Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dimulai sejak September 2007 dan dilanjutkan hingga Mei 2009. Penelitian diselenggarakan di Laboratorium Embriologi Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor; serta Laboratorium Stem Cell, Stem Cell and Cancer Institute, Jakarta.
Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 kali pengulangan. Sebagai perlakuan adalah 2 konsentrasi conditioned medium yaitu CM yang belum dikonsentratkan (1x-CM) dan CM yang telah dikonsentratkan hingga 10 kali (10x-CM). Volume yang digunakan yaitu 5% (untuk 10x-CM) dan 50% (untuk 1x-CM).
Metode Penelitian Kultur primer sel syaraf
Kultur primer sel syaraf dilakukan sesuai petunjuk dari Bentz et al (2006) dan Zhang et al (2006) dengan sedikit modifikasi. Bagian hemisfer serebri mencit usia 2 hari diisolasi dalam larutan Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) (Gibco, USA) yang mengandung CaCl22H2O 0.89 mM (Merck), MgSO47H2O 0.49 mM (Merck), Penicillin 50 U/ml, Streptomycin 50 mg/ml (Sigma, USA), dan fetal bovine serum (FBS) (Gibco, USA) 1%. Kemudian dengan menggunakan pipet Pasteur didapatkan suspensi sel. Suspensi sel dibiarkan mengendap selama 1 menit, kemudian supernatan ditampung ke dalam tabung dan disentrifus dengan kecepatan 200 g selama 1 menit. Setelah pelet didapat, kemudian sel dikultur. Medium kultur yang digunakan adalah Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) highglucose (Sigma, USA) yang telah ditambahkan nonessential amino acids (NEAA) 1 % (Sigma, USA), Penicillin 50 U/ml, Streptomycin 50 mg/ml, β- mercaptoethanol 0.1 mM (Sigma, USA), dan FBS 10%. Sel dikultur dengan kepadatan 32 x 103 sel tiap 2 cm2, dalam culture flask 12.5 cm2 (BD, USA) dan diinkubasi pada 37 0C; 5% CO2. Medium kultur diganti setiap 2 hari. Berdasarkan
penelitian pendahuluan, setelah hari ke-4 akan terlihat adanya pertumbuhan neuron bipolar dan neural progenitor cell (NPC). Selain itu, juga terlihat adanya pertumbuhan sel-sel fibroblas. Kemudian sel-sel astrosit akan teramati ketika periode kultur diperpanjang. Sel akan mengalami konfluensi setelah 12 hari kultur.
Pembuatan Conditioned Medium (CM)
Pembuatan CM yang dikonsentratkan dan pengukuran konsentrasinya dilakukan menurut petunjuk Sandra et al (2005). Pada hari ke-8, medium kultur primer syaraf diganti dengan medium kultur tanpa penambahan FBS dan diinkubasi. Setelah 48 jam, medium dikoleksi dari tiap flask untuk kemudian dikonsentratkan dan dilakukan pengukuran konsentrasi protein. Medium yang telah dikoleksi kemudian ditampung dan dikonsentratkan hingga 10 kali dengan menggunakan Centricon plus 20® (10K NMWL, UFC2 LGC02, Milipore, USA), untuk selanjutnya disentrifus pada 4000 g; 4 0C selama 10 menit. Dengan tipe membran Centricon plus 20® yaitu 10K nominal molecular weight limit (NMWL), maka protein yang tertahan memiliki berat molekul lebih dari 10 kDa, yang kemudian akan diukur konsentrasinya. Konsentrasi protein diukur baik terhadap CM yang dikonsentratkan maupun yang tidak. Pengukuran konsentrasi dilakukan dengan menggunakan Quick Start Bradford Protein Assay (500-0201, Bio-Rad, USA). Selanjutnya, pembacaan nilai absorbansi dari larutan standar dan 2 macam sampel CM dilakukan dengan menggunakan Microplate Reader pada
= 595 nm, sehingga didapatkan konsentrasi proteinnya adalah 490 μg/ml (untuk 1x-CM) dan 2615 μg/ml (untuk 10x-CM). Kedua macam CM yang telah dikoleksi disimpan pada suhu -80 0C.
