Mikropropagasi pada Media Padat dan Cair dengan Eksplan yang Berbeda Eksplan yang digunakan berupa pucuk, buku dan buku kotiledon dari kecambah in vitro biji pamelo ‘Nambangan’ yang buahnya diperoleh dari kebun percobaan Cikabayan-IPB. Percobaan dilakukan dengan membandingkan laju multiplikasi tunas dan pertumbuhannya dari 3 macam eksplan tersebut pada 3 jenis media perlakuan. Media perlakuan terdiri atas media dasar MS dengan penambahan 0.5 mg L-1 BAP dan 0.5 mg L-1 Kinetin. Media cair dan media padat digunakan dalam percobaan ini. Kultur tunas pada media padat diinkubasi di ruang bersuhu 25-27 °C dan pencahayaan lampu TL selama 16 jam per hari dengan intensitas cahaya 500-1500 lux, sedangkan kultur tunas pada media cair diletakkan di atas shaker dengan kecepatan sekitar 100 rpm dengan pencahayaan lampu TL selama 24 jam perhari dengan intensitas cahaya 1000-1500 lux pada ruang bersuhu 25-27 °C.
Rancangan percobaan yang diterapkan adalah Rancangan Acak Lengkap 2 faktor yaitu jenis eksplan dan zat pengatur tumbuh. Setiap perlakuan terdiri atas 6 ulangan, dan setiap ulangan terdiri atas 2 eksplan. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah tunas, jumlah daun dan tinggi tanaman setiap minggu selama 6 minggu.
Induksi Perakaran In vitro
Eksplan yang diinduksi perakarannya berasal dari tunas hasil multiplikasi yang telah memiliki 2 buku dengan tinggi tunas sekitar 2 cm. Media induksi perakaran yang digunakan adalah setengah konsentrasi media dasar MS dengan dan tanpa penambahan 0.5 mg L-1 IBA dan 0.5 mg L-1 NAA.
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan satu faktor, yaitu media perlakuan. Setiap perlakuan terdiri dari 10 ulangan, setiap ulangan/ botol berisi 2 eksplan. Peubah yang diamati meliputi tinggi tanaman, jumlah daun, jumlah akar dalam setiap minggu dan jumlah buku, panjang akar, morfologi akar yang terbentuk pada akhir pengamatan pada minggu ke enam. Aklimatisasi
Masing-masing 16 planlet pamelo hasil induksi perakaran in vitro dengan 3 jenis media yang berbeda, ditanam dalam pot berdiameter 8 cm dengan media tanam steril yang terdiri atas pasir : cocopeat : tanah : sekam bakar dengan perbandingan 2:2:1:2. Planlet disungkup selama 2 minggu pertama pertumbuhan.
48
Pertumbuhan planlet diamati setiap minggu selama 4 minggu dengan menghitung jumlah planlet yang mampu bertahan hidup.
Sambung Mikro Tunas Hasil Perbanyakan In vitro dan Tunas Hasil Perlakuan Kolkisin dengan batang bawah JC
Penyambungan dilakukan antara tunas in vitro pamelo berumur 6 minggu dengan batang bawah JC yang berasal dari perkecambahan biji secara invitro dan berumur 4 minggu.
Tunas pamelo dipotong pucuknya sepanjang 2 buku untuk digunakan sebagai batang atas. Batang bawah hasil perkecambahan JC dibuang bagian tunas pucuknya, disisakan batang sepanjang sekitar 3 cm di atas kotiledon. Ujung batang atas dipotong menyerupai huruf V sedangkan batang bawah disayat bagian tengah sepanjang 0.3 cm. Batang atas kemudian disisipkan pada batang bawah dengan bantuan pinset. Tanaman hasil sambung mikro ini kemudian ditanam pada media RMAN (Lampiran 1) dengan penambahan 25 dan 30 gL-1 sukrosa.
Pengamatan terhadap parameter pertumbuhan tanaman hasil sambung mikro dilakukan pada minggu ke 4, 6 dan 8. Parameter yang diamati adalah jumlah tunas jumlah buku batang atas, jumlah daun batang atas, jumlah tunas batang bawah dan jumlah akar. Uji t dilakukan untuk melihat pengaruh perbedaan konsentrasi sukrosa.
