METODE PENELITIAN
3.3 Metode Penelitian .1 Persiapan .1 Persiapan
3.3.1.1 Persiapan Kandang dan Laboratorium
Persiapan kandang dimulai dengan pembersihan kotoran dan debu menggunakan pembersih lantai dan Bayclin® sebagai disinfektan, sedangkan seluruh peralatan seperti kotak dan botol dicuci dengan menggunakan air sabun dan Bayclin®. Botol-botol tersebut kemudian diisi dengan air minum yang diberikan kepada mencit. Kotak plastik juga diisi dengan kain perca agar dapat menyerap urin dan feses mencit di dalamnya dan agar mencit tidak kedinginan pada malam hari. Kandang dan kain perca yang digunakan dibersihkan setiap hari dengan menggunakan detergen dan disinfektan serta dikeringkan dengan cara dijemur.
Persiapan laboratorium untuk proses pembuatan sediaan histopatologi dan pengamatan yaitu dengan membersihkan dari kotoran dan debu. Kemudian alat yang digunakan untuk pengamatan juga dibersihkan agar mempermudah dalam penggunaan. Selain itu dilanjutkan dengan mendata bahan dan alat yang tersedia agar tidak terjadi kerusakan ataupun hilang dapat diketahui dengan cepat.
3.3.1.2 Persiapan Pakan dan Minum
Pakan yang diberikan berupa pelet komersial sebanyak ±5 gram/ekor/hari, jumlah ini sudah melebihi kebutuhan pakan seekor mencit setiap harinya. Penyimpanan pakan di tempat kering dengan membungkus dan membagi ke
dalam plastik transparan untuk memudahkan dalam pemberian pakan setiap harinya. Aqua® sebagai air minum diberikan secara ad libitum.
3.3.1.3 Adaptasi Mencit dan Pretreatment
Mencit yang digunakan dalam penelitian sebanyak 24 ekor yang terdiri dari 12 ekor mencit jantan dan 12 ekor mencit betina dengan rata-rata berumur 4 minggu dan mempunyai berat rata-rata ±18 gram. Mencit dimasukkan ke dalam kandang kotak plastik modifikasi dengan alas kain perca dan tutup kandang yang terbuat dari anyaman kawat dengan bingkainya terbuat dari kayu sehingga tidak melukai mencit (Gambar 6). Kandang diletakkan dalam ruangan dalam suhu ruangan yang memadai (27˚C) dengan dilengkapi ventilasi di kedua sisi kandang dan ditambah fan serta exhausefan untuk pertukaran udara. Mencit betina dan jantan diletakkan dalam kandang yang terpisah agar tidak terjadi perkawinan dan diberi label tiap kandangnya. Mencit diberi makan sebanyak 5 g/hari/mencit dan minum secara ad libitum. Adaptasi pada mencit dilakukan selama dua hari.
Gambar 7. Kandang Mencit
Setelah adaptasi selesai mencit diberi pretreatment dengan obat cacing albendazole dengan dosis 10 mg/kg BB. Setelah pemberian obat cacing, selama lima hari berturut-turut setelah itu mencit diberikan antibiotik Clavamox® 5 mg/kg BB. Terakhir, mencit diberikan antiprotozoa Flagyl® 10 mg/kg BB selama lima hari berturut-turut. Semua obat tersebut diberikan secara peroral
menggunakan sonde lambung. Selama masa pemeliharaan dan perlakuan, mencit diberi pakan sebanyak 5 gram/ekor/hari dengan air minum yang ad libitum.
3.4 Penelitian
3.4.1 Perlakuan Pada Kelompok Penelitian
Perlakuan yang dimaksud dalam penelitian ini merupakan pemberian ekstrak minyak jintan hitam. Selama masa perlakuan, mencit dibagi menjadi dua kelompok perlakuan yaitu kelompok jantan dan kelompok betina. Setiap kelompok baik jantan maupun betina dibagi lagi menjadi empat kelompok yang masing-masing kelompok terdiri atas 3 ekor mencit dan setiap kelompok diberikan perlakuan yang berbeda-beda dapat dilihat pada Tabel 7. Masa perlakuan ini berlangsung selama dua bulan yang dilakukan dengan cara pemberian peroral (cekok) Gambar 7.
