oleh aktivator plasminogen seperti aktivator plasminogen jaringan, aktivator plasminogen vaskular, aktivator plasminogen darah, urokinase, faktor Hageman, dan kompleks plasminogen-streptokinase (Collen & Lijnen 1991).
Terapi trombolitik melalui suntikan maupun oral oleh agen trombolitik untuk mendegradasi trombus dalam darah telah banyak diteliti dan dipraktekkan (Goldhaber & Bounameaux 2001; Tough 2005). Berdasarkan mekanisme kerjanya, agen trombolitik diklasifikasikan menjadi dua jenis. Pertama adalah aktivator plasminogen, seperti aktivator plasminogen jaringan (t-PA) (Collen & Lijnen 2004) dan urokinase (Duffy 2002), yang mengaktifkan plasminogen menjadi plasmin aktif untuk mendegradasi fibrin. Jenis lainnya adalah plasmin-like protein, yang langsung mendegradasi fibrin dalam pembekuan darah, sehingga dapat melarutkan trombus dengan cepat dan sempurna. Lumbrokinase dari cacing tanah dan fibrolase dari bisa ular dikenal sebagai plasmin-like protein (Chen et al. 1991; Mihara et al. 1991). Meskipun t-PA dan urokinase masih banyak digunakan dalam terapi trombolitik, harganya yang mahal (100 mg t-PA adalah $2,750) dan adanya efek samping yang tidak diinginkan, seperti risiko pendarahan dalam usus ketika dikonsumsi secara oral (Peng et al. 2005), mendorong berbagai penelitian untuk mencari sumber agen trombolitik yang lebih murah dan lebih aman.
Enzim fibrinolitik atau dikenal sebagai protease fibrinolitik dari mikroba telah menarik perhatian untuk diteliti lebih jauh sebagai agen trombolitik. Streptokinase dari Streptococcus hemolyticus dan stafilokinase dari
Staphylococcus sp. telah terbukti efektif dalam terapi trombolitik (Collen & Lijnen 1994). Streptokinase tersedia dalam jumlah banyak dengan harga lebih murah (1,5x106 unit streptokinase adalah $320), namun selama proses produksi dan pemurnian mudah terkontaminasi oleh protein lain sehingga dapat menimbulkan efek antigenik dan jika digunakan secara berulang dalam waktu yang lama dapat menetralkan antibodi dan menimbulkan reaksi alergi (Turpie et al. 2002; Banerjee et al. 2004).
2
Genus Bacillus dari pangan fermentasi ternyata juga dapat menghasilkan enzim fibrinolitik kuat, seperti Bacillus natto dari natto, pangan fermentasi kedelai asal Jepang yang menghasilkan nattokinase (NK). Pemberian natto atau enzimnya secara oral tidak hanya dapat mendegradasi trombus secara langsung namun juga dapat meningkatkan pelepasan aktivator plasminogen endogen pada hewan percobaan dan subjek manusia (Sumi et al. 1990). Beberapa genus Bacillus
lainnya dari berbagai pangan fermentasi juga telah ditemukan mampu menghasilkan enzim fibrinolitik kuat. Diantaranya adalah B. amyloliquefaciens
DC-4 dari douchi, pangan fermentasi kedelai dari Cina (Peng & Zhang 2002),
Bacillus sp. CK dari chungkookjang, saus kedelai fermentasi dari Korea (Kim et al. 1996), Bacillus sp. strains DJ-2 dan DJ-4 dari doenjang, Korea (Choi et al.
2005; Kim & Choi 2000), dan Bacillus sp. KA38 dari jeotgal,ikan asin fermentasi dari Korea (Kim et al. 1997). Yoon et al. (2002) melakukan skrining secara sistematis terhadap strain penghasil enzim fibrinolitik dari berbagai pangan fermentasi komersial maupun buatan sendiri termasuk natto, chungkook-jang,
doen-jang, jeot-gal, dan tempe, pangan fermentasi dari Indonesia dan berhasil mengisolasi Enterococcus faecalis yang mampu memproduksi enzim dengan aktivitas fibrinolitik yang tinggi.