Anatomi daerah pertautan diamati dengan cara membuat sayatan melintang batang dengan mengiris tipis jaringan batang dengan menggunakan pisau silet setipis mungkin, hasil irisan diamati dengan mikroskop stereo (Leica EZ4HD) dan mikroskop cahaya (Olympus BHC). Gambar diambil dengan dinoeye dan digabungkan dengan program stitching membentuk penampang melintang batang yang utuh. Tunas hasil perlakuan kolkisin (diploid, miksoploid dan tetraploid) masing-masing satu tunas disambung dengan batang bawah JC dan diamati pertumbuhannya sampai minngu kelima.
Hasil dan Pembahasan
Mikropropagasi pada Media Padat dan Cair dengan Eksplan yang Berbeda Rataan pertambahan jumlah tunas, jumlah daun dan tinggi tanaman pada media padat dan cair setiap minggu sampai minggu ke enam ditampilkan pada Gambar 21, 22 dan 23. Pada minggu pertama, jumlah tunas dan jumlah daun pada media cair tampak sudah mulai bertambah sedangkan pada media padat baru terlihat pertambahan pada minggu kedua kultur. Hal ini sesuai dengan sifat media cair yang mampu diserap lebih baik oleh eskplan sehingga respon pertumbuhannya lebih cepat, namun respon yang baik tersebut tidak berlanjut hingga minggu keenam. Hal ini membuktikan kelemahan penggunaan media cair. Eksplan yang terendam secara terus-menerus pada media cair mengalami hyperhydricity atau vitrifikasi yang menyebabkan terhambatnya regenerasi tunas (Cabbason et al. 1997). Tunas yang terbentuk pada eksplan buku dan buku kotiledon pada media cair bahkan tidak bertambah tinggi (Gambar 23).
49
\
Gambar 21. Rataan jumlah tunas aksilar pamelo dari 3 jenis eksplan pada media padat dan cair setiap minggu
50
Gambar 22. Rataan jumlah daun pamelo dari 3 jenis eksplan pada media padat dan cair setiap minggu
51
Gambar 23. Rrataan tinggi tanaman pamelo dari 3 jenis eksplan pada media padat dan cair setiap minggu
Hasil analisis ragam pada data pertumbuhan minggu keenam menunjukkan pengaruh jenis eksplan dan media terhadap jumlah tunas, jumlah daun dan tinggi tanaman. Faktor yang berpengaruh nyata adalah jenis eksplan sedangkan jenis media tidak berpengaruh nyata (Tabel 9). Buku kotiledon merupakan jenis eksplan yang paling sesuai untuk perbanyakan tunas pada semua jenis media perlakuan termasuk kontrol (MS0), karena mampu menghasilkan 2.3-2.5 tunas pada media padat dan 1.7-2.0 tunas pada media cair (Gambar 24). Hasil tersebut didukung oleh penelitian Naik et al. (2000) yang menunjukkan bahwa eksplan
52 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
MS0 padat 0.5B padat 0.5K padat
jumlah tunas
aksilar
media
pucuk buku buku kotiledon
bc bc ab a a a a c c
terbaik untuk perbanyakan in vitro delima adalah buku kotiledon. Perbanyakan C. tangerina menghasilkan 5 tunas pada media yang mengandung 0.002 mg L-1 BAP ditambah 0.1 mg L-1 NAA dengan eksplan terbaik adalah buku kotiledon (Nwe et al. 2014). Perbanyakan C. volkameriana dan C. aurantium menghasilkan 2.94 dan 3.70 tunas pada media yang mengandung 0.5 mg L-1 BAP(Tavano et al. 2009) dengan eksplan terbaik juga buku kotiledon.
Eksplan buku kotiledon juga menghasilkan jumlah tunas dan daun terbanyak (Gambar 24 dan 25) serta tanaman tertinggi (Gambar 26) pada semua jenis media padat dan cair termasuk kontrol pada minggu keenam. Eksplan tunas pucuk pada kultur cair tidak menghasilkan tunas aksilar yang baru namun eksplan hanya memanjang sehingga tinggi tanaman bertambah.
