Dalam pelaksanaannya, penelitian ini dibagi dalam dua tahapan, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian lanjutan. Tahapan penelitian secara keseluruhan dapat dilihat pada Lampiran 1.
1. Penelitian pendahuluan
a. Penghitungan jumlah mikroba uji pada umur 24 jam (Metode Hitungan Cawan)
Penghitungan jumlah mikroba uji pada umur 24 jambertujuan untuk
mengetahui jumlah sel dari satu ose kultur mikroba, setelah ditumbuhkan selama 24 jam dalam 10 ml Nutrient Broth. Setelah diketahui jumlah sel mikroba dalam 10 ml Nutrien Broth, dapat ditentukan pengenceran yang perlu dilakukan untuk memperoleh sekitar 105 sel per ml media agar.
Kultur dari agar miring digores sebanyak satu ose dan dimasukkan ke dalam 10 ml NB steril, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ºC. Setelah waktu inkubasi tercapai, diambil 1 ml dan dipindahkan ke dalam 9 ml NB steril kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ºC. Setelah waktu inkubasi tercapai, diambil 1 ml dan dipindahkan ke dalam 9 ml larutan pengencer steril.
Seri pengenceran dibuat dari 1:101, 1:102, 1:103 hingga 1 : 108. Pada pengenceran ke-5, pengenceran ke-6, pengenceran ke-7 dan pengenceran ke-8, diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril kemudian dituang agar. Agar digoyang pelan supaya sel mikroba menyebar rata di dalam agar. Setelah agar membeku, diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 48 jam. Setelah waktu inkubasi tercapai, dilakukan penghitungan jumlah mikroba. Proses persiapan kultur mikroba secara rinci dapat dilihat pada Lampiran 2.
b. Ekstraksi komponen antimikroba secara ekstraksi tunggal
Tahap ini bertujuan untuk mengekstrak komponen antimikroba yang terdapat dalam biji jintan hitam. Ekstrak yang ingin diperoleh dari proses ekstraksi tunggal adalah ekstrak air, ekstrak etanol dan minyak atsiri. Ekstrak air dan ekstrak etanol akan diperoleh dari proses ekstraksi
menggunakan pelarut dengan metode refluks, sedangkan minyak atsiri akan diperoleh dari proses distilasi uap. Proses ekstraksi menggunakan pelarut air dan pelarut etanol dilakukan di Laboratorium Kimia Pangan, Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor, sedangkan destilasi uap dilakukan di Balai Tanaman Rempah dan Obat (Balitro), Bogor.
Setelah diperoleh ekstrak air, ekstrak etanol dan minyak atsiri, masing-masing ekstrak akan diuji aktivitas antimikrobanya dengan metode
difusi agar terhadap bakteri Staphylococus aureus, Escherichia coli,
Salmonella Typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, dan Bacillus cereus. Ekstrak yang menunjukkan aktivitas antimikroba yang baik, yaitu memiliki spektrum yang luas dan nilai diameter penghambatan yang besar,
akan diuji lanjut dengan penentuan nilai Minimum Inhibitory
Concentration (MIC) dan diidentifikasi komponen fitokimianya.
Metode refluks dilakukan dengan mengkontakkan bahan secara
langsung dengan pelarut, yaitu dengan memasukkan bahan dan pelarut ke
dalam tabung refluks. Sebelum tabung refluks yang berisi bahan dan
pelarut dipasang pada alat refluks, alat refluks dipanaskan mendekati suhu
titik didih pelarut. Untuk pelarut air, alat refluks dipanaskan hingga
mendekati suhu 100 oC (98-99 oC), sedangkan untuk pelarut etanol alat
refluks dipanaskan hingga mendekati suhu 70 oC (68-69 oC).
Pada saat suhu yang diinginkan sudah tercapai, tabung refluks yang
berisi bahan dan pelarut dipasang pada alat refluks. Pelarut akan
mengekstrak komponen antimikroba dari bahan. Pada saat titik didih pelarut tercapai, pelarut akan menguap. Untuk mengurangi kehilangan pelarut, kondensor dipasang di atas tabung refluks. Dengan demikian, saat pelarut yang menguap melewati kondensor yang dingin, pelarut tersebut akan jatuh kembali ke dalam tabung refluks.