Superovulasi mencit dan koleksi blastosis
Superovulasi dilakukan menurut petunjuk Nagy et al (2003). Mencit betina galur ddy yang berumur 8-12 minggu disuperovulasi dengan penyuntikan hormon Pregnant Mare’s Serum Gonadotrophin (PMSG, Folligon, Intervet, Holland) dengan dosis 7.5 IU/ekor dan 46-48 jam kemudian disuntik dengan human Chorionic Gonadotrophin (hCG, Chorulon, Intervet, Holland) dengan dosis 7.5
IU/ekor secara intraperitoneal. Setelah penyuntikan hCG, mencit betina dikawinkan dengan pejantan dengan perbandingan jantan:betina = 1:1. Mencit betina yang telah dikawini pejantan dicirikan oleh adanya sumbat vagina pada 18 jam pasca hCG dan dianggap sebagai hari pertama kebuntingan. Mencit betina dikorbankan pada 96-98 jam pasca hCG dengan cara cervicalis dislocation. Blastosis diperoleh dengan cara membilas (flushing) kedua kornua uterus dengan menggunakan spuit 1 cc (Terumo, Philippines) yang berisi medium DPBS yang telah ditambahkan FBS 1%. Selanjutnya embrio dicuci di dalam larutan DPBS, kemudian dipindahkan ke dalam medium kultur dan diinkubasi pada 37 0C; 5% CO2. Medium kultur yang digunakan adalah DMEM high glucose yang ditambahkan NEAA 1%, Penicillin 50 U/ml, Streptomycin 50 mg/ml, 0.1 mM β- mercaptoethanol, dan FBS 10%.
Isolasi Inner Cell Mass (ICM)
Isolasi ICM dilakukan menurut petunjuk Nagy et al (2003) dengan beberapa modifikasi. Blastosis yang terkoleksi dihilangkan zona pelusidanya dengan enzim pronase 0.25% (Sigma, USA) selama 5 menit, kemudian blastosis dipindahkan ke dalam medium DPBS + FBS 1% untuk menghentikan pronase. Selanjutnya blastosis tanpa zona dicuci dalam DPBS tanpa serum sebanyak dua kali dan dilanjutkan di cuci dalam DMEM tanpa serum. Isolasi ICM dilakukan dengan metode immunosurgery. Blastosis diinkubasi dalam rabbit anti mouse serum 25% (Sigma, USA) selama 20 menit. Selanjutnya blastosis diinkubasi dalam guinea pig complement 25% (Sigma, USA) selama 20 menit. Untuk mendapatkan metode immunosurgery yang optimal, maka dilakukan optimasi inkubasi serum dan komplemen terlebih dahulu, sehingga sel-sel trofoblas dapat terlisiskan tanpa merusak ICM. Setelah ICM didapat, selanjutnya dipindahkan ke dalam medium DMEM kultur.
Kultur mouse Embryonic Stem Cell (mESC)
Kultur mESC dilakukan menurut petunjuk dari Zhang et al (2006). ICM yang telah diisolasi dikultur dalam medium ESC yaitu DMEM highglucose yang telah mengandung NEAA 1%, Penicillin 50 U/ml, Streptomycin 50 mg/ml, β-
mercaptoethanol 0.1 mM, FBS 10%, dan mouse leukemia inhibitory factor 20 ng/ml (LIF) (Sigma). ICM dikultur di dalam petri 3.5 cm (Nunc, Denmark) yang telah dilapisi gelatin 0.1%, sebanyak 50 koloni ICM tiap petri. ICM diinkubasi pada 37 0C; 5% CO2 dan medium diganti setiap 2 hari. Perkembangan koloni primer diobservasi untuk mendapatkan informasi mengenai kemampuan proliferasi dari ICM.
Diferensiasi mESC menjadi neuron dengan Conditioned Medium
Pada hari ke-8 kultur, koloni primer yang telah berproliferasi diganti mediumnya dengan medium perlakuan yaitu 50% untuk 1x-CM dan 5% untuk 10x-CM, yang telah ditambahkan ke dalam medium fresh untuk kultur yaitu DMEM high glucose, NEAA 1%, Penicillin 50 U/ml, Streptomycin 50 mg/ml, dan β-mercaptoethanol 0.1 mM. Medium perlakuan diganti setiap 2 hari dan dikultur selama 7 hari. Setelah 7 hari, kultur sel siap untuk diisolasi RNA totalnya.
Isolasi RNA total
Prosedur isolasi RNA total dari kultur sel dan hemisfer serebri menggunakan Tripure (Roche Applied Science, Basel, Switzeerland) sesuai petunjuk dari produsen. Untuk kultur sel, sebelumnya dilakukan pembilasan menggunakan PBS dingin sebanyak 2 kali untuk menghilangkan sisa medium kultur. Selanjutnya dapat dilanjutkan tahap homogenisasi.
1. Homogenisasi
Sebanyak 100 mg hemisfer serebri mencit usia 2 hari diambil. Jaringan dihancurkan dengan menumbuk dengan mortar dan pestle, dalam 1 ml Tripure. Untuk kultur sel, setelah dibilas dengan PBS dingin, sel dihancurkan menggunakan cell scraper dalam 1 ml Tripure untuk tiap sampel. Setelah jaringan dan sel terhancurkan dengan homogen, homogenate ditransfer ke dalam tube 1.5 ml dan ditutup dengan rapat, dan digoyang dalam greytory shaker selama 5 menit dalam suhu 15-25 0C untuk mendisosiasi kompleks nukleoprotein secara sempurna.
2. Separasi berdasarkan fase
Ke dalam homogenat ditambahkan 200 μl kloroform dan ditutup dengan rapat kemudian dikocok kuat-kuat dengan tangan selama 15 detik, diinkubasi dalam suhu ruang selama 4 menit. Sampel disentrifugasi pada 12000 g selama 11 menit pada 2-8 0C. Setelah sentrifugasi, campuran sampel terseparasi menjadi tiga fase. RNA terdapat pada fase aqueus di bagian paling atas.
3. Presipitasi RNA
Fase aqueus (cairan bening) pada bagian teratas dipindahkan ke dalam tabung baru. Volume larutan ini sekitar 300 μl. RNA dipresipitasi menggunakan isopropil alkohol dengan perbandingan 1:1, didiamkan dalam suhu ruang selama 10 menit kemudian disentrifugasi dalam suhu 2-8 0C pada 12000 g selama 11 menit. RNA akan terpresipitasi membentuk pelet putih di dasar tabung, lalu supernatan dibuang.
4. Pencucian RNA
Pelet RNA dicuci dengan etanol 75% sebanyak 1 ml. Setelah divorteks, larutan disentrifugasi dalam suhu 2-8 0C pada 8000 g selama 15 menit.
5. Pelarutan RNA
Pada akhir dari prosedur ini, etanol dibuang dan RNA dikeringkan secara perlahan dengan teknik air dry selama 10 menit. RNA dilarutkan dengan elution buffer sebanyak 50-100 μl dalam pemanas bersuhu 55-60 0C. Setelah diambil sebanyak 5 μl untuk pengukuran dengan spektrofotometer, RNA kemudian disimpan dalam suhu -80 0C. Prosedur isolasi ini tidak menggunakan DNAse.
Pengukuran RNA total yang didapat dengan spektrofotometer
RNA yang didapat dari proses isolasi dijaga integritasnya dengan sesedikit mungkin melakukan freezing dan thawing. Untuk itu sebelum dimasukkan freezer, 5 μl aliquot dari RNA total yang diisolasi diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm, dengan pengenceran sebanyak 20 kali, menggunakan faktor konversi RNA yaitu 40 dan diukur rasionya terhadap DNA pada panjang gelombang 280 nm. Hanya RNA berkualitas baik, utuh, dan
memiliki rasio A260/A280 > 1,8 digunakan untuk konversi ke complementary DNA (cDNA).