Berbagai temuan menarik tersebut menyiratkan bahwa dengan mengonsumsi makanan fermentasi yang mengandung protein tinggi dapat mencegah penyakit kardiovaskular. Mikroba penghasil enzim fibrinolitik yang ditemukan pada pangan fermentasi selain Bacillus, diantaranya adalah Fusarium
sp. BLB dari tempe (Sugimoto et al. 2007) dan Rhizopus chinensis 12 dari arak beras, Cina (Xiao-lan et al. 2005). Bahan pangan lain yang terbukti memiliki aktivitas fibrinolitik diantaranya adalah jamur pangan. Sejumlah peneliti telah melaporkan bahwa kandungan senyawa aktif dalam berbagai jamur pangan,
Cordyceps militaris (Kim et al. 2006; Choi et al. 2011), Schizophyllum commune
(Lu et al. 2010), Pleurotus eryngii (Cha et al. 2010), Volvariela volvaceae
(Sajuthi et al. 2010) yang diduga dapat mempengaruhi sirkulasi darah adalah protease yang memiliki aktivitas fibrinolitik.
Adanya manfaat biologis yang menjanjikan dari mengonsumsi makanan sumber enzim fibrinolitik, terbuka kesempatan luas untuk mengeksplorasi sumber enzim fibrinolitik baru dari pangan fermentasi khas Indonesia. Oncom merah dan tempe gembus merupakan salah satu pangan fermentasi khas Indonesia yang banyak ditemukan di daerah Jawa Barat dan Jawa Tengah yang terbuat dari fermentasi ampas kedelai. Hingga saat ini belum ada penelitian mengenai enzim fibrinolitik yang ada di oncom merah dan tempe gembus, baik penelitian isolasi bakteri penghasil enzim fibrinolitiknya maupun ekstraksi enzim fibrinolitik yang ada dalam oncom merah dan tempe gembus.
Perumusan masalah
Enzim fibrinolitik mikroba telah banyak ditemukan pada berbagai pangan fermentasi, baik pada pangan fermentasi nabati maupun hewani yang memiliki kadar protein tinggi. Penelitian mengenai enzim fibrinolitik mikroba pangan telah banyak dilakukan di luar negeri terutama Jepang, Korea, dan Cina. Penelitian di Indonesia mengenai enzim fibrinolitik mikroba masih terbatas padahal Indonesia dikenal sebagai negara yang kaya akan pangan fermentasi.
Kacang-kacangan seperti kedelai dan hasil perikanan yang difermentasi ternyata memiliki aktivitas fibrinolitik yang kuat. Pangan fermentasi kedelai yang terkenal di Indonesia adalah tempe, oncom, dan tempe gembus. Berbeda dengan tempe, oncom dan tempe gembus merupakan pangan fermentasi ampas kedelai. Ampas kedelai atau lebih dikenal sebagai ampas tahu adalah limbah hasil pembuatan tahu. Aktivitas fibrinolitik kuat dari mikroba yang diisolasi dari tempe telah dilaporkan oleh beberapa peneliti. Namun penelitian mengenai enzim fibrinolitik yang ada di oncom merah dan tempe gembus, terutama mengenai isolasi mikroba penghasil enzim fibrinolitik maupun ekstraksi enzim fibrinolitik yang ada dalam oncom merah dan tempe gembus belum pernah dilaporkan.
Dalam aplikasi khusus enzim pemecah fibrin, temuan mikroba fibrinolitik lokal adalah tahap awal yang harus diikuti tahap berikutnya yaitu mencari media produksi yang efektif dan efisien. Tingginya biaya produksi enzim merupakan salah satu hambatan suksesnya aplikasi enzim di industri. Pemilihan media produksi merupakan faktor kritis untuk fermentasi enzim fibrinolitik.
