METODE PENELITIAN
3.3 Metode Penelitian .1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan jengkol, dikeringkan di ruangan terbuka tanpa terkena paparan sinar matahari, kemudian dirajang sampai terpotong kecil-kecil, lalu dihaluskan menggunakan blender sampai diperoleh serbuk daun tumbuhan Jengkol sebanyak 2000 g.
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuahan Jengkol
Serbuk kering halus daun tumbuhan Jengkol kemudian diidentifikasi dengan melakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna dengan cara memasukkan 10 gram serbuk daun jengkol yang telah dikeringkan kedalam gelas Erlenmenyer, kemudian ditambahkan 100 ml metanol lalu didiamkan setelah itu disaring dan dimasukkan kedalam tabung reaksi denganmenambahkan pereaksi FeCl3 5% menghasilkan larutan berwarna hitam.
3.3.3 Ekstrasi Daun Tumbuhan Jengkol
3.3.3.1 Ekstrasi Daun Tumbuhan Jengkol dengan Metanol
Serbuk kering halus daun tumbuhan Jengkol ditimbang sebanyak 2000 g, kemudian dimaserasi ±12 L hingga semua sampel terendam sambil diaduk- aduk dan dibiarkan selama 24 jam. Perendeman dilakukan secara berulang-ulang hingga ekstrak sampel dapat menunjukkan hasil negatif bila diuji dengan pereaksi FeCl3 5%.
Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator dan diuapkan diatas penangas air hingga seluruh pelarut metanol dan diperoleh ekstrak pekat metanol.
3.3.3.2Pemisahan Tanin
Pada ekstrak pekat metanol dari serbuk daun Jengkol dilakukan pemisahan tanin terlebih dahulu dengan cara melarutkan ekstrak pekat metanol dengan aquadest.
Ekstrak aquadest dipisahkan dengan cara penyaringan. Ekstrak aquadest yang diperoleh kemudian diekstraksi partisi dengan menggunakan etil asetat secara
berulang-ulang dimana terbentuk dua lapisan. Lapisan aquadest (lapisan bawah) dipisahkan dari lapisan etil asetat (lapisan atas), laludiuji dengan FeCl3 5% dan filtrat etil asetat dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan etil asetat lalu diuji dengan FeCl3 5%.
Ekstrak pekat etil asetat bebas taninkemudian dilarutkan dengan metanol dan diekstraksi partisi berulang-ulang dengan n-heksan hingga lapisan n-Heksan bening.
Lapisan metanoldipisahkan dari lapisan n-heksan, lalu diuji dengan FeCl3 5%dan dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol sebanyak 117,20 g.
3.3.4 Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fase diam silika gel 60 F254 Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari sistem dan perbandingan pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom. Fase gerak yang digunakan adalah campuran pelarut kloroform : metanol dengan perbandingan 90:10;80:20;70:30;60:40; 50:50 (v/v).
Sebanyak 10ml campuran larutan fase gerak kloroform : metanol 90:10 (v/v) dimasukkan kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT dan dimasukkan plat kedalam bejana yang telah berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi, dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Diamati noda yang terbentuk dibawah sinar UV, kemudian difiksasi dengan pereaksi FeCl3 5%. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut kloroform : metanol dengan perbandingan80:20;70:30;60:40;
50:50 (v/v).
3.3.5 Pemisahan Senyawa Fenolik dengan Kromatografi Kolom
Pemisahan senyawa fenolik dilakukan dengan kolom kromatografi terhadap ekstrak pekat metanol. Fase diam yang digunakan adalah silika gel 60 (70-230 mesh) dan fase gerak yaitu kloroform 100%, campuran pelarut kloroform : metanol dengan perbandingan 90:10; 80:20;70:30;60:40; 50:50 (v/v).
Dirangkai alat kromatografi kolom. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 60 (70-230 mesh) dengan menggunakan kloroform didalam gelas beaker, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan kloroform 100% hingga silika gel padat dan homogen.
Sebanyak 6 g ekstrak pekat metanol ditambahkan dengan pelarut metanol hingga larut dan ditambahkan dengan 23 g silika gel, lalu dikeringkan sampai berbentuk bubuk. Sampel kemudian di bungkus dengan kertas saring biasa dan dimasukkan kedalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, dielusi dengan eluen kloroform : metanol ( 90:10) v/v secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas.
Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak kloroform : metanol dengan perbandingan 80:20;70:30; 60:40 dan 50:50 (v/v). Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap ± 10 ml, kemudian di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan pereaksi FeCl3 5%. Kemudian diuapkan sampai terbentuk kristal.
3.3.6 Pemurnian
Senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi dengan kromatografi kolom dengan penggabungan dari fraksi 5-40 dan dilarutkan kembali dengan metanol lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah murni atau belum sekaligus mencari fasa gerak yang sesuai untuk KLT preparatif. Kloroform : Etil asetat 50:50 (v/v) adalah fase gerak yang menunjukkan pemisahan yang paling baik untuk selanjutnya digunakan untuk menjenuhkan bejana KLT preparatif. Sedangkan pasta yang telah dilarutkan ditotolkan dengan pipa kapiler secara perlahan-lahan dan sama rata disepanjang tepi bawah plat KLT.Plat dimasukkan kedalam bejana yang berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, kemudian ditutup. Setelah dielusi, plat dikeluarkan dari bejana, dikeringkandan hasilnya diamati dibawah sinar UV.
Tiap zona diberi tanda dan dikeruk laludielusi dengan campuran eluent metanol : etil asetat(1:1) v/v dan diuapkan sehingga diperoleh kristal berwarna kuning kecoklatan.Kemudian dilakukan pemurnian dengan menggunakan campuran eluent benzen : etil asetat.
3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F254 dengan fasa gerak kloroform : etil asetat 50:50 (v/v).
Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak kedalam bejana kromatografi lapis, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan metanol pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut kedalam bejana kromatografi lapis tipis dan dijenuhkan. Setelah pelarut fasa gerak naik sampai batas atas, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, diamati dibawah sinar UV, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl3 5% dan dihitung harga Rf yang diperoleh.
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer Ultra Violet Visible (UV-Vis) Analisis ini dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) UGM, Jl. Kaliurung Km. 4 Sekip Utara Yogyakarta dengan menggunakan pelarut metanol.
NamaAlat : Spektrofotometer UV-Visibel
Spesifikasi : Merek Shimadzu UV-1800
Waktupengerjaan : 30Agustus 2019 Teknisi Penanggungjawab : RochFitni
3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah(FT-IR)
Analisis dengan alat Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR) diperoleh dari Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) UGM, Jl. Kaliurung Km. 4 Sekip Utara Yogyakarta dengan menggunakan pelet KBr sebagai pelarut.
NamaAlat : Spektrofotometer FT-IR
Spesifikasi : Merek Shimadzu, Prastige 21 Waktupengerjaan : 30 Agustus 2019
TeknisiPenanggungjawab : RochFitni
3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Analisis dengan alat Spektrometer 1H-NMR diperoleh dari Laboratorium kimia organik Institut Tehnologi Bandung jl.Genesha 10 Bandung 40132 dengan menggunakan CD3OD sebagai pelarut.
NamaAlat : SpektrosfotometerNMR
Spesifikasi Alat : Merek Aglient, Frekuensi 500 MHz (1), Sistem Konsul DD2
Waktupengerjaan : 3 September 2019 Teknisi Penanggungjawab : Dr. ElviraHermawati