Ekstraksi dengan metode refluks ini dilakukan dua kali. Ekstraksi
pertama dilakukan selama 3 jam, sedangkan ekstraksi kedua dilakukan selama 2 jam. Setelah waktu ekstraksi pertama tercapai (3 jam), tabung
refluks diangkat dan cairan yang diperoleh disaring dengan kertas saring dan dituang ke dalam botol. Ampas dimasukkan kembali ke dalam tabung
refluks untuk diekstrak kedua kalinya. Ampas ditambah pelarut dengan jumlah yang sama seperti pada ekstraksi pertama. Tabung refluks dipasang
kembali pada alat refluks dan dioperasikan selama 2 jam. Setelah waktu
refluks tercapai, cairan yang diperoleh disaring dan digabungkan dengan filtrat pertama.
Bahan yang digunakan dalam ekstraksi pertama dalam keadaan kering, sedangkan bahan yang digunakan pada ekstraksi kedua masih mengandung sebagian pelarut yang tersisa setelah ekstraksi pertama. Ratio bahan dan pelarut pada ekstraksi pertama adalah 1:3. Jumlah pelarut yang ditambahkan pada ekstraksi kedua sama dengan jumlah pelarut yang ditambahkan pada ekstraksi pertama sehingga ratio bahan dan pelarut pada ekstraksi kedua tidak tepat 1:3.
Setelah proses refluks selesai dilakukan dua kali, filtrat yang
diperoleh dikurangi jumlah pelarutnya dengan cara diuapkan
menggunakan rotavapor. Untuk filtrat air, penguapan pelarut dilakukan
pada suhu 50 oC, sedangkan untuk filtrat etanol, penguapan pelarut
dilakukan pada suhu 40-45 oC. Setelah di-rotavapor, sebagian pelarut
masih tertinggal dalam ekstrak sehingga dilakukan penghembusan gas N2
untuk menguapkan seluruh pelarut. Penghembusan gas N2 dilakukan
hingga ekstrak mencapai berat stabil, yaitu pengurangan bobot ekstrak kurang dari 0,001 g. Ekstrak yang diperoleh kemudian disimpan pada suhu kurang dari 4 oC (suhu refrigerator).
Air sangat sulit diuapkan seluruhnya dari ekstrak. Walaupun telah di-
rotavapor pada suhu 50 oC dan dihembus gas N2, belum semua kandungan
air dalam ekstrak menguap. Setelah dihembus gas N2 selama kurang lebih
3 jam, tidak diperoleh pengurangan bobot ekstrak yang cukup berarti. Oleh karena itu, khusus untuk ekstrak air, ekstrak yang digunakan tidak benar- benar pekat. Untuk mengetahui kepekatan ekstrak air secara kuantitatif, dilakukan pengukuran kadar air. Bagan proses ekstraksi tunggal menggunakan pelarut air dapat dilihat pada Gambar 8, sedangkan bagan proses ekstraksi tunggal menggunakan pelarut etanol dapat dilihat pada Gambar 9.
Ulangan
Direfluks dengan air (100 oC, 3 jam)
(100 ºC, 2 jam) ` Dipekatkan (50 oC) Dihembus N2
Disimpan dalam refrigerator (suhu 4oC) hingga proses analisis
Gambar 8. Diagram proses ekstraksi tunggal menggunakan pelarut air
Ulangan
Direfluks dengan etanol (70 oC, 3 jam)
(70 ºC, 2 jam) ` Dipekatkan (40-45 oC) Dihembus N2
Disimpan dalam refrigerator (suhu 4oC) hingga proses analisis
Gambar 9. Diagram proses ekstraksi tunggal menggunakan pelarut etanol
Ampas Filtrat
Ekstrak etanol Bubuk jintan hitam
Ampas Filtrat
Ekstrak air Bubuk jintan hitam
2. Penelitian Lanjutan
Penelitian lanjutan dilakukan dengan mengekstraksi komponen antimikroba secara ekstraksi bertingkat. Ekstraksi bertingkat dengan pelarut organik akan memisahkan komponen antimikroba dalam jintan hitam secara lebih spesifik dan komponen antimikroba akan lebih terkonsentrasi. Dengan ekstraksi secara bertingkat, diharapkan diperoleh konsentrasi komponen antimikroba yang lebih tinggi lagi pada masing-masing ekstrak.
Proses ekstraksi bertingkat dilakukan terhadap biji jintan hitam yang telah dihilangkan/diambil minyak atsirinya. Ampas hasil destilasi uap minyak atsiri diekstrak bertingkat secara refluks menggunakan tiga pelarut yang kepolarannya berbeda yaitu heksan, etil asetat dan metanol secara berurutan sehingga diperoleh ekstrak heksan, ekstrak heksan-etil asetat, dan ekstrak heksan-etil asetat-metanol. Selanjutnya, ekstrak heksan-etil asetat akan disebut sebagai ekstrak etil asetat dan ekstrak heksan-etil asetat- metanol akan disebut ekstrak metanol.