Karakteristik enzim fibrinolitik mikroba pangan yang sudah terbukti aman dan efektivitasnya sebagai agen trombolitik perlu diketahui dengan baik. Karakteristik ini dapat diketahui menggunakan analisis biokimia. Informasi karakter enzim fibrinolitik mikroba dari pangan fermentasi asal Indonesia sangat diperlukan dalam aplikasi sebagai pangan fungsional maupun pengembangan selanjutnya sebagai obat trombolitik yang aman.
Dari latar belakang yang telah dikemukakan, dirumuskan beberapa masalah yang dikaji lebih lanjut dalam penelitian, yaitu: apakah di dalam oncom merah dan tempe gembus ditemukan adanya mikroba penghasil protease yang bersifat fibrinolitik, apakah tepung oncom merah dapat digunakan sebagai media untuk menumbuhkan mikroba penghasil protease yang bersifat fibrinogenolitik, bagaimanakah karakteristik dari enzim fibrinolitik yang dihasilkan oleh mikroba terpilih setelah dilakukan pemurnian?
Tujuan Penelitian
Tujuan umum dari penelitian yang dilaksanakan adalah melakukan kajian terhadap protease fibrinolitik mikroba dari oncom merah dan tempe gembus. Tujuan khusus dari penelitian yang dilaksanakan adalah: (1) memilah dan mengidentifikasi mikroba dari pangan fermentasi oncom merah dan tempe gembus yang dapat memproduksi protease fibrinolitik, (2) memperoleh media yang baik untuk produksi enzim dengan pemanfaatan tepung oncom merah, (3) melakukan pemurnian dan karakterisasi enzim yang dihasilkan oleh mikroba terpilih, (4) melakukan studi proteomik enzim protease fibrinolitik dari mikroba pangan fermentasi.
Manfaat Penelitian
Penelitian yang dilaksanakan bermanfaat untuk memperoleh informasi keberadaan mikroba penghasil enzim fibrinolitik pada pangan fermentasi berbasis kedelai asal Indonesia, oncom merah dan tempe gembus, dan informasi karakter dari enzim fibrinolitik yang dihasilkan. Informasi ini berguna untuk
4
pengembangan pangan fungsional maupun pemanfaatan enzim sebagai obat trombolitik.
Hipotesis Penelitian
1. Di dalam oncom merah dan tempe gembus terdapat mikroba penghasil protease fibrinolitik.
2. Tepung oncom merah dapat digunakan sebagai media pertumbuhan mikroba penghasil protease fibrinogenolitik.
3. Enzim yang dihasilkan memiliki karakteristik tertentu uang selanjutnya dapat diaplikasikan dalam pengembangan pangan fungsional maupun dimanfaatkan sebagai obat untuk terapi penyakit kardiovaskular.
4. Terdapat beberapa fraksi protease fibrinolitik dari mikroba pangan fermentasi terpilih.
Daftar Pustaka
Banerjee A, Chisti Y, Banerjee UC. Streptokinase-a clinically useful thrombolytic agent. Biotechnology Advances 22:287–307.
Cha WS, Park SS, Kim SJ, Choi D. 2010. Biochemical and enzymatic properties of a fibrinolytic enzyme from Pleurotus eryngii cultivated under solid-state conditions using corn cob. Bioresource Technology 101:6475–6481.
Chen HM, Guan AL, Markland FS. 1991. Immunological properties of the fibrinolytic enzyme (fibrolase) from southern copperhead (Agkistrodon contortrix contortrix) venom and its purification by immunoaffinity chromatograph. Toxicon 29(6):683–694.