Tabel 9. Analisis ragam pengaruh jenis eksplan dan media terhadap jumlah tunas, jumlah daun dan tinggi tanaman pamelo pada minggu keenam No Parameter
pengamatan
Signifikansi parameter pada media Eksplan Media Eksplan x Media padat cair padat cair padat cair
1 Jumlah Tunas ** ** ts ts ts ts
2 Jumlah Daun ** ** ts ** ts ts
3 Tinggi Tanaman ** ** ** ** ts ts
** = sangat nyata, ts=tidak signifikan
Gambar 24. Rataan jumlah tunas aksilar pamelo yang dihasilkan pada media perbanyakan padat dan cair dengan 3 jenis eksplan pada kultur 6 minggu 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
MS0 cair 0.5B cair 0.5K cair
ju mlah tu n a s aksilar media
pucuk buku buku kotiledon c a a b a a a c c
53 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
MS0 padat 0.5B padat 0.5K padat
juml a h da un media
pucuk buku buku kotiledon
a d cd bcd a a abc bcd ab 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
MS0 cair 0.5B cair 0.5K cair
juml a h da un media
pucuk buku buku kotiledon
a d c d a b a bc a 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
MS0 padat 0.5B padat 0.5K padat
ti nggi ta na ma n (c m) media
pucuk buku buku kotiledon
cd f e f ab abc a de bcd
Gambar 25. Rataan jumlah daun pamelo yang dihasilkan pada media perbanyakan padat dan cair dengan 3 jenis eksplan pada kultur 6 minggu.
Gambar 26. Rataan tinggi tanaman pamelo yang dihasilkan pada media perbanyakan padat dan cair dengan 3 jenis eksplan pada kultur 6 minggu
Ketiga jenis eksplan berasal dari satu biji pamelo yang diikecambahkan secara in vitro dan dipotong menjadi 3 bagian. Tunas baru pada media padat muncul dari titik meristem ketiga jenis ekaplan dan bahkan area bekas potongan pada eksplan buku dan buku kotiledon (Gambar 27). Tunas apikal gugur, diikuti tumbuhnya tunas aksilar dari buku-buku batang tunas pucuk (Gambar 27A). Hal tersebut sesuai dengan teori tentang penghilangan dominansi apikal menyebabkan tunas aksilar tumbuh dan berkembang (George dan Sherrington 1984). Kemampuan eksplan buku dan buku kotiledon membentuk tunas adventif pada
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
MS0 cair 0.5B cair 0.5K cair
tinggi tanaman
media
pucuk buku buku kotiledon
a cd cd d bc cd cd cd ab
54
area bekas potongan menyebabkan kedua eksplan tersebut menghasilkan tunas yang lebih banyak dibandingkan eksplan tunas pucuk (Gambar 27B dan 27C).
Gambar 27. Tunas pamelo yang dihasilkan pada 3 jenis eksplan pada media padat umur 6 minggu setelah tanam pada media 0.5B padat. (A. Eksplan tunas pucuk; B. Eksplan buku tunas dan C. Eksplan buku kotiledon). Bar = 1 cm (A dan B), bar = 1.5 cm (C).
Perkembangan tunas yang baik pada media padat, tidak terjadi pada media cair hingga minggu keenam (Gambar 28). Gejala hyperhydricity terlihat jelas pada eksplan tunas pucuk yang menghasilkan daun lebar dan tebal (Gambar 28A). Gejala hyperhydricity yang lain berupa penghambatan pertumbuhan tunas. Hiperhydricity terjadi juga pada tanaman berkayu lainnya seperti teh yang dikultur pada media cair yang mengandung sitokinin jenis Thidiazuron (Sandal et al. 2001). Batang bawah apel juga diperbanyak dengan kultur cair menggunakan BAP dan metode kultur diperbaiki dengan Temporary Immersion System (Zhu et al. 2005). Prinsip perendaman sesaat tersebut juga dilakukan pada C. deliciosa, dan terbukti mendorong perkembangan embrio somatik menuju fase kotiledon (Cabasson et al. 1997), sehingga metode perendaman sesaat dapat diterapkan pada perbanyakan tunas pamelo secara massal.
Gambar 28. Tunas pamelo yang dihasilkan pada 3 jenis eksplan pada media cair umur 6 minggu setelah tanam pada media MS0, 0.5B dan 0.5K (kanan-ke kiri). A Eksplan tunas pucuk; B. Eksplan buku tunas dan C. Eksplan buku kotiledon.
Induksi Perakaran In vitro
Semua jenis media perakaran mampu menginduksi akar pada minggu kedua. Pengamatan pada minggu keenam menunjukkan bahwa media dasar ½ MS dan penambahan 0.5 mg L-1 IBA mampu menginduksi terbentuknya akar pada 75% tunas, dan 100% tunas berakar dengan penambahan 0.5 mg L-1 NAA (Tabel 10). Hal ini membuktikan bahwa pengurangan konsentrasi hara makro menjadi setengahnya dan penambahan auksin dapat mendorong terbentuknya akar.
A B C
55
Tabel 10. Persentase terbentuknya akar, jumlah akar dan panjang akar pamelo pada umur kultur 6 minggu pada media perakaran yang berbeda
Media perakaran Tunas yang membentuk akar (%)
Kisaran jumlah akar setiap tunas (helai)
Kisaran panjang akar setiap tunas (cm)
½ MS 75 1 2.5-8.5
½ MS + 0.5 IBA 75 1-2 3-8
½ MS + 0.5 NAA 100 1-6 0.3-2.0
Analisis ragam pada parameter yang diamati menunjukkan bahwa ketiga jenis media induksi perakaran yang digunakan, memberikan pengaruh nyata pada parameter jumlah buku, daun, akar dan panjang akar, dan tidak berpengaruh pada tinggi tunas pada akhir pengamatan (Tabel 11). Media dasar ½ MS tanpa penambahan auksin dan dengan penambahan 0.5 mg L-1 IBA menghasilkan akar yang panjang namun jumlahnya sedikit sedangkan penambahan 0.5 mgL-1 NAA menghasilkan akar yang lebih pendek dengan jumlah lebih banyak .
Pengurangan konsentrasi hara makro pada media mendorong tunas membentuk akar untuk memenuhi kebutuhan tanaman untuk tumbuh. Auksin umum digunakan untuk induksi akar tunas in vitro dan bekerja sinergis dengan sitokinin dalam proses pertumbuhan tanaman. Dalam penelitian ini penggunaan IBA lebih baik dalam menginduksi akar dibandingkan dengan NAA. Akar yang diinduksi oleh NAA terlihat tidak normal karena tidak tumbuh memanjang namun membesar seperti bengkak (Gambar 29). Hal ini terjadi karena NAA juga mampu menginduksi pembentukan kalus sehingga perlu penurunan konsentrasi NAA pada media induksi perakaran in vitro. Jenis pamelo lain menggunakan 0.1-0.2 mgL-1NAA untuk induksi perakaran (Begum et al. 2004, Ibrahim 2012) dan menggunakan ½ MS yang ditambahkan IBA 0.5 mgL-1 (Goh et al. 1995).
Tabel 11. Pengaruh jenis media perakaran terhadap tinggi tanaman, jumlah buku, jumlah daun, jumlah akar dan panjang akar tunas pamelo pada minggu keenam
Media perlakuan Tinggi tanaman Jumlah buku Jumlah daun Jumlah akar Panjang akar ½ MS 2.1 a 2.7 a 4.6 a 0.7 b 4.1 a ½ MS + 0.5 IBA 2.0 a 1.9 b 5.3 a 0.8 b 4.5 a ½ MS + 0.5 NAA 1.8 a 1.6 b 2.9 b 1.8 a 1.3 b
Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata
56
Gambar 29. Akar hasil induksi perakaran in vitro tunas pamelo selama 6 minggu pada media induksi perakaran. A. ½ MS; B. ½MS + 0.5 mgL-1 IBA; C. ½ MS+0.5 mgL-1 NAA (bar = 2mm).
Aklimatisasi
Keberhasilan proses aklimatisasi dipengaruhi hasil induksi perakaran in vitro. Tanaman yang mampu bertahan hidup sampai minggu keempat pada proses aklimatisasi, adalah tanaman yang diinduksi perakaran dengan menggunakan media ½ MS. Hampir semua tanaman masih tumbuh baik sampai minggu kedua, dan terus menurun mencapai 75% pada minggu keempat (Gambar 30), terus tumbuh dan berkembang sampai umur 8 minggu (Gambar 31). Hal ini menunjukkan bahwa akar yang panjang dan ramping, sesuai untuk perkembangan tunas, sedangkan akar yang pendek dan besar, tidak mampu mendukung pertumbuhan tunas pada lingkungan ex vitro.
Gambar 30. Persentase planlet pamelo yang bertahan hidup pada proses aklimatisasi sampai umur 4 minggu, dari 3 jenis media induksi perakaran in vitro.
Gambar 31. Tunas pamelo yang berasal dari media perakaran ½ MS pada umur 4 minggu (A) dan 8 minggu (B) dalam media aklimatisasi
0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 % planlet yang bertahan hidup minggu 1/2 MS 1/2 MS + 0.5 IBA 1/2 MS + 0.5 NAA
A
B
A B C A B C57 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4 6 8 Jumlah Buku
Umur Kultur (minggu)
sukrosa 25 sukrosa 30 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4 6 8 Jumlah Daun
Umur Kultur (minggu)
sukrosa 25 sukrosa 30
Sambung Mikro Tunas Hasil Perbanyakan In vitro dan Tunas Hasil Perlakuan Kolkisin dengan Batang Bawah JC
Pada penelitian ini, batang atas berhasil tumbuh dengan baik dilihat dari pertambahan jumlah buku dan jumlah daun (Gambar 32A dan 32B). Batang bawah yang dipotong tunas pucuknya menghasilkan tunas samping karena penghilangan dominansi apikal (Gambar 33A). Diamati pula munculnya akar dari batang bawah pada minggu ke 4, 6 dan 8 (Gambar 33B).
Gambar 32. Pertumbuhan tunas pamelo hasil sambung mikro pada minggu ke 4, 6 dan 8 berdasarkan jumlah buku (A) dan daun (B) yang tumbuh pada batang atas.
Teknik sambung mikro yang diterapkan pada penelitian ini berhasil mendorong pertumbuhan batang atas dengan bertambahnya jumlah buku dan daun. Batang atas dapat tumbuh meskipun tidak menyerap langsung unsur hara makro dan mikro pada media. Penyerapan nutrisi terjadi dengan bantuan batang bawah yang bersentuhan langsung dengan media. Oleh karena itu pertumbuhan batang bawah berlangsung baik dengan terbentuknya tunas samping dan akar. Jumlah tunas samping batang bawah terbatas karena bersaing dengan pertumbuhan tunas apikal batang atasnya.
Gambar 33. Pertumbuhan tunas pamelo hasil sambung mikro pada minggu ke 4, 6 dan 8 berdasarkan jumlah tunas samping (A) dan akar (B) yang tumbuh pada batang bawah 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4 6 8 Ju mlah Tu n sa Samp in g
Umur Kultur (minggu)
sukrosa 25 sukrosa 30 A B A 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4 6 8 Ju mlah Akar
Umur Kultur (minggu)
sukrosa 25 sukrosa 30
58
Hasil uji t menunjukkan bahwa perbedaan konsentrasi sukrosa yang ditambahkan tidak menyebabkan pertumbuhan yang berbeda pada tunas sambung mikro (Tabel 12). Pemberian sukrosa dengan konsentrasi lebih rendah tidak mengganggu pertumbuhan tunas sambung mikro dan terbukti menghasilkan tunas samping dalam jumlah kecil sehingga batang atas masih dapat tumbuh baik. Peningkatan sukrosa meningkatkan keberhasilan sambung mikro pada C. sinensis dan C. reticulata, namun meningkatkan pula jumlah tunas samping yang tumbuh dari batang bawah (Naz et al. 2007). Pertumbuhan tunas samping pada batang bawah tidak diinginkan dalam penerapan teknik ini sehingga harus dibuang.