Gambar 8 Pencekokan pada mencit dilakukan dengan cara menghandel mencit (A) kemudian mencit diposisikan agar mempermudahkan untuk dicekok (B) dan pencekokan menggunakan sonde lambung (C).
Penentuan dosis perlakuan yang diberikan pada mencit ditentukan dari pengkonfersian dosis anjuran penggunaan ekstrak minyak jintan hitam komersil untuk manusia ke mencit. Selama diberi perlakuan mencit diamati setiap harinya. Pengamatan harian dilakuan dengan tujuan mengamati total mencit yang hidup dan mencit yang mati. Setelah dua bulan berlangsungnya perlakuan, mencit dieuthanasi untuk diamati organ dalamnya terutama organ-organ yang berhubungan dengan sistem imun. Mencit dieuthanasi dengan cara dislokasio
atlanto occipitale menarik dari bagian leher ke kranial dan bagian bahu ke kaudal. Perlakuan dilaksanakan selama dua bulan dengan pertimbangan dari pemberian herbal yang tidak bisa menunjukan efek cepat seperti bahan kimia, namun diperlukan waktu agar efek pemberian ekstrak minyak jintan hitam terlihat.
Tabel 7 Kelompok Perlakuan pada Mencit Jantan dan Betina dalam Penelitian
Kelompok Perlakuan
Kontrol Cekok aqua sebanyak 0.1 ml/ekor/hari
Preventif Cekok habbatussauda sebanyak 0.1 ml/ekor/hari Kuratif Cekok habbatussauda sebanyak 0.2 ml/ekor/hari Habatussauda+Madu Cekok campuran habbatussauda+madu sebanyak 0.3
ml/ekor/hari
Ket: Perhitungan dosis penggunaan ekstrak minyak jintan hitam dan campuran dari ekstrak minyak jintan hitam dan madu dapat dilihat pada lampiran
Mencit yang telah dieuthanasi, dibuka bagian abdomennya dimulai dari hipogastrium hingga bagian symphysis pubis. Namun jika dalam waktu dua bulan masa perlakuan terdapat mencit yang mati maka mencit akan dinekropsi untuk didiagnosa penyebab kematian mencit tersebut.
3.4.2 Sampling Organ Limfoid Sekunder
Sistem imun organ yang menjadi fokus utama dalam penelitian ini adalah organ limfoid sekunder yang akan dijadikan preparat histopatologi yaitu limpa dan limfonodus. Organ-organ ini diambil setelah nekropsi dilakukan pada mencit. Organ-organ dalam mencit akan dijadikan preparat histopatologi untuk diambil data-datanya, yang akan menjadi bukti ilmiah tentang khasiat dari habatussauda. Organ seperti limpa dan limfonodus yang telah dipisahkan dengan organ lain kemudian disimpan di dalam sebuah wadah sampel yang berisi BNF 10%. Penyimpanan organ menggunakan BNF 10% ini dengan tujuan untuk mengawetkan organ sehingga organ tersebut masih dalam keadaan yang baik untuk dijadikan preparat. Setelah larutan berpenetrasi sempurna ke dalam organ, langkah selanjutnya adalah trimming (memilih bagian dari organ yang dijadikan preparat histopat). Proses trimming dilakukan dengan memotong tipis bagian yang
dipilih untuk pemeriksaan mikroskopis organ yang telah difiksasi, kemudian dipotong dengan ketebalan 0,5 cm.
