III. METODOLOGI PENELITIAN
3.5 Uji Luka Bakar
c. Uji Tanin
Sebanyak 10 tetes lapisan air sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan beberapa tetes FeCl3. Jika terbentuk warna hijau kehitaman menandakan bahwa sampel positif terdapat senyawa tanin22,44.
d. Uji Saponin
Sekitar 5 tetes lapisan air dimasukkan kedalam tabung reaksi lalu ditambahkan dengan 10 ml aquades. Kemudian campuran dikocok kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil dan bertahan tidak kurang dari 10 menit, dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes HCl 2N memberikan indikasi adanya saponin44.
e. Uji Steroid/Triterpenoid
Beberapa tetes lapisan kloroform dimasukkan kedalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 0,5 ml asam asetat anhidrat dan H2SO4 melalui dinding tabung. Jika terbentuk cincin biru kehijauan menandakan sampel positif steroid, sedangkan bila terbentuk cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan larutan menandakan sampel positif terpenoid45.
3.5.3 Prosedur Pemberian Luka Bakar
Pertama-tama tikus dikelompokkan menjadi 5 kelompok yang tiap kelompoknya terdiri dari 5 ekor tikus. Kemudian ditentukan daerah pada punggung tikus yang akan dibuat luka bakar. Setelah itu bagian tersebut dicukur rambutnya dan didiamkan sehari. Keesokan harinya dilanjutkan dengan melakukan anestesi pada tikus menggunakan castran (acepromazine maleat).
Selanjutnya area kulit yang akan dibuat luka bakar di desinfektan menggunakan etanol untuk mensterilkan permukaan kulit tikus. Lalu besi berdiameter 2,5 cm dipanaskan di api selama 5 menit dan ditempelkan di punggung tikus selama 5 detik46. Setelah terbentuk luka lalu punggung tikus dikompres dengan aquades.
Penelitian ini berlangsung selama 14 hari setelah masa aklimatisasi.
Dimana punggung tikus yang sudah diberikan luka bakar kemudian diberikan perlakuan yang berbeda untuk tiap kelompoknya yaitu pemberian bioplacenton, vaselin flavum, serta ekstrak etanol daun durian yang dicampurkan dengan vaselin flavum dengan masing-masing konsentrasi ekstrak 5%, 10%, dan 15%. Setiap perlakuan akan dioleskan sediaan sebanyak 2 kali sehari pada pagi dan sore hari44. Adapun perlakuan untuk tiap kelompok sebagai berikut :
Tabel 3.1 Kelompok Perlakuan Uji Luka Bakar
Kelompok Perlakuan
Kontrol (+) Pemberian bioplacenton Kontrol (-) Pemberian vaselin flavum
Perlakuan 1 Pemberian ekstrak daun durian 5% ad vaselin flavum Perlakuan 2 Pemberian ekstrak daun durian 10% ad vaselin flavum Perlakuan 3 Pemberian ekstrak daun durian 15% ad vaselin flavum
Proses penyembuhan luka bakar kemudian diamati setiap hari dan berlangsung selama 14 hari. Pengamatan dimulai pada saat pemberian luka bakar di punggung tikus dan kemudian diamati secara visual. Pengamatan proses penyembuhan luka dilakukan dengan cara mengukur diameter zona luka bakar menggunakan jangka sorong digital berskala 0,01 mm. Luka bakar yang telah sembuh akan ditandai dengan tertutupnya luka. Setelah 14 hari pengukuran diameter luka bakar dilakukan kemudian akan dihitung diameter rata-rata luka
serta persentase kesembuhan luka bakar. Adapun untuk menghitung diameter rata-rata zona luka bakar digunakan rumus berikut47 :
dx = dx1 dx2 dx3 dx4
4 Keterangan :
dx = diameter luka hari ke x dx1 = diameter luka hari pertama dx2 = diameter luka hari kedua dx3 = diameter luka hari ketiga dx4 = diameter luka hari keempat,dst.
Perhitungan persentase kesembuhan luka menggunakan rumus berikut48 : P%
=
d1- dxd1 x 100%
Keterangan :
P% = Persentase penyembuhan luka d1 = Diameter luka awal
dx = Diameter luka pada hari pengamatan 3.5.4 Pengamatan Kandungan Hidroksiprolin
Pengamatan kadar hidroksiprolin pada kulit tikus dilakukan dengan menggunakan hidroksiprolin murni, dimana dibuat terlebih dahulu larutan induk hidroksiprolin dengan cara menimbang hidroksiprolin sebanyak 50 mg dan dilarutkan dengan aquades sampai 50 ml sehingga menghasilkan larutan induk hidroksiprolin 1000 ppm. Selanjutnya dibuat larutan hidroksiprolin dengan konsentrasi 100 ppm dengan cara mencampurkan 5 ml larutan induk 1000 ppm dengan aquades sampai 50 ml.
dx(1)
dx(2) dx(3)
dx(4)
Panjang gelombang serapan maksimum didapatkan dari pengenceran larutan hidroksiprolin 100 ppm menjadi konsentrasi 9 ppm dengan cara menggabungkan 0,9 ml larutan hidroksiprolin 100 ppm sampai volume 10 ml dengan aquades hingga homogen. Kemudian 1 ml dari larutan hidroksiprolin 9 ppm ditambahkan CuSO4, NaOH, dan H2O2 masing-masing sebanyak 1 ml dan dioven pada suhu 80oC selama 5 menit. Setelah itu, 4 mL H2SO4 dan 2 mL 2-dimetilaminobenzaldehid ditambahkan lalu dipanaskan dalam oven pada suhu 70oC selama 16 menit. Nilai absorbansi kemudian diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 200-800 nm untuk mencari panjang gelombang maksimum44.
Setelah diketahui panjang gelombang maksimumnya kemudian dibuat kurva standar hidroksiprolin sebagai acuan untuk menentukan kadar hidroksiprolin pada kulit tikus bekas luka bakar. Adapun caranya yaitu dengan membuat 6 variasi konsentrasi larutan hidroksiprolin dari larutan hidroksiprolin 100 ppm. 6 konsentrasi tersebut terdiri dari konsentrasi 9, 18, 27, 36, 45, dan 54 ppm. Untuk membuat larutan hidroksiprolin dengan tersebut maka dipipet larutan hidroksiprolin 100 ppm sebanyak 0,9; 1,8; 2,7; 3,6; 4,5 dan 5,4 ml kemudian ditambahkan aquades sampai mencapai volume 10 ml.
Masing-masing konsentrasi dipipet sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan dengan 1 ml CuSO4 0,01 N, 1 ml NaOH 2,5 N dan 1 ml H2O2 6%. Selanjutnya seluruh larutan dipanaskan dalam oven dengan suhu 80oC selama 5 menit setelahnya ke-6 larutan ditambahkan lagi dengan larutan H2SO4 3M sebanyak 4 ml dan 2 ml 2-dimetil-aminobenzaldehid 5% lalu sampel dioven suhu 70oC selama 16 menit. Kemudian dibaca serapannya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 560 nm. Setelah masing-masing konsentrasi terbaca serapannya maka dapat dibuat kurva standar dari hasil absorbansi ke-6 konsentrasi larutan hidroksiprolin tadi yang mana nantinya kadar hidroksiprolin pada kulit tikus yang terkena luka bakar dapat dihitung menggunakan kurva standar yang telah diperoleh44.
Mekanisme pengukuran kadar hidroksiprolin dilakukan dengan melakukan biopsi pada bagian kulit bekas luka pada tikus kemudian dimasukkan ke dalam
aluminium foil dan dikeringkan di oven suhu 60oC selama 12 jam, lalu dihidrolisis dengan larutan HCl 6N selama 24 jam di dalam oven menggunakan suhu 110oC. Kemudian dinetralkan NaOH sampai pH 7 dan dipertahankan pHnya menggunakan dapar. Ditambahkan lagi setelahnya CuSO4, NaOH dan H2O2 masing-masing dalam volume 1 ml, lalu campuran larutan yang terbentuk dipanaskan pada oven selama 5 menit memakai suhu 80oC. Setelah dingin, maka ditambahkan 4 ml H2SO4 3M dan 2 ml 2-dimetil-aminobenzaldehid berikutnya dioven dengan suhu 70oC dalam kurun waktu 16 menit. Setelah itu larutan didiamkan hingga suhunya turun dan diukur serapannya menggunakan spektrofotometer UV-Vis49. Penetapan kadar hidroksiprolin pada kulit tikus dihitung dengan menggunakan persamaan regresi linear yang diperoleh dari kurva standar hidroksiprolin44.