BOGOR
2009
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Diferensiasi Embryonic Stem Cells Mencit menjadi Neuron menggunakan Conditioned Medium adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka.
Bogor, Agustus 2009
Riris Lindiawati Puspitasari NRP B151060051
menjadi Neuron menggunakan Conditioned Medium. Dibimbing oleh ARIEF BOEDIONO dan FERRY SANDRA
Embryonic stem cells (ESCs) merupakan sel pluripoten yang mampu untuk berproliferasi dan berdiferensiasi menjadi berbagai tipe sel penyusun tubuh. Potensi tersebut telah diyakini sangat bermanfaat dalam pengobatan penyakit degeneratif. Kemampuannya untuk berdiferensiasi hingga saat ini masih terus dikaji. Penelitian ini dilakukan untuk mempelajari tingkat diferensiasi ESCs menjadi neuron secara in vitro dengan menggunakan conditioned medium (CM) tanpa melalui pembentukan embryoid bodies (EB). ESCs mencit dikultur dalam medium dengan penambahan 20 ng/ml Leukemia inhibitory factor (LIF) selama 8 hari hingga terbentuk outgrowth. CM berasal dari supernatan kultur primer sel syaraf. Digunakan 2 konsentrasi CM yaitu 1x-CM (CM tidak dikonsetratkan) dan 10x-CM (CM dikonsentratkan hingga 10 kali). ESCs dikultur dalam petri yang telah dilapisi gelatin selama 7 hari hingga berdiferensiasi. Ekspresi nestin diketahui melalui metode 2 steps reversed transcript polymerase chain reaction (RT-PCR). Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan 10x-CM ke dalam medium mampu menginduksi pertumbuhan neural-like cells (NLC) dengan persentase sebesar 8.83 ± 3.06. Hasil PCR memperlihatkan adanya perbedaan ekspresi gen nestin pada tiap sampel. Sementara itu, medium dengan penambahan 1x-CM belum mampu menginduksi terbentuknya NLC. Dengan demikian, penambahan CM yang dikonsentratkan hingga 10 kali dapat mengarahkan perkembangan ESCs mencit menjadi NLC tanpa melalui pembentukan EB.
Kata kunci: embryonic stem cells mencit, conditioned medium, nestin, diferensiasi neuron
differentiation of mouse embryonic stem cells. Under direction of ARIEF BOEDIONO and FERRY SANDRA
Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent cells having capability in extensive proliferation while maintaining their potential to differentiate into various cells. Therapeutic potential of these cells is promising, however there is still insufficient ability in inducing the differentiation. In this study we examined the effect of conditioned medium that contained many inducing factors in direct differentiation of mouse ESCs (mESC) into neural cells without embryoid bodies formation. Mouse ESCs were cultivated in culture with supplementation of 20 ng/ml Leukemia inhibitory factor (LIF) to form outgrowth within 8 days. Mouse ESCs were induced with neural-cells-primary-culture-conditioned-medium. We used two concentrations of conditioned medium (CM), 1x-CM and 10x-CM. The mESCs were cultured on gelatin coated dishes in both of treatments for 7 days to differentiate. The expressions of nestin were analyzed by two steps RT-PCR. Based on result, 10x-CM increased the percentage of neural-like cells outgrowth 8.83 ± 3.06 and also nestin level expression. Mean while the treatment with 1x- CM gave no neural morphology at all. In conclusion, 10x-CM had effect on neural differentiation from mESCs.