Choi D, Cha W, Park N, Kim H, Lee JH, Park JS, Park S.β011. Purification and
characterization of a novel fibrinolytic enzyme from fruiting bodies of Korean Cordyceps militaris.Bioresource Technology 102:3279–3285. Choi NS, Yoo KH, Hahm JH, Yoon KS, Chang KT, Hyun BH, Maeng PJ, Kim
SH. 2005. Purification and characterization of a new peptidase, bacillopeptidase DJ-2, having fibrinolytic activity: produced by Bacillus sp. DJ-2 from Doen-Jang. J Microbiol Biotechnol 15(1): 72–79.
Collen D, Lijnen HR. 2004. Tissue-type plasminogen activator: a historical perspective and personal account. J Thromb Haemost 2(4):541–546.
Collen D, Lijnen HR. 1994. Staphylokinase, a fibrin-specific plasminogen activator with therapeutic potential? Blood 84(3):680–686.
Collen D, Lijnen HR. 1991. Basic and clinical aspects of fibrinolysis and thrombosis. Blood 78:3114-3124.
Duffy MJ. 2002. Urokinase plasminogen activator and its inhibitor, PAI-1, as prognostic markers in breast cancer: from pilot to level 1 evidence studies.
Clin Chem 48(8): 1194–1197.
Goldhaber SZ, Bounameaux H. 2001. Thrombolytic therapy in pulmonary embolism. Semin Vasc Med 1(2):213–220.
Kim JS, Sapkota K, Park SE, Choi BS, Kim S, Hiep NT, Kim CS, Choi HS, Kim MK, Chun HS et al. 2006. A fibrinolytic enzyme from the medicinal mushroom Cordyceps militaris. The Journal of Microbiology 44(6):622-631.
Kim SH, Choi NS. 2000. Purification and characterization of subtilisin DJ-4 secreted by Bacillus sp. strain DJ-4 screened from Doen-Jang. Biosci Biotechnol Biochem 64:1722–1725.
Kim HK, Kim GT, Kim DK, Choi WA, Park SH, Jeong YK, Kong IS. 1997. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. KA38 originated from fermented fish. J Ferment Bioeng 84(4): 307–312.
Kim W, Choi K, Kim Y. 1996. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp. Strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang. Appl. En iron. Microbiol. 62:2482-2488.
Lu CL, Chen S, Chen SN. 2010. Purification and Characterization of a Novel Fibrinolytic Protease from Schizophyllum commune. Journal of Food and Drug Analysis 18(2):69-76.
Mihara H, Sumi H, Yoneta T, Mizumoto H, Ikedo R, Seiki M, Maruyama M. 1991. A novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm Lumbricus rubellus.Jpn J Physiol 41(3): 461–472
Peng Y, Yang X, Zhang Y. 2005. Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo. Appl Microbiol Biotechnol 69:126–132.
Peng Y, Zhang YZ. 2002. Optimation of fermentation conditions of douchi fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4. Chin J Appl Environ Biol 8:285-289.
Sajuthi D, Suparto I, Yanti, Praira W. 2010. Purifikasi dan pencirian enzim protease fibrinolitik dari ekstrak jamur merang. Makara sains 14(2):145-150. Sugimoto S, Fujii T, Morimiya T, Johdo O, Nakamura T. 2007. The fibrinolytic
activity of a novel protease derived from tempeh producing fungus,
Fusarium sp. BLB. Biosci. Biotechnol. Biochem. 71(9):2184-2189.
Sumi H, Hamada H, Nakanishi K, Hiratani H. 1990. Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase. Acta Haematol. 84:139-143.
Turpie AG, Chin BS, Lip GY. 2002. Venous thromboembolism: treatment strategies. British Medical Journal 325:948–950.
Tough J. 2005. Thrombolytic therapy in acute myocardial infarction. Nurs Stand
19(37):55–64.
Voet D, Voet JG. 1990. Biochemistry. Ed ke-2. New York: Wiley. hlm 1087-1095. WHO. 2011. Global status report on noncommunicable diseases 2010.
World Health Organization. Geneva.
Xiao-lan L, Lian-Xiang D, Fu-Ping L, Xi-Qun Z, Jing X. 2005. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Rhizopus chinensis 12.
Appl Microbiol Biotechnol 67(2): 209–214.
Yoon SJ, Yu MA, Sim GS, Kwon ST, Hwang JK, Shin JK, Yeo IH, Pyun YR. 2002. creening and characterization of microorganisms with fibrinolytic activity from fermented foods. J Microbiol Biotechnol 12(4): 649–656.
2 METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari 2012 sampai November 2013 di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati, IPB, Laboratorium Mutu dan Keamanan Pangan, SEAFAST center IPB, Laboratorium Biokimia dan Teknologi Enzim, Universitas Katholik Atma Jaya Jakarta, dan Laboratorium Mikrobiologi, Gyeongsang National University, Jinju, Korea.
Tahapan Penelitian
Penelitian akan melalui tiga tahapan, yaitu (1) isolasi dan identifikasi mikroba dari pangan fermentasi oncom merah dan tempe gembus yang dapat memproduksi protease fibrinolitik, (2) pemanfaatan tepung oncom merah sebagai media produksi protease fibrinogenolitik mikroba, (3) pemurnian dan karakterisasi enzim yang dihasilkan oleh mikroba terpilih, (4) studi proteomik enzim protease fibrinolitik dari mikroba pangan fermentasi.
Penelitian Tahap I
Penelitian tahap pertama adalah isolasi mikroba penghasil protease fibrinolitik dengan menggunakan media SMA. Sampel yang digunakan adalah oncom merah segar, oncom merah yang telah dipanaskan 80oC selama 15 menit, tempe gembus segar, dan tempe gembus yang telah dipanaskan 80oC selama 15 menit. Mikroba yang mampu menghasilkan zona bening ditumbuhkan dalam media Luria Bertani broth (LB) agar dapat memproduksi protease fibrinolitik. Protease fibrinolitik yang dihasilkan diuji aktivitasnya secara kuantitatif menggunakan cakram fibrin (Hwang et al. 2007) dan kualitatif dengan teknik zimografi. Substrat yang digunakan untuk zimografi adalah fibrinogen. Mikroba terpilih adalah yang mampu menghasilkan enzim yang dapat mendegradasi substrat yang ditandai dengan adanya garis bening pada gel. Pada tahap isolasi diutamakan untuk mendapatkan mikroba yang aman dan dapat memproduksi protease fibrinolitik dengan berat molekul yang relatif rendah.
Mikroba terpilih kemudian disimpan dalam gliserol sebagai stok bakteri untuk pengujian selanjutnya. Mikroba yang diharapkan adalah Bacillus yang aman dikonsumsi sehingga pemilihan isolat dilakukan dengan tahapan identifikasi isolat sebagai berikut: pewarnaan Gram yang dilanjutkan dengan pewarnaan spora, uji biokimiawi dengan kit API 50CHB dan APIWEBTMsoftware, dan identifikasi secara molekuler dengan analisis 16S-rRNA.
Penelitian Tahap II
Tujuan dari tahap ini adalah pemanfaatan tepung oncom merah sebagai media pertumbuhan mikroba penghasil protease fibrinogenolitik. Mikroba yang dipilih adalah B. licheniformis RO3 yang diisolasi dari oncom merah. Mikroba ditumbuhkan dalam tiga media yang berbeda, yaitu media Luria Bertani broth
(LB), ½ LB + susu skim 1% (b/v), dan ½ LB + tepung oncom merah 1% (b/v) pada suhu 37oC dalam inkubator goyang. Optical density (OD620), aktivitas
protease (Bergmeyer & Grassl 1983), aktivitas fibrinogenolitik secara kualitatif dengan zimografi, dan konsentrasi protein (Bradford 1976) diukur setiap 12 jam sekali selama 72 jam.
Penelitian Tahap III
Penelitian tahap ketiga merupakan tahap pemurnian dan karakterisasi enzim yang dihasilkan oleh mikroba terpilih. Mikroba yang dipilih adalah B. pumilus 2.g yang diisolasi dari tempe gembus. Sebelum dilakukan pemurnian, pemilihan media produksi dilakukan pada 4 media yang berbeda, yaitu Luria Bertani broth (LB), tryptic soy broth (TSB), nutrient broth (NB), dan brain heart infusion (BHI). Pemurnian enzim dilakukan dengan pengendapan amonium sulfat, kromatografi penukar ion, dan kromatografi interaksi hidrofobik. Karakteristik yang diamati adalah berat molekul, stabilitas pH, stabilitas suhu, pengaruh inhibitor dan aktivator, spesifisitas substrat, dan degradasi fibrinogen.
Penelitian Tahap IV
Penelitian tahap keempat merupakan studi proteomik enzim protease fibrinolitik dari mikroba pangan fermentasi. Mikroba yang dipilih adalah B. licheniformis RO3 dengan media produksi ½ LB + tepung oncom merah 1% (LBO) dan B. pumilus 2.g dengan media produksi NB. Studi proteomik diawali dengan elektroforesis satu dimensi, kemudian elektroforesis dua dimensi dan dilanjutkan identifikasi protein dengan Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF).
9
Gambar 1 Diagram alir pelaksanaan penelitian tahap I dan II Dua mikroba
terpilih Identifikasi isolat:
Pewarnaan gram dan spora
Uji biokimiawi dengan API 50CHB
Analisis 16S-rRNA Produksi pada media LB
Uji aktivitas protease, konfirmasi kemampuan fibrinolitik dengan cakram
fibrin dan zimografi Enzim (supertnatan)
Isolat
Isolasi pada media SMA Sampel
Tahap I
Isolasi dan identifikasi mikroba dari pangan fermentasi oncom merah dan tempe gembus yang dapat memproduksi protease
fibrinolitik
Pengukuran OD620 Uji aktivitas protease, aktivitas fibrinolitik dan
konsentrasi protein Kondisi pertumbuhan terpilih Freezing dry Karakterisasi biokimia enzim Produksi enzim Supernatan
Pelet (Enzim kasar)
Tahap II Pemanfaatan tepung oncom merah sebagai media produksi protease fibrinogenolitik mikroba
Mikroba terpilih B. licheniformis RO3
Fermentasi pada 3 media yang berbeda
Enzim (supernatan)
Gambar 2 Diagram alir pelaksanaan penelitian tahap III dan IV Fermentasi pada 4
media yang berbeda
salting-out dengan amonium sulfat Tahap III Pemurnian dan karakterisasi enzim fibrinolitik mikroba Mikroba terpilih B. pumilus 2.g Kondisi pertumbuhan terpilih Produksi enzim supernatan Karakterisasi biokimia enzim Enzim murni dialisis dan freeze dry
Kromatografi penukar ion, dialisis, freeze dry
pelet
Enzim kasar
Enzim semi murni
Kromatografi interaksi hidrofobik, dialisis, freeze
Tahap IV
Studi proteomik protease dari mikroba pangan fermentasi
Produksi enzim Mikroba terpilih B. licheniformis RO3
Supernatan
Elektroforesis satu dimensi (SDS-PAGE)
Elektroforesis dua dimensi (2D) MALDI-TOF Identifikasi Mikroba terpilih B.pumilus 2.g Produksi enzim Enzim murni
Elektroforesis satu dimensi (SDS-PAGE)
MALDI-TOF
10
1
Abstraknya telah dipresentasikan secara oral pada 4th Annual International Symposium on Wellness, Healthy Lifestyle and Nutrition di Yogyakarta pada 30 November – 1 Desember 2013, sedangkan artikel lengkapnya telah diterima untuk dipublikasikan pada Malaysian Journal of Microbiology
3 PROTEOLYTIC AND FIBRINOLYTIC ACTIVITIES OF SEVERAL
MICROORGANISMS SCREENED FROM RED ONCOM AND
TEMPEH GEMBUS, INDONESIAN FERMENTED SOYBEAN CAKES1 Abstract