Tabel 12. Pertumbuhan tunas pamelo hasil sambung mikro pada minggu kedelapan. Konsentrasi sukrosa (gL-1) Persentase tumbuh (%)
Pertumbuhan Batang atas Pertumbuhan Batang bawah Jumlah
buku
Jumlah daun
Jumlah tunas Jumlah akar
Signifikansi uji t ts ts ts ts
25 100 2.38±0.52 2.13±0.93 1.00±0.93 1.875±0.83
30 100 2.00±0.76 2.13±0.89 0.75±0.89 1.875±0.83
ts=tidak signifikan
Gambar 34 dan 35 membuktikan terbentuknya berkas pembuluh gabungan yang menunjukkan bahwa pamelo ‘Nambangan’ kompatibel dengan batang bawah JC. Berkas pembuluh gabungan tersebut memungkinkan terjadinya aliran nutrisi yang telah diserap oleh akar batang bawah dari media menuju batang atas.
Gambar 34. Tunas pamelo hasil sambung mikro dan penampang sayatan melintang diamati dengan mikroskop stereo pada beberapa bagian A. Batang atas; B, C dan D. Area persambungan; E. Batang bawah (bar= 0.5 mm).
A C D B E A B C D E Bar = 2mm
59
Gambar 35. Penampang melintang sayatan batang JC, pamelo dan daerah persambungan, diamati dengan mikroskop cahaya dengan perbesaran 60 kali A. Batang atas; B. Batang bawah; C. Sambung mikro (E = Epidermis, K = Kortek, BP = Berkas Pembuluh, BA= Batang atas, BB =Batang Bawah, BPG = Berkas Pembuluh Gabungan, Ka= Kalus), Bar = 0.1 mm.
Tunas hasil perlakuan kolkisin terdiri atas tunas diploid, miksoploid dan tetraploid (Tabel 3). Tunas tetraploid yang dihasilkan dengan perlakuan kolkisin mengalami hambatan pertumbuhan. Teknik sambung mikro dapat membantu pertumbuhan tunas tersebut. Pengamatan pada minggu kedua dan kelima menunjukkan bahwa batang atas tumbuh dan membentuk daun baru bahkan tunas baru pada tanaman miksoploid (Gambar 36). Kainth dan Grosser (2010) berhasil menumbuhkan tunas pamelo tetraploid yang disambung mikro dengan batang bawah Trifoliate. E B K B
BB
E Ka K Ka BPBB
BA
BP BP C E K BP A60
Gambar 36. Sambung mikro pamelo diploid (A), miksoploid (B) dan tetraploid (C) dengan batang bawah JC, umur 2 minggu (atas) dan umur 5 miggu (bawah). (bar = 1 cm, = area persambungan).
Simpulan
Perbanyakan tunas pamelo ‘Nambangan’ dapat dilakukan secara in vitro, dan mampu menghasilkan bibit yang lebih banyak dari perkecambahan biji tunggalnya. Dari satu biji yang dikecambahkan secara in vitro dan dibagi menjadi 3 jenis eksplan, dapat dihasilkan 2.5 tunas dari eksplan buku buku kotiledon, 2.3 dari eksplan buku dan 1.3 dari eksplan pucuk. Perbanyakan in vitro ini menggunakan media dasar MS padat dengan atau tanpa penambahan 0.5 mg L-1 BAP atau 0.5 mg L-1 Kinetin. Induksi perakaran in vitro terbaik dilakukan pada media MS dengan unsur hara makro setengah dengan lama kultur 6 minggu, dan tetap hidup dan tumbuh hingga 75% pada proses aklimatisasi. Pamelo ‘Nambangan’ kompatibel dengan batang bawah JC sehingga teknik sambung mikro dapat membantu pertumbuhan tunas hasil perlakuan dengan kolkisin.