Keywords: mouse embryonic stem cells, conditioned medium, nestin, neural differentiation
RIRIS LINDIAWATI PUSPITASARI. Diferensiasi Embryonic Stem Cells Mencit menjadi Neuron menggunakan Conditioned Medium. Dibimbing oleh ARIEF BOEDIONO dan FERRY SANDRA
Stem cell atau yang juga dikenal dengan istilah sel punca, merupakan sel yang dapat berproliferasi dengan mempertahankan sifat tidak terdiferensiasi. Sel punca diprediksi memegang kunci untuk pengobatan beberapa penyakit degeneratif yang pada saat ini tidak dapat disembuhkan dengan pengobatan konvensional, misalnya pada penyakit Alzheimer, Parkinson, diabetes dan jantung. Salah satu jenis sel punca yang telah banyak diteliti adalah Embryonic Stem Cell (ESC). ESC dihasilkan dari inner cell mass (ICM) yang terdapat pada embrio blastosis. ESC memiliki beberapa karakter diantaranya dapat dipertahankan untuk tetap tidak berdiferensiasi secara in vitro dan dalam kondisi tertentu dapat berdiferensiasi menjadi berbagai tipe sel yang menyusun tubuh.
Propagasi ESC untuk dapat berdiferensiasi menjadi sel tipe tertentu dipengaruhi oleh beberapa faktor yang diregulasi oleh mediator pertumbuhan yang sesuai. Secara in vitro, ESC dapat diarahkan perkembangannya menjadi sel neuron dan sel glia. Interaksi antara sel-sel dan kondisi lingkungan mikro dapat mempengaruhi diferensiasi ESC ataupun sel-sel prekursor baik secara in vitro maupun in vivo. Selain itu, pengarahan ESC menggunakan conditioned medium (CM) juga memungkinkan dikarenakan CM dapat menyediakan faktor-faktor penginduksi neuron. CM merupakan medium yang dikoleksi dari kultur primer sel tertentu setelah dikultur selama beberapa hari.
Conditioned medium dari kultur primer sel syaraf mengandung sejumlah faktor pertumbuhan antara lain nerve growth factor (NGF), glial derived- neurotrophic factor (GDNF), nestin, dan glial fibrillary acidic protein (GFAP). Pada umumnya tahapan untuk mendiferensiasikan ESCs adalah melalui pembentukan embryoid bodies (EB) terlebih dahulu. EB merupakan agregat sel yang terdiri atas sel-sel ektodermal, mesodermal, dan endodermal. Metode diferensiasi ESC mencit menjadi sel neuron dengan menggunakan CM secara tunggal dan tanpa melalui tahapan EB belum dilaporkan. Oleh karena itu tujuan penelitian ini adalah untuk mempelajari pengaruh penggunaan CM dari kultur primer sel syaraf secara tunggal (tanpa penambahan GF eksternal), terhadap tingkat pengarahan ESC mencit menjadi sel neuron.
Penelitian ini menggunakan inner cell mass (ICM) dari blastosis mencit sebagai sumber ESCs. ICM yang berhasil dikoleksi kemudian dikultur dalam medium ESCs dengan penambahan 20 ng/ml LIF. ICM dikultur pada petri yang telah dilapisi gelatin. Penggunaan LIF dimaksudkan agar ESCs tidak berdiferensiasi. Setelah 8 hari, koloni ESCs dikultur dalam medium diferensiasi sebagai perlakuan. Perlakuan yang digunakan adalah 2 konsentrasi CMyaitu CM yang belum dikonsentratkan (1x-CM) dan CM yang telah dikonsentratkan hingga sepuluh kali (10x-CM). Konsentrasinya berturut-turut adalah 490 μg/ml dan 2615
μg/ml. CM berasal dari supernatan kultur primer sel syaraf setelah dikultur selama 8 hari. Volume yang digunakan yaitu 50% (untuk 1x-CM) dan 5% (untuk 10x- CM). Parameter perkembangan ICM yang diamati adalah attachment rate,
polymerase chain reaction (RT-PCR).
Keseluruhan blastosis yang diperoleh berjumlah sekitar 400 embrio. Dengan memberikan kondisi kultur yang sama maka terlihat adanya sejumlah perkembangan dari embrio. Kemampuan ICM untuk melekat ke dasar petri (attachment rate) adalah 73.5 ± 2.52% dan 72.5 ± 4.43%. Attachment rate diobservasi pada 24 dan 48 jam setelah penanaman. ICM yang melekat selanjutnya akan tumbuh dan berkembang membentuk koloni primer. Perkembangan koloni primer ditandai dengan bertambahnya diameter koloni seiring bertambahnya hari pengamatan. Hingga hari ke-8, koloni primer yang terbentuk yaitu 66 ± 7.66% dan 67 ± 5.29%. Pada koloni primer, stem cell tumbuh dan berkembang membentuk multilayer. Selain itu juga terlihat adanya pertumbuhan sel ke arah samping koloni atau outgrowth. Sebanyak 66 ± 7.66% dan 66 ± 4.90% koloni dapat berkembang membentuk outgrowth.
Pada tahap diferensiasi, sel neuron yang tumbuh diidentifikasi sebagai neural-like cells (NLC) dikarenakan pengujian lanjutan seperti imunositokimia untuk menentukan tipe atau jenis sel yang tumbuh tidak dilakukan. Secara visual, NLC tumbuh di area tepi dari koloni dan beberapa sel memiliki neurit yang saling berhubungan satu dengan lainnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada sampel dengan penambahan 1x-CM tidak menunjukkan adanya pertumbuhan NLC. Hal yang berbeda tampak pada sampel dengan penambahan 10x-CM. Sebanyak 8.83 ± 3.06% NLC teramati di bagian outgrowth, sehingga dapat dikatakan bahwa penambahan 10x-CM lebih mampu menginduksi terbentuknya NLC dari mESC. Kemampuan tersebut dikarenakan CM yang telah dikonsentratkan hingga sepuluh kali memiliki kandungan faktor-faktor yang berperan optimal untuk mengarahkan perkembangan mESC menjadi NLC. Lebih lanjut, conditioned medium dari kultur primer syaraf mengandung sejumlah faktor yang penting bagi perkembangan ESC menjadi sel neuron seperti nerve growth factor (NGF), glial derived-neurotrophic factor (GDNF), fibroblast growth factor-2 (FGF-2), dan glial fibrillary acidic protein (GFAP).
Isolasi RNA total dari tiap sampel dilakukan setelah kultur diferensiasi berusia 7 hari. Hasil isolasi memperlihatkan bahwa RNA total dari tiap sampel terdapat pada kisaran 29.80 ng/μl hingga 90.40 ng/μl. Sebagai kontrol positif terhadap nestin adalah jaringan otak yang memiliki RNA total dengan konsentrasi 90.40 ng/μl. Setelah RNA total didapat maka dilakukan konversi ke cDNA. Untuk mendeteksi ekspresi dari gen target, sebelumnya dilakukan optimasi terhadap primer agar didapatkan hasil pembacaan pita tunggal dan spesifik. Berdasarkan hasil PCR, dapat dikatakan bahwa pemilihan primer sudah cukup spesifik sehingga produk yang dinilai intensitasnya menghasilkan pita tunggal sebesar 327 bp untuk nestin.
Hasil pembacaan PCR mengkonfirmasi bahwa sampel dengan penambahan 1x-CM tidak menghasilkan pita. Sedangkan pada sampel dengan penambahan 10x-CM terlihat bahwa nestin terekspresi dengan intensitas pita yang bervariasi. Namun demikian, level ekspresi nestin dari tiap sampel memiliki nilai yang cukup mirip. Sebagai kontrol pembanding digunakan beta aktin. Setelah setiap gel
rasio nestin/beta aktin dengan jumlah koloni yang berdiferensiasi pada sampel maka didapat nilai rasio ekspresi per koloni berkisar pada 0.04.
Berdasarkan penelitian dapat disimpulkan bahwa conditioned medium yang dikonsentratkan hingga sepuluh kali (10x-CM) dapat menunjang diferensiasi ESC mencit menjadi neural-like cells. Selain itu diferensiasi ESC mencit menjadi NLC dapat dilakukan tanpa melalui pembentukan embryoid bodies.