3.4.3 Pembuatan Preparat Histopatologi
Pembuatan preparat histopatologi dimulai dengan tahap pemotongan organ yang telah difiksasi dengan ketebalan 0,5 cm dan kemudian ditempatkan pada tissue casset. Tissue casset diatur ke dalam tissue basket untuk proses dehidrasi dan direndam kembali di dalam larutan BNF 10% sampai diproses. Organ yang dijadikan preparat dipilih untuk digunakan dalam pengamatan, proses ini disebut proses trimming. Tahapan berikutnya dilakukan dehidrasi dengan cara merendam sediaan tersebut berturut-turut ke dalam alkohol 70%, 80%, 90%, 96%, alkohol absolut I, alkohol absolut II masing-masing selama 60 menit, kemudian clearing dalam larutan xylol I, xylol II dan xylol III masing-masing selama 40 menit, serta proses embedding dalam parafin I, II, III, dan IV dalam automatic tissue processor masing-masing selama 30 menit.
Tahapan selanjutnya adalah proses embedding atau penanaman jaringan ke dalam blok parafin. Jaringan diletakkan di tengah cetakan blok parafin yang telah diisi sedikit parafin cair. Setelah mulai membeku, parafin ditambahkan kembali sampai alat pencetak penuh, lalu dibiarkan sampai parafin mengeras dan blok disimpan di refrigerator sampai dipotong dengan mikrotom. Potongan organ awalnya dimasukkan ke dalam alat pencetak berisi parafin cair dengan memperhatikan posisi organ agar tetap berada di tengah blok parafin. Blok parafin dipotong dengan ketebalan 5µm dengan menggunakan mikrotom. Hasil pemotongan yang berbentuk pita (ribbon), diletakkan di atas permukaan air hangat (45˚C) pada waterbath dengan tujuan untuk menghilangkan lipatan akibat pemotongan. Sediaan diangkat dari permukaan air dengan gelas objek yang telah diulasi larutan albumin yang berfungsi sebagai perekat. Selanjutnya sediaan dikeringkan di dalam inkubator suhu 60˚C selama satu malam.
Tahap pewarnaan dilakukan dengan cara sediaan dimasukkan ke dalam xylol untuk dideparafinisasi sebanyak dua kali. Selanjutnya sediaan dilanjutkan dengan proses rehidrasi. Proses rehidrasi dimulai dari alkohol absolut sampai ke alkohol 80%, yang masing-masing lamanya dua menit. Setelah itu, sediaan dicuci
dengan air mengalir dan dikeringkan. Sediaan yang telah kering diwarnai dengan pewarnaan Mayer΄s Hematoksilin selama delapan menit, dibilas dengan air mengalir, dicuci dengan lithium karbonat selama 15-30 detik, dibilas dengan air, dan diwarnai dengan pewarna Eosin selama 2 menit. Selanjutnya, sediaan dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan warna Eosin yang berlebih sebelum akhirnya dikeringkan.
Setelah kering, sediaan dicelupkan ke dalam alkohol 90% sebanyak 10 kali celupan, alkohol absolut I sebanyak 10 kali celupan, alkohol absolut II selama 2 menit, xylol I selama satu menit, xylol II selama dua menit. Sediaan ditetesi perekat permount, ditutup dengan cover glass, dan dibiarkan kering sesuai dengan metode Bagian Patologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Sediaan siap dilihat dan setelah perekat kering diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya.
3.4.4 Pengamatan Preparat Histopatologi
Pengamatan histopatologi diawali dengan pemotretan menggunakan kamera fotografi mikro (digital eyepiece camera) untuk setiap preparat organ dari masing-masing perlakuan. Gambar yang diambil dari preparat yaitu dimulai dengan gambaran histopatologi preparat menggunakan mikroskop perbesaran 10x pada lensa okuler dan perbesaran 4x, 40x, dan 100x pada lensa objektif. Gambar yang telah diperoleh dilanjutkan dengan penghitung jumlah dan luas. Penghitungan jumlah dan luas ini dilakukan dengan menghitung banyaