Bacillus licheniformis RO3 2 Abstract
YANG DIISOLASI DARI PANGAN FERMENTASI INDONESIA Abstrak
Studi proteomik meliputi pemisahan, identifikasi dan karakterisasi protein. Pada penelitian ini dilakukan studi pada protease fibrinolitik ekstraseluler dari
Bacillus licheniformis RO3 dan Bacillus pumilus 2.g yang diisolasi dari oncom merah dan tempe gembus, pangan fermentasi Indonesia. Kombinasi analisis elektroforesis satu dimensi dan dua dimensi yang dilanjutkan dengan analisis spektrometri massa menggunakan MALDI-TOF-MS dan penelusuran menggunakan database protein, menunjukkan bahwa terdapat dua fraksi protein dari B. licheniformis RO3 dan 3 fraksi dari B. pumilus 2.g. yang baru atau belum pernah dilaporkan sebelumnya.
Keywords: proteomik, protease fibrinolitik, elektroforesis 2D, MALDI-TOF-MS Pendahuluan
Proteomik didefinisikan sebagai analisis protein secara menyeluruh terhadap suatu sel atau organisme tertentu. Studi ini meliputi pemisahan, identifikasi dan karakterisasi protein. Salah satu cara yang paling efektif untuk memisahkan protein yang terdapat dalam campuran kompleks adalah dengan menggunakan elektroforesis gel dua dimensi (2D) (Phillips & Bogyo 2005). Dengan menggunakan metode ini, protein dipisahkan berdasarkan titik isoelektrik (pI) dalam dimensi pertama (IEF, isoelectric focusing) dan berat molekul (BM) pada dimensi kedua (SDS-PAGE, sodium dedocyl sulfate polyacrilamide gel) (Gravel 2002).
Elektroforesis 2D memiliki kemampuan untuk memisahkan sejumlah besar protein termasuk modifikasi pasca-translasi yang sering menyebabkan perubahan pada muatan ataupun berat molekul serta bentuk-bentuk unik dari protein hasil proteolisis (Anderson & Anderson 1998; Cordwell et al. 2001). Teknik ini menggunakan Immobilized pH Gradient (IPG) strip yang dibuat dari kopolimerisasi dari turunan asam dan basa akrilamid dengan konsentrasi yang berbeda dalam matriks poliakrilamid (Gianazza 2002).
Elektroforesis 2D dapat digunakan untuk pemisahan kompleks protein menjadi komponen tunggal polipeptida yang merupakan analisis utama dalam studi proteomik. Sampai saat ini, teknik elektroforesis 2D merupakan satu-satunya metode pemisahan ribuan protein dalam satu tahapan pemisahan. Sampel yang digunakan dapat berupa biofluid, jaringan, sel, dan organel. Beberapa analisis yang dapat dilakukan adalah membandingkan ekspresi protein dari sampel yang berpasangan, misalnya membandingkan sel normal dengan sel yang telah mengalami transformasi atau membandingkan beberapa sel pada tahapan pertumbuhan yang berbeda (Gravel 2002). Dengan membandingkan sampel secara bersamaan maka teknik ini dapat digunakan untuk studi proteomik penyakit kanker dan berbagai analisis ekspresi gen tertentu dari komunitas campuran mikroorganisme prokariot di lingkungan (Wilmes & Bond 2004).
Dengan metode ini dan dilanjutkan dengan analisis spektrometri massa Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF), dapat dideteksi dua protease serin ekstraselular dari Bacillus subtilis 168, yaitu WprA (52 kDa) dan Vpr (68 kDa) yang memiliki aktivitas fibrinolitik (Park et al. 2002).
Bacillus subtilis memproduksi beberapa protease ekstraseluler pada akhir fase pertumbuhan eksponensial (Priest 1997). Enzim proteolitik ekstraseluler yang utama adalah subtilisin dan protease netral yang diberi kode gen apr dan npr (Kawamura & Doi 1984). Protease ekstraseluler lainnya yaitu bacillopeptidase F, Epr, dan Mpr. Bacillopeptidase F (Roitsch & Hageman 1983) dan protein Epr, yang diberi kode gen bpr dan epr (Sloma et al. 1988), keduanya adalah protease serin, sedangkan Mpr, yang diberi kode gen mpr, termasuk metaloprotease (Rufo
et al. 1990).
Pada penelitian ini dilakukan studi proteomik pada enzim ekstraseluler dari
Bacillus licheniformis RO3 dan Bacillus pumilus 2.g yang diisolasi dari pangan fermentasi Indonesia, oncom merah dan tempe gembus.
Bahan dan Metode Mikroorganisme
Bacillus licheniformis RO3 (AB968524) telah diisolasi dari pangan fermentasi oncom merah sedangkan B. pumilus 2.g (AB968523) diisolasi dari tempe gembus (Afifah et al. 2013).
Persiapan sampel
B. licheniformis RO3 ditumbuhkan dalam media ½ Luria-bertani broth
(LB) + tepung oncom 1% (b/v), selanjutnya disebut media LBO, selama 0, 12, 24, 36, 48, 60, dan 72 jam pada inkubator goyang 120 rpm pada suhu 37oC. Enzim ekstraseluler didapat dengan sentrifugasi 6000 g selama 15 menit pada 4oC. Enzim selanjutnya dikeringbekukan untuk meningkatkan konsentrasi protein. Konsentrasi protein pada sampel dihitung dengan metode Bradford (1976). Aktivitas protease dihitung dengan metode (Bergmeyer et al. 1983) dengan substrat kasein. Sebelum dilakukan analisis spektometri massa menggunakan MALDI-TOF-MS, enzim ekstraseluler dari B. licheniformis RO3 ini dianalisis fraksi proteinnya dengan elektroforesis satu dimensi (SDS-PAGE) dan elektroforesis dua dimensi (2D).
B. pumilus 2.g ditumbuhkan dalam media (nutrient broth) (NB) selama 72 jam pada inkubator goyang 120 rpm pada suhu 37oC. Enzim ekstraseluler didapat dengan sentrifugasi 12.000 g selama 10 menit pada 4oC. Enzim selanjutnya dimurnikan dengan pengendapan amonium sulfat 80%, kromatografi penukar ion dengan CM-Sephadex C-50 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), dan kromatografi interaksi hidrofobik dengan Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). Pada setiap tahapan dilakukan dialisis. Enzim murni selanjutnya dikeringbekukan dan siap untuk analisis selanjutnya. Konsentrasi protein pada sampel dihitung dengan metode Bradford (1976). Aktivitas fibrinolitik dihitung dengan metode Jeong et al. (2007) dengan substrat fibrin. Sebelum dilakukan analisis spektometri massa menggunakan MALDI-TOF MS, enzim murni hanya dianalisis fraksi proteinnya dengan elektroforesis satu dimensi (SDS-PAGE).
44
Elektroforesis satu dimensi (SDS-PAGE) dan zimogram
Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) dilakukan dengan konsentrasi gel pemisah sebesar 12% dan gel penahan sebesar 4% (Laemmli 1970). Zimogram dilakukan dengan konsentrasi gel pemisah sebesar 12% yang mengandung fibrinogen atau fibrin 0,02%.
Elektroforesis dua dimensi (2D)
Metode elektroforesis yang dilakukan pada penelitian ini dilakukan menurut
Protean IEF Cell Instruction Manual dari BioRad.
Rehidrasi Immobilized pH Gradient (IPG) strip. Sebanyak 50 µl sampel dengan konsentrasi protein sampai dengan 1 mg dicampurkan dengan 150 µl buffer rehidrasi (8 M Urea, 2 % CHAPS, 0,2% Bio-Lytes, dan 50 mM DTT). Selanjutnya, campuran sampel tersebut dimasukkan ke dalam focusing tray. Pelindung pada permukaan lembaran IPG strip dibuka dengan pinset lalu dimasukkan ke dalam larutan campuran sampel, letak kutub positif dan negatif pada IPG strip dan focusing tray disesuaikan, dan permukaan IPG strip menghadap ke bawah. Peletakkan IPG strip pada focusing tray harus seimbang. IPG strip kemudian dilapisi dengan minyak mineral sebanyak 2,5 ml. Selanjutnya
wicks paper yang dibasahi dengan ddH2O disisipkan pada permukaan elektroda focusing tray. Setelah dipastikan tidak ada gelembung, focusing tray ditutup rapat dan IPG strip diinkubasi selama 16 jam dalam Protean IEF cell.
Isoelectric Focusing (IEF). Setelah 16 jam, dilakukan running IEF dengan pengaturan sebagai berikut: Voltase I: 250 V, 30 menit; Voltase II: 4000 V, 1 jam; Voltase III: 4000 V, 3 jam dengan suhu 10oC. Setelah running IEF selama 4,5 jam, IPG strip diangkat dan dilakukan preparasi sebelum elektroforesis dimensi kedua.
Preparasi sebelum elektroforesis satu dimensi (SDS-PAGE). IPG strip diinkubasi dalam 2,5 ml buffer equilibrasi I (6 M Urea, 0,375 M Tris-HCl, 2% SDS, 20% gliserol, 2% DTT) selama 15 menit dan dilanjutkan dengan inkubasi dalam 2,5 ml buffer equilibrasi II (6 M Urea, 0,375 M Tris-HCl, 2% SDS, 20% gliserol, 2,5% iodoacetamida) selama 15 menit. Selama proses inkubasi dalam buffer equilibrasi, disiapkan terlebih dahulu gel pemisah poliakrilamida untuk SDS-PAGE tanpa menggunakan gel penahan. Selanjutnya, buffer equilibrasi dibuang dan IPG strip siap untuk di-running pada dimensi kedua dengan elektroforesis SDS-PAGE pada tegangan 100 volt selama 2 jam dalam buffer elektroforesis. Setelah elektroforesis dilakukan pewarnaan dengan larutan pewarna Coomassie Brilliant Blue R-250.
Analisis spektrometri MALDI-TOF-MS
Digesti dalam gel dari titik protein hasil elektoforesis 2D atau pita protein hasil SDS-PAGE dilakukan menggunakan metode Lee et al. (2012). Semua analisis spektrometri massa dilakukan dengan MALDI-TOF-MS Voyager Biospectrometry Workstation (PE Biosystem, Foster City, CA, USA). Spektra dianalisis dengan data Explorer software (PE Biosystems) dan dibandingkan dengan semua database dari National Center of Biotechnology Information
(NCBI) menggunakan program MASCOT peptide mass fingerprinting
(http://www.matrixscience.com). Skor protein lebih dari 74 dinyatakan identik dengan protein tertentu (p<0,05).
Z Estimasi berat molekul (BM) dan titik isoelektrik (pI)
Berat molekul fraksi protein dihitung berdasarkan rumus persamaan kurva standar berat molekul protein sedangkan titik isoelektrik fraksi protein dihitung berdasarkan pada rumus persamaan kurva standar titik isoelektrik. BM dan pI hasil perhitungan digunakan untuk konfirmasi hasil MALDI-TOF-MS, yaitu dengan cara memasukkan BM dan pI hasil perhitungan ke dalam program ExPASy-TagIdent (http://web.expasy.org/tagident/).
Hasil dan Pembahasan
Pada studi elektroforesis satu dimensi (SDS-PAGE) protease ekstraseluler dari B. licheniformis RO3 dengan media produksi LBO, terlihat bahwa pada fermentasi 0 jam tidak terlihat adanya pita fraksi protein. Pada jam ke 12 mulai terlihat beberapa pita, dan semakin bertambah jam fermentasi maka pita fraksi protein semakin banyak. Namun mulai jam ke-36 hingga jam ke-72 tidak ada lagi penambahan pita fraksi protein. Terlihat pada jam ke-36 hingga 72 jumlah pita protein tetap (Gambar 1).
M 0 12 24 36 48 60 72
Gambar 1 Hasil elektroforesis satu dimensi (SDS-PAGE) protease ekstraseluler dari B. licheniformis RO3 dengan media LBO
M marker fermentas, Z hasil zimogram dengan substrat fibrinogen Parameter kritis yang menentukan keberhasilan atau kegagalan dalam studi proteomik adalah kemampuan untuk mendapatkan protein tunggal dalam campuran kompleks. Salah satu cara yang paling efektif untuk memisahkan protein dalam campuran kompleks adalah dengan menggunakan elektroforesis dua dimensi. Pada penelitian ini, elektroforesis dua dimensi dilakukan pada protease ekstraseluler yang difermentasi pada media LBO selama 48 jam, yaitu pada saat tercapai aktivitas enzim tertinggi, 0,283 U/mg dan terbentuk beberapa
35 50 70 40 140 260 100 25 10 15
46
enzim protease ekstraseluler yang bersifat fibrinogenolitik (Gambar 1). Identifikasi menggunakan MALDI-TOF hasil elektroforesis dua dimensi hanya dilakukan pada tiga titik protein A, B, dan C (Gambar 2).
Gambar 2 Hasil elektroforesis dua dimensi protease ekstraseluler dari B. licheniformis RO3 dengan media LBO
Tabel 1 Analisa hasil perbandingan m/z protein dari protease B. licheniformis
RO3 dengan database Kode BM (kDa) pI Kemiripan Kode akses Skor protein Nama BM (kDa) pI
A 48 4.80 A4IQG0 31 Superoxide dismutase [Geobacillus