Kata kunci: embryonic stem cells mencit, conditioned medium, nestin, diferensiasi sel neuron
© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2009 Hak cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebut sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
RIRIS LINDIAWATI PUSPITASARI
Tesis
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Magister Sains pada
Program Studi Sains Veteriner
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. drh. Arief Boediono, Ph.D Ferry Sandra, DDS, Ph.D, LFIBA, CIPM
Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Sains Veteriner
Dr. drh. Bambang Pontjo P., M.S. Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.
Alhamdulillah, segala puji untuk Allah SWT atas berkat, rahmat, izin, dan pertolongan-Nya sehingga penelitian dan penulisan tesis ini dapat diselesaikan.
Terima kasih sebesar-besarnya penulis haturkan kepada:
1. Prof. drh. Arief Boediono, Ph.D selaku ketua komisi pembimbing, untuk waktu, dedikasi pemikiran, dan dukungan moral untuk penulis dalam menyelesaikan proses akademis di Program Studi Sains Veteriner Sekolah Pascasarjana IPB.
2. Ferry Sandra, DDS, Ph.D, LFIBA, CIPM selaku anggota komisi pembimbing untuk waktu, dedikasi pemikiran, dukungan moral dan material dalam menempuh proses akademis di Program Studi Sains Veteriner Sekolah Pascasarjana IPB.
3. dr. Boenjamin Setiawan, Ph.D yang telah membuka jalan dan motivasi bagi penulis untuk melanjutkan studi ke jenjang yang lebih tinggi.
4. Ahmad R. Utomo, Ph.D selaku peneliti di Stem Cell and Cancer Institute yang dengan suka rela turut memberikan solusi dalam proses pengerjaan penelitian.
5. Dr. Novik Nurhidayat selaku peneliti di Pusat Penelitian Biologi LIPI yang dengan suka rela bersedia memberikan solusi demi terselesaikannya penelitian ini.
6. Dr. drh. Hj. Ita Djuwita, M.Phil selaku kepala Laboratorium Embriologi dan Terpadu FKH IPB yang telah memberikan kesempatan dan menyumbangkan pemikiran kepada penulis selama proses penelitian. 7. Staf pengajar, staf administrasi, dan rekan-rekan di Laboratorium
Embriologi untuk bimbingan dan kerjasamanya dalam keseluruhan proses akademis.
8. Rekan-rekan di Stem Cell and Cancer Institute atas dukungan selama penulis menyelesaikan studi di FKH IPB.
9. Keluarga dan sahabat, pendamping dan motivator terbaik di setiap kesempatan sehingga tesis ini dapat diselesaikan.
Bogor, Agustus 2009
dari pasangan Sukamto dan Asmijati. Pendidikan sarjana ditempuh di Jurusan Biologi FMIPA Universitas Indonesia, lulus pada tahun 2004. Pada tahun 2006, penulis berkesempatan melanjutkan studi ke program magister pada Program Studi Sains Veteriner Sekolah Pascasarjana IPB.
Penulis bekerja sebagai Research Assistant di Stem Cell and Cancer Institute Jakarta sejak tahun 2006. Penulis tergabung dalam divisi Cancer.
Selama menyelesaikan studi, penulis menjadi anggota Asosiasi Sel Punca Indonesia. Sebuah artikel telah diterbitkan dengan judul Kultur embryonic stem cell menjadi sel neuron dengan medium bebas serum, pada jurnal Cermin Dunia Kedokteran tahun 2008.