Teknik refluks secara ekstraksi bertingkat pada dasarnya sama dengan teknik refluks yang dilakukan secara ekstraksi tunggal. Untuk setiap pelarut, ekstraksi dilakukan dua kali. Ekstraksi pertama dilakukan selama 3 jam dan ekstraksi kedua dilakukan selama 2 jam. Bahan yang digunakan dalam ekstraksi pertama dalam keadaan kering, sedangkan bahan yang digunakan pada ekstraksi kedua masih mengandung sebagian pelarut yang tersisa setelah ekstraksi pertama. Ratio bahan dan pelarut pada ekstraksi pertama adalah 1:3. Jumlah pelarut yang ditambahkan pada ekstraksi kedua sama dengan jumlah pelarut yang ditambahkan pada ekstraksi pertama sehingga ratio bahan dan pelarut pada ekstraksi kedua tidak tepat 1:3. Setelah proses
refluks selesai dilakukan dua kali, filtrat yang diperoleh di-rotavapor untuk
mengurangi jumlah pelarutnya. Setelah di-rotavapor, filtrat dihembus gas
N2 untuk menguapkan seluruh pelarut. Ekstrak disimpan pada suhu 4 oC
(suhu refrigerator) sampai proses analisis. Ekstrak siap diuji aktivitas
antimikrobanya secara difusi agar. Selain itu, beberapa ekstrak terpilih akan diuji nilai MIC dan diuji secara kualitatif komponen fitokimianya.
Ulangan (60 ºC, 2jam)
Perbedaan antara proses refluks secara tunggal dan proses refluks
secara bertingkat terletak pada suhu yang digunakan saat refluks, suhu yang
digunakan saat rotavapor dan perlakuan terhadap bahan. Suhu yang
digunakan saat refluks adalah 60 oC dan suhu yang digunakan saat
rotavapor adalah 40 oC. Perbedaan perlakuan pada ekstraksi bertingkat adalah ampas bahan setelah ekstraksi tidak dibuang melainkan digunakan kembali untuk ekstraksi menggunakan pelarut yang lain. Setelah ekstraksi kedua, ampas dikering-anginkan minimal selama satu malam dan di-oven
vakum minimal selama 30 menit pada suhu 40 oC sebelum diekstrak
kembali menggunakan pelarut yang berbeda. Gambaran lebih sederhana mengenai proses ekstraksi bertingkat dapat dilihat pada Gambar 10.
Ulangan
Direfluks dengan pelarut heksan (60 oC, 3 jam)
(60 ºC, 2 jam)
`
Ulangan
Direfluks dengan etil asetat (60 oC, 3 jam) Dipekatkan (40-45 oC)
(60 ºC, 2 jam)
Direfluks dengan metanol Dipekatkan (40-45 oC) Dihembus gas N2
(60 oC, 3 jam)
Dipekatkan Dihembus gas N2
Dihembus gas N2 Ampas Filtrat Ekstrak heksan Ampas Filtrat Ampas Filtrat Ekstrak etil asetat Ekstrak metanol
Ampas hasil destilasi uap
Ekstrak etil asetat pekat
Ekstrak heksan pekat
Ekstrak metanol pekat
Suhu yang digunakan pada saat refluks menggunakan heksan adalah
60 oC dan suhu rotavapor yang digunakan untuk memekatkan ekstrak
tersebut adalah 40 oC. Ampas sisa ekstraksi menggunakan heksan tidak
dibuang, melainkan dikering-anginkan minimal selama semalam dan di-
oven vakum minimal selama 30 menit pada suhu 40 oC sebelum diekstrak
kembali menggunakan pelarut etil asetat. Ampas dikering-anginkan untuk menguapkan heksan dari ampas. Ampas di-oven vakum untuk benar-benar memastikan bahwa seluruh heksan sudah menguap dari ampas.
Suhu yang digunakan pada saat refluks menggunakan etil asetat adalah
60 oC dan suhu rotavapor yang digunakan untuk memekatkan ekstrak
tersebut adalah 40 oC. Ampas sisa ekstraksi menggunakan heksan tidak
dibuang, melainkan dikering-anginkan minimal selama semalam dan di-
oven vakum minimal selama 30 menit pada suhu 40 oC sebelum diekstrak
kembali menggunakan pelarut metanol. Tujuan ampas dikering-anginkan dan dioven vakum adalah untuk menguapkan etil asetat dari ampas. Suhu
yang digunakan pada saat refluks menggunakan metanol adalah 60 oC dan
suhu rotavapor yang digunakan untuk memekatkan ekstrak tersebut adalah
40 oC.