Pengenceran yang dipakai adalah 20 kali sehingga konsentrasi RNA total dapat dihitung dengan rumus berikut:
Konsentrasi RNA =
konsentrasi A260 nm x faktor konversi x pengenceran x 1 ng/ μl
Konversi RNA total menjadi cDNA
Penelitian ini menggunakan metode two step reversed-transcript polymerase chain reaction (RT-PCR) dimana RNA yang didapat dari isolasi terlebih dulu diubah menjadi cDNA dalam proses reversed transcript. RNA dikonversi menjadi cDNA menggunakan enzim transkriptor kit avian myeloblastosis virus (AMV) sesuai petunjuk produsen (Promega, Wisconsin, IL). Sebanyak 10-50 ng/μl RNA total ditambah dengan 2 μl primer random hexamer dengan konsentrasi 600 unit/μl dan 9 μl air. Campuran diinkubasi selama 10 menit dalam suhu 65 0C. Enzim ini merupakan produk gen dari RNA genom virus AMV. Bentuk yang aktif secara enzimatis merupakan subunit α, ββ, dan αβ. Bentuk αβ merupakan subunit paling aktif memiliki aktivitas RNA-directed DNA polymerase.
Kemudian ditambahkan ke dalam setiap tube sebanyak 7 μl campuran yang terdiri dari buffer AMV 5x, RNAse inhibitor 20 unit, dNTP 20 mM, dan enzim AMV reverse transcriptor sebanyak 10 unit, menghasilkan volume akhir sebanyak 20 μl. Campuran ini diinkubasi selama 1 jam dalam suhu 42 0C.
Reaksi Polymerase Chain Reaction (PCR)
Reaksi PCR dijalankan menggunakan PCR Go-taq Flexi sesuai petunjuk produsen (Promega, Madisson, WI). Ke dalam tabung mikro dimasukkan 5 μl buffer TaqPol 1x, 1.5 mM MgCl2, 0.5 μl dNTP mix, 0.5 μM primer forward dan reverse baik untuk beta aktin ataupun nestin, Go-taq Pol 1 unit, dan air hingga volume mencapai 23 μl. Ditambahkan 2 μl cDNA.
Sekuens primer untuk nestin diperoleh dari publikasi Zhang et al tahun 2006 yang telah dikonfirmasi dengan Blast dari National Institute of Health (NIH). Sekuens nestin adalah 5’-GGAGTGTCGCTTAGAGGTGC-3’ (forward),
5’-TCCAGAAAGCCAAGAGAAGC-3’ (reverse) (327 bp). Sedangkan sekuens beta aktin adalah 5’-GAGAAGATCTGGCACCACACCT-3’ (forward), dan 5’-CAGGATTCCATACCCAAGAACC-3’ (reverse) (580 bp).
Reaksi PCR yang dilakukan adalah 94 0C selama 5 menit dilanjutkan 94 0C selama 30 detik, 60 0C selama 30 detik, 72 0C selama 30 detik, dan 72 0C selama 4 menit. Keseluruhan reaksi PCR dijalankan sebanyak 30 siklus.
Visualisasi hasil dengan gel elektroforesis dan gel documentation system G-box (Syngene, UK)
Produk PCR diseparasi dalam 2% gel agarose dengan elektroforesis. Elektroforesis dijalankan pada voltase 50 volt selama 30 menit dilanjutkan 100 volt selama 30 menit. Hasilnya segera difoto dengan G-box gel documentation system. Setting yang digunakan adalah G-box cheluminescence menggunakan laminator ultraviolet untuk sampel yang mengandung etidium bromida, dengan resolusi 400 dpi.
Analisis hasil digital G-box
Data yang diperoleh dari pembacaan genetools (Syngene, UK) untuk nestin dirasiokan terhadap data yang terbaca dari beta aktin menghasilkan data pengukuran semikuantitatif. Hanya produk PCR dengan pita tunggal dan sesuai untuk estimasi berat molekul produk sekitar 300 bp yang dianalisis.
Densitometer kemudian mengukur intensitas cahaya masing-masing pita yang terbaca dari gel untuk setiap gen beta aktin dan nestin. Metode pengukuran semikuantitatif ekspresi nestin dirasiokan terhadap housekeeping gene beta aktin. Dengan demikian hasil pembacaannya merupakan unit rasio ekspresi gen nestin terhadap gen yang terekspresi secara universal dalam setiap jenis sel yaitu beta aktin.
Analisis Data
Data yang diperolah dari hasil pembacaan dengan G-box untuk masing- masing pita ekspresi nestin dirasiokan terhadap data yang terbaca dari betaaktin, sehingga menghasilkan data pengukuran semikuantitatif. Data hasil perkembangan mESC dijelaskan secara deskriptif.