DAFTAR TABEL………. xvi DAFTAR GAMBAR……… xvii PENDAHULUAN Latar Belakang………. 1 Tujuan Penelitian………. 3 Manfaat Penelitian………... 3 TINJAUAN PUSTAKA Stem Cell……….. 4 Diferensiasi Embryonic Stem Cells………... 6 Conditioned Medium………... 7 Neural Stem Cell………. 8
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian………... 12 Rancangan Percobaan………... 12 Metode Penelitian
Kultur Primer Sel Syaraf……….. 12 Pembuatan Conditioned Medium (CM)………... 13 Superovulasi Mencit dan koleksi Blastosis……….. 13 Isolasi Inner Cell Mass (ICM)……….. 14 Kultur Mouse Embryonic Stem Cell (mESC)………... 14 Diferensiasi mESC menjadi Sel Neuron dengan CM……….. 15 Isolasi RNA total……….. 15 Pengukuran RNA total dengan spektrofotometer……… 16 Konversi RNA total menjadi cDNA……… 17 Reaksi Polymerase Chain Reaction (PCR)……….. 17 Visualisasi hasil dengan gel elektroforesis dan G-box……… 18 Analisis hasil digital G-box……….. 18 Analisis Data………. 19
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kultur Primer Sel Syaraf………. 20 Conditioned medium……… 23 Kultur ESC Mencit……… 25 Diferensiasi ESC Mencit menjadi Sel Neuron……….. 27 Ekspresi Nestin………... 30 Potensi 10x-CM dalam Diferensiasi mESC Mencit menjadi Neuron 33
KESIMPULAN DAN SARAN………... 34 DAFTAR PUSTAKA……….. 35
Halaman
1. Perkembangan ICM dalam kultur……….... 26 2. Karakter koloni yang berdiferensiasi………...……… 28 3. Hasil isolasi RNA total dari sampel………. 30 4. Hasil rasio ekspresi nestin terhadap beta aktin pada sampel 10x-CM…….. 32
1. Potongan sagital otak mencit dengan area neurogenesis………. 9 2. Skema perkembangan neural stem cell……… 10 3. Perkembangan sel syaraf dalam kultur………. 22 4. Hasil pengukuran konsentrasi CM……… 24 5. Perkembangan ICM selama kultur ESC………... 25 6. Beberapa neural-like cells yang teramati……….. 29 7. Hasil gel elektroforesis sampel 10x-CM………. 31
ICM Inner Cell Mass CM Conditioned Medium NPC Neural Progenitor Cell mESC Mouse Embryonic Stem Cell bFGF basic Fibrolast Growth Factor NGF Nerve Growth Factor
GDNF Glial Derived-Neurotrophic Factor GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein EGF Epidermal Growth Factor ASC Adult Stem Cell
HSC Hematopoietic Stem Cell MSC Mesenchymal Stem Cell CNS Central Nervous System
EB Embryoid Bodies
SVZ Subventricular Zone
OB Olfactory Bulb
NSC Neural Stem Cell PNS Peripheral Nervous System NMWL Nominal Molecular Weight Limit
PMSG Pregnant Mare’s Serum Gonadotrophin hCG human Chorionic Gonadotrophin DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium FBS Fetal Bovine Serum
LIF Leukemia Inhibitory Factor
RT-PCR Reversed-Transcript Polymerase Chain Reaction AMV Avian Myeloblastosis Virus
NGF Nerve Growth Factor NLC Neural-Like Cell
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Stem cell atau yang juga dikenal dengan istilah sel punca, merupakan sel yang dapat berproliferasi dengan mempertahankan sifat tidak terdiferensiasi. Dengan stimulasi sinyal-sinyal tertentu, stem cell dapat dipicu untuk berubah menjadi jenis sel yang lain. Istilah stem cell tidak terbatas pada sel yang berasal dari embrio. Jaringan dewasa, termasuk sumsum tulang, plasenta maupun darah tali pusat dapat menjadi sumber alternatif stem cell. Stem cell diprediksi memegang kunci untuk pengobatan beberapa penyakit degeneratif yang pada saat ini tidak dapat disembuhkan dengan pengobatan konvensional, misalnya pada penyakit degeneratif seperti Alzheimer, Parkinson, diabetes dan jantung. Beberapa pengobatan yang tersedia untuk penyakit tersebut cenderung panjang dan umumnya tidak dapat menyembuhkan penyakit tersebut. Hal tersebut mendorong peneliti untuk mengusahakan kemungkinan-kemungkinan perbaikan fungsi organ secara lebih spesifik, elegan, dan tidak invasif misalnya dengan menggunakan stem cell (Mattson et al 2002 dan Atmosukarto 2005).