This study was to isolate, screen, and identify microorganisms from fermented food Red Oncom and Tempeh Gembus that can produce fibrinolytic proteases. Forthy-three isolates showed proteolytic activities on skim milk agar, while thirthy-eight of them showed fibrinolytic activities both on a fibrin plate and a fibrinogen zymography. The isolates that showed activity in fibrin plate and fibrinogen zymography with lower molecular weight and considered as safe were chosen and identified as Bacillus licheniformis and Bacillus pumilus by using API CHB kit and 16S rRNA. The novel fibrinolytic microorganisms were referred to as B. licheniformis RO3 and B. pumilus 2.g. Red Oncom and Tempeh Gembus are potential sources of microbial fibrinolytic protease. This is the first time that Red Oncom and Tempeh Gembus as Indonesian fermented foods based on soybean cake were shown having fibrinolytic microorganism. Microbial fibrinolytic enzymes from these fermented foods can be used for functional food formulation to prevent thrombosis and other related diseases.
Keywords: microbial fibrinolytic enzyme, red oncom, zymography,
B. licheniformis, B. pumilus
Introduction
Cardiovascular diseases are the leading cause of death in the world, including in Indonesia (WHO 2011). Accumulation of fibrin in the blood vessels usually results in thrombosis, leading to myocardial infarction and other cardiovascular diseases (Peng et al. 2005). Fibrin is the major protein component of blood clots, which are formed from fibrinogen by thrombin. Insoluble fibrin can be hydrolyzed to fibrin degradation products by plasmin, which is generated from plasminogen by plasminogen activators such as tissue plasminogen activator, vascular plasminogen activator, blood plasminogen activator, urokinase, Hageman factor and plasminogen-streptokinase complex (Collen and Lijnen 2004).
Thrombolytic therapy by injection and oral thrombolytic agents to degrade the thrombus in the blood have been widely studied and practiced (Tough 2005). Based on its mechanism of action, thrombolytic agents are classified into two types. The first is a plasminogen activator, such as tissue plasminogen activator (t- PA) and urokinase which activates plasminogen to plasmin and further hydrolyses fibrin (Collen and Lijnen 2004). Other type for thrombolytic therapy is using plasmin-like proteins, which directly degrade fibrin in the blood clotting, thus dissolve the thrombus quickly and perfectly. Lumbrokinase of earthworms and fibrolase of snake venom are known as plasmin-like protein (Mihara et al.
1991). Although t-PA and urokinase are still widely used in thrombolytic therapy, its price and the side effects possibility of undesirable such as the risk of bleeding in the gut when taken orally (Peng et al.β005), prevent it’s normal utilization.
This encourages study to find the source of thrombolytic agent that is cheaper and safer.
Fibrinolytic enzyme originated from microbes has attracted the attention of many researchers to be applied as a thrombolytic agent. Streptokinase from
Streptococcus hemolyticus and Staphylokinase from Staphylococcus sp. are potential alternative plasminogen activator and had proven effective in thrombolytic therapy (Banarjee et al. 2004). However, Streptokinase is available in large quantities at high prices and during the production and purification is easily contaminated by other proteins that can cause antigenic effect. Furthermore, repeated use for a long time can induce allergies (Banerjee et al. 2004).
Recently, many fibrinolytic enzymes have been identified from traditional fermented foods such as Japanese Natto (Fujita et al. 1993), Chinese Douchi
(Peng and Zhang 2002), Korean Doen-jang (Choi et al. 2005), Korean
Cheonggukjang (Jeong et al. 2007) and Korean Meju (Jo et al. 2011a). These interesting reports imply some fermented foods contain enzymes that can potentially prevent cardiovascular diseases. This fact opens opportunities to