IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.6 Pengujian Aktivitas Ekstrak Daun Durian Terhadap Penyembuhan Luka Bakar
4.6.2 Pengujian Kadar Hidroksiprolin
Sedangkan kelompok P3 juga mengalami fase proliferasi yang cepat tetapi tidak secepat pada kontrol positif. Dari hasil pengukuran diameter penyembuhan luka bakar dapat diketahui bahwa ekstrak etanol daun durian memiliki aktivitas untuk menyembuhkan luka bakar.
Konsentrasi ekstrak etanol daun durian terbaik berdasarkan diameter kesembuhan luka dipegang oleh kelompok P3 dengan konsentrasi ekstrak etanol daun durian sebesar 15%, kemudian diikuti oleh konsentrasi ekstrak 10% dan 5%.
Pada kelompok kontrol positif proses penyembuhan luka bakar berlangsung cepat dikarenakan pada kelompok kontrol positif digunakan bioplacenton yang mana bioplacenton mengandung 10% Placenta extract. Placenta merupakan jaringan awal pada proses pertumbuhan makhluk hidup sehingga ekstrak placenta dapat mempercepat proses regenerasi kulit dengan meningkatkan faktor pertumbuhan TGF-beta dan faktor pertumbuhan endotel vaskular70,71.
Kelompok kontrol negatif mengalami penurunan diameter luka paling kecil karena pada kelompok ini dioleskan vaselin flavum. Vaselin flavum merupakan basis salep hidrokarbon yang berfungsi sebagai basis untuk memperpanjang kontak zat aktif dengan kulit dan dapat menjaga kelembaban kulit. Oleh karena itu proses penyembuhan luka bakar pada kelompok kontrol negatif tidak berlangsung signifikan72.
mengetahui kadar hidroksiprolin jaringan kulit. Oleh karena itu tingginya kadar hidroksiprolin dapat dijadikan penanda terjadinya proses penyembuhan luka.
Pada hari ke-15 setelah terbentuknya luka bakar, dilakukan penentuan kadar hidroksiprolin pada kulit tikus karena pada hari ke-15 masa penyembuhan luka sedang berlangsung fase proliferasi, dimana pada fase proliferasi terbentuk sel fibroblas yang berperan dalam proses sintesis kolagen sehingga pada hari ke-15 sangat tepat untuk dilakukannya penentuan kadar hidroksiprolin karena kolagen adalah faktor terbentuknya jaringan kulit baru sehingga dapat menggambarkan penyembuhan luka.
Untuk menentukan kadar hidroksiprolin pada kulit tikus bekas luka bakar digunakan alat spektrofotometer Vis karena penggunaan spektrofotometer Uv-Vis relatif mudah, murah serta cukup sensitif dan selektif dalam mengukur kadar dalam jumlah kecil. Dalam mengukur kadar suatu sampel menggunakan spektrofotometer Uv-Vis, proses absorbansi hanya dapat dilakukan pada sampel berbentuk cairan dan sampel tersebut memiliki gugus kromofor sehingga dapat diukur serapan atau absorbansinya di daerah Uv-Vis75. Karena kulit tikus tidak dalam bentuk cairan atau larutan maka perlu dilakukan beberapa tahapan agar kulit tikus bekas luka bakar dapat menjadi bentuk larutan. Selain itu asam amino hidroksiprolin tidak mempunyai gugus kromofor sehingga tidak dapat dibaca absorbansinya pada daerah Uv-Vis, untuk itu perlu dilakukan proses derivatisasi untuk membuat hidroksiprolin menjadi berwarna sehingga absorbansinya dapat dibaca oleh spektrofotometer Uv-Vis75.
Proses penentuan kadar hidroksiprolin dilakukan dengan mengambil jaringan kulit tikus pada hari ke-15 proses penyembuhan luka bakar. Jaringan kulit kemudian diletakkan dan dibungkus di dalam aluminium foil untuk dikeringkan terlebih dahulu. Tujuannya yaitu untuk menghentikan proses enzimatik yang ada pada kulit serta untuk mencegah terjadinya pembusukan dan mencegah kulit mengalami kerusakan. Proses pengeringan kulit dilakukan menggunakan oven dengan suhu 60oC selama 12 jam. Setelahnya kulit yang sudah kering dihidrolisis menggunakan HCl 6 N dengan volume 2 ml untuk masing-masing kulit. Kemudian kulit dioven selama 24 jam menggunakan suhu
110oC tujuan proses hidrolisis ini untuk memecah ikatan amina pada asam amino sehingga asam amino dalam keadaan bebas44.
Setelah dihidrolisis selanjutnya sampel dinetralkan pada pH 7 menggunakan larutan NaoH dan dipertahankan pH nya dengan menambahkan larutan buffer. Tujuan penetralan pH ini adalah agar pH larutan menjadi stabil sehingga serapan yang terbaca juga lebih stabil. Setelahnya sampel ditambahkan dengan masing-masing 1 ml larutan NaoH 2,5 N, 1 ml H2O2, dan 1 ml CuSo4
0,01M kemudian diinkubasi lagi seluruh sampel pada oven dengan suhu 80oC selama 5 menit44.
Berikutnya sampel diderivatisasi untuk memberikan warna pada sampel agar dapat terbaca serapannya pada spektrofotometer Uv-Vis. Proses ini dilakukan dengan cara menambahkan larutan H2SO4 3M sebanyak 4 ml pada masing-masing sampel kemudian ditambahkan lagi 2 ml reagen 2-dimetil-aminobenzaldehid lalu dilakukan inkubasi terakhir untuk seluruh sampel pada oven menggunakan suhu 70oC dalam kurun waktu 16 menit, dimana proses inkubasi ini akan menyebabkan perubahan warna pada sampel menjadi warna merah. Semakin pekat merah warna yang dihasilkan maka semakin tinggi pula kadar hidroksiprolin yang terkandung dalam sampel44. Selanjutnya seluruh sampel akan dibaca absorbansi atau serapannya pada alat spektrofotometer Uv-Vis menggunakan panjang gelombang 560 nm sesuai dengan panjang gelombang maksimum yang didapatkan dari pembacaan absorbansi larutan hidroksiprolin standar yang telah dilakukan sebelumnya.
Kadar hidroksiprolin pada jaringan kulit ditetapkan melalui kurva standar hidroksiprolin. Pembuatan kurva standar dilakukan dengan membuat larutan standar hidroksiprolin terlebih dahulu. Larutan standar merupakan larutan yang telah diketahui konsentrasinya76. Larutan yang dipakai untuk membuat kurva standar hidroksiprolin terdiri dari 6 konsentrasi yang berbeda yaitu konsentrasi 9, 18, 27, 36, 45 dan 54 ppm yang mana masing-masing variasi konsentrasi dibuat melalui pengenceran dari larutan induk hidroksiprolin 100 ppm44. Ke-6 konsentrasi ini kemudian dikerjakan sama seperti pengerjaan untuk menentukan kadar hidroksiprolin jaringan kulit.
Setelah semua penambahan larutan selesai dilakukan pada ke-6 konsentrasi hidroksiprolin, maka selanjutnya dibaca absorbansi dari tiap konsentrasi larutan menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis (Ultraviolet – Visible) pada panjang gelombang 560 nm, yang mana hasil absorbansi yang diperoleh dari tiap konsentrasi larutan akan diolah untuk mendapatkan persamaan regresi linear dan kurva standar hidroksiprolin. Kurva standar ini diperoleh dari hubungan antara konsentrasi larutan dengan nilai absorbansinya yang dapat dilihat pada gambar dibawah ini:
Gambar 4.3 Kurva Standar Hidroksiprolin
Dari kurva standar yang dihasilkan oleh larutan standar hidroksiprolin dengan 6 variasi konsentrasi, maka didapatkan persamaan regresi linear yaitu y = 0,0263 + 0,0583 x dengan nilai koefisien korelasi yaitu r = 0,9962. Nilai linieritas terbaik ditunjukkan dengan harga koefisien korelasi yang mendekati atau sama dengan 1. Setelah didapatkan persamaan regresi linear dari kurva standar hidroksiprolin maka persamaan regresi linear tersebut digunakan sebagai rumus untuk menghitung kadar hidroksiprolin pada jaringan kulit tikus yang telah diberikan perlakuan selama 14 hari setelah diinduksi luka bakar.
Adapun cara untuk menghitung kadar hidroksiprolin pada jaringan kulit yaitu dengan mensubstitusikan nilai absorbansi jaringan kulit pada variabel y dari persamaan regresi linier tersebut sehingga akan didapatkan nilai kadar hidroksiprolin jaringan kulit berupa nilai dari variabel x. Adapun kadar hidroksiprolin pada jaringan kulit tikus yang telah diinduksi luka bakar disajikan pada tabel 4.6 berikut:
y = 0.0263 + 0.0583x R² = 0.9962
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
0 20 40 60
Konsentrasi
Absorbansi
Absorbansi Linear (Absorbansi)
Tabel 4. 6 Kadar Hidroksiprolin dari Jaringan Kulit Tikus
Kelompok Perlakuan Kadar Hidroksiprolin (µg/ml) ± SEM
K+ 79,62a ± 0,38
K- 34,69d ± 0,79
P1 47,21c ± 0,94
P2 61.16b ± 1,31
P3 70.61ab ± 0,88
Keterangan :
- Superscript dengan huruf kecil yang berbeda pada garis yang sama menunjukkan perbedaan nyata p<0,05
- K+ (Bioplacenton),K- (Vaselin Flavum), P1 (5%), P2 (10%), P3 (15%)
Setelah dilakukan analisis data secara statistik menggunakan one way anova menunjukkan bahwa pada kelompok perlakuan memiliki perbedaan yang bermakna ditunjukkan dengan nilai signifikansi yang kurang dari 0,05 (p<0,05) terhadap kandungan hidroksiprolin pada jaringan kulit tikus. Untuk mengetahui perbedaan nyata antar kelompoknya dilakukan dengan uji lanjutan post hoc duncan. Adapun kadar hidroksiprolin pada jaringan kulit tikus dapat dilihat pada gambar berikut:
Gambar 4.4Kadar Hidroksiprolin Jaringan Kulit Tikus
Ekstrak daun durian memberikan pengaruh yang nyata, dimana hal ini dapat dilihat berdasarkan hasil dari uji lanjutan post hoc duncan yang dilakukan.
Konsentrasi ekstrak etanol daun durian 15% adalah konsentrasi ekstrak terbaik yang ditandai dengan kadar hidroksiprolin 70,61 µg/ml kemudian posisi kedua diduduki oleh konsentrasi ekstrak 10% yang memiliki kadar hidroksiprolin 61,16 µg/ml dan terakhir adalah konsentrasi ekstrak 5% dengan kadar hidroksiprolin
79.62
34.69
47.21
61.16 70.61
0 20 40 60 80 100
Kontrol Positif
Kontrol Negatif
P1 P2 P3
Kadar Hidroksiprolin (µg/ml)
Kelompok Perlakuan
sebesar 47,21 µg/ml. Walaupun konsentrasi ekstrak 15% memiliki kadar hidroksiprolin tertinggi diantara ke 3 konsentrasi ekstrak, tetapi kadar hidroksiprolin kelompok konsentrasi ekstrak 15% tidak lebih besar dari kelompok kontrol positif yang memiliki kadar hidroksiprolin sebesar 79,62 µg/ml. Kadar hidroksiprolin yang tinggi menandakan pembentukan kolagen yang besar pada daerah kulit yang luka. Berdasarkan hasil perhitungan kadar hidroksiprolin dapat dikatakan bahwa pembentukan kolagen terbesar terjadi pada kelompok kontrol positif dan dari ke-3 konsentrasi ekstrak etanol daun durian yang diuji, kelompok P3 dengan konsentrasi 15% memiliki kadar pembentukan kolagen terbesar.
Hasil pengukuran kadar hidroksiprolin berbanding lurus dengan penurunan diameter luka bakar pada punggung tikus yang diuji. Dimana kelompok terbaik dalam penyembuhan luka bakar ini dipegang oleh kelompok kontrol positif diikuti oleh kelompok P3 (konsentrasi ekstrak 15%), lalu P2 (konsentrasi ekstrak 10%), P1 (konsentrasi ekstrak 5%) dan terakhir yaitu kelompok kontrol negatif. Kelompok P3 menjadi konsentrasi ekstrak terbaik karena semakin tinggi konsentrasi ekstrak yang digunakan maka semakin banyak kandungan metabolit sekunder yang terkandung pada konsentrasi itu sehingga semakin maksimal aktivitas metabolit sekunder yang berkhasiat sebagai obat luka bakar bekerja dalam menyembuhkan luka yang terbentuk. Hal ini juga ditandai dengan proses penyembuhan luka pada kelompok P2 (konsentrasi ekstrak 10%) lebih baik dari kelompok P1 (konsentrasi ekstrak 5%) dan kelompok P3 memiliki aktivitas yang lebih baik dari konsentrasi P2 dan P1.
56
V. K ESIMPULAN DAN SARAN