Salah satu jenis stem cell yang telah banyak diteliti adalah embryonic stem cell (ESC). Embryonic stem cell dihasilkan dari inner cell mass (ICM) yang terdapat pada blastosis dan memiliki beberapa karakter diantaranya dapat dipertahankan untuk tetap tidak berdiferensiasi secara in vitro, serta dalam kondisi tertentu dapat berdiferensiasi menjadi berbagai tipe sel yang menyusun tubuh. Aplikasi ESC untuk terapi penyakit neurodegeneratif terbukti bermanfaat meskipun masih dalam tahap penelitian pada hewan coba.
Propagasi ESC untuk dapat berdiferensiasi menjadi sel tipe tertentu dipengaruhi oleh beberapa faktor yang diregulasi oleh mediator pertumbuhan yang sesuai. Secara in vitro, ESC dapat diarahkan perkembangannya menjadi sel glia (Bouhon et al 2005) dan neuron (Zhang et al 2006). Bentz et al (2006) mengemukakan bahwa interaksi sel-sel dan kondisi lingkungan mikro dapat mempengaruhi diferensiasi ESC ataupun sel-sel prekursor baik secara in vitro maupun in vivo. Selain itu, Zhang et al (2006) menyatakan bahwa pengarahan ESC menggunakan conditioned medium (CM) juga memungkinkan dikarenakan
CM mengandung faktor-faktor penginduksi neuron sebagai hasil sekresi dari kultur primer. CM merupakan medium yang dikoleksi dari kultur primer sel tertentu setelah dikultur selama beberapa hari. Ding dan Schultz (2004) menambahkan bahwa stem cell fate ditentukan oleh regulator intrinsik dan lingkungan ekstraseluler (microenvironment). Konsep pentingnya peranan microenvironment dikemukakan oleh Shihabuddin et al (2000) yang menyatakan bahwa neural progenitor cell (NPC) yang ditransplantasikan ke area yang sedang mengalami neurogenesis mampu berdiferensiasi menjadi neuron yang fungsional. Berbagai riset telah dilakukan untuk menggali lebih dalam mengenai penggunaan CM. Dengan melakukan purifikasi protein yang terkandung di dalam CM, maka diharapkan spektrum protein yang ada menjadi lebih sempit sehingga protein target dapat terdeteksi. Salah satu metode awal untuk melakukan purifikasi protein yang terkandung dalam CM yaitu dengan melakukan pemekatan, misalnya dengan menggunakan Centricon plus 20® (Sipione et al 2006 dan Lin et al 2008). Centricon plus 20® menerapkan prinsip ultrafiltrasi, sehingga hanya protein berberat molekul lebih dari 10 kDa yang akan tertahan. Dasar pemilihan Centricon dengan cut off 10 kDa adalah bahwa sejumlah faktor yang berkontribusi terhadap diferensiasi mouse ESC (mESC) menjadi neuron memiliki berat molekul bervariasi antara lain basic fibrolast growth factor (bFGF) (17 kDa), FGF-2 (18- 24 kDa) (Giordano et al 1991), nerve growth factor (NGF) (26 kDa) (Kitazawa dan Shimizu 2005), glial derived-neurotrophic factor (GDNF) (50 kDa) (Hoefen et al 2004 dan Yue et al 2006), dan glial fibrillary acidic protein (GFAP) (55 kDa) (Moghadasali et al 2007). Dengan demikian, diharapkan faktor-faktor tersebut yang tertahan setelah dilakukan proses pemekatan.
Sejauh ini, penggunaan CM sebagai faktor untuk mendiferensiasikan stem cell umumnya dikombinasikan dengan penggunaan growth factor eksternal antara lain epidermalgrowthfactor (EGF) (Zhang et al 2006) dan bFGF (Moghadasali et al 2007). Selain itu juga dikemukakan bahwa salah satu tahapan untuk mendiferensiasikan stem cell adalah melalui pembentukan embryoid bodies (EB) terlebih dahulu. EB merupakan agregat sel yang terdiri atas sel-sel ektodermal, mesodermal, dan endodermal (Ding dan Schultz 2004). Metode diferensiasi mESC menjadi neuron dengan menggunakan CM secara tunggal dan tanpa
melalui tahapan EB belum dilaporkan. Oleh sebab itu perlu adanya studi yang mengkaji metode alternatif untuk mendiferensiasikan mESC menjadi neuron.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk mempelajari pengaruh penggunaan CM dari kultur primer sel syaraf secara tunggal (tanpa penambahan GF eksternal), terhadap tingkat pengarahan ESC mencit menjadi neuron.
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat menyumbangkan informasi mengenai pengembangan metode diferensiasi ESC mencit menjadi sel-neuron. Selain itu komponen conditioned medium dapat dikaji lebih lanjut guna mendapatkan kandidat protein yang berperan dalam diferensiasi mESC menjadi neuron.
TINJAUAN PUSTAKA
Stem CellStem cell atau stem cell, diprediksi memegang kunci untuk pengobatan beberapa penyakit yang pada saat ini tidak dapat disembuhkan dengan pengobatan konvensional. Berkat kemajuan medis yang sifatnya preventif dan terapetik, umur rata-rata masyarakat modern pun cenderung meningkat. Hal ini mendorong munculnya penyakit degeneratif seperti Alzheimer, Parkinson, diabetes dan penyakit jantung yang menjadi beban sangat besar dalam sistem kesehatan (Mattson et al 2002). Beberapa pengobatan yang tersedia untuk penyakit tersebut dirasakan belum optimal. Pengobatan yang ada umumnya bersifat mengelola kondisi pasien demi memperbaiki kualitas hidupnya. Kondisi yang diderita tetap harus dimonitor untuk jangka waktu panjang, sehingga pada akhirnya akan menjadi beban finansial yang berat. Hal tersebut mendorong peneliti untuk mencari alternatif metode pengobatan dengan menggunakan stem cell (Atmosukarto 2005).
Selama bertahun-tahun para peneliti mencari dan mencoba memahami mengapa sebagian sel dan organ tubuh manusia mampu memperbaiki diri sedangkan sel dan organ lainnya tidak. Saat ini pencarian tersebut difokuskan pada bidang stem cell. Stem cell merupakan hasil penelitian dasar di bidang biologi yang diperkirakan dapat membawa terobosan yang besar di bidang kedokteran. Stem cell adalah jenis sel khusus yang memiliki kemampuan membentuk ulang dirinya dan pada saat bersamaan dengan pacuan yang tepat mampu membentuk diri menjadi sel yang terspesialisasi (NIH 2001). Sel-sel tersebut merupakan kumpulan sel yang dapat ditemukan pada semua tahap perkembangan mulai dari masa embrio preimplantasi hingga masa dewasa. Terdapat dua kelompok utama stem cell menurut sumbernya yaitu yang diisolasi dari inner cell mass embrio dan yang diisolasi dari berbagai jaringan dewasa (Denham et al 2007).
Pada tahun 1981, telah dilaporkan bahwa Evans dan Kaufman berhasil mengisolasi stem cell dari embrio mencit. Stem cell ini disebut embryonic stem cell (ESC). Untuk mendapatkannya mereka melakukan pembedahan mikro pada
bagian inner cell mass (ICM) dari blastosis mencit. Sel-sel tersebut merupakan sel-sel yang belum berdiferensiasi, dapat berproliferasi selama periode yang tak terbatas dalam kultur, dan dapat diinduksi untuk berdiferensiasi menjadi berbagai tipe sel dengan fungsi khusus sehingga bersifat pluripoten. Sementara itu penggunaan ESC dalam dunia klinis sampai saat ini belum dapat tercapai mengingat kontroversi etis masih melingkupinya. Namun demikian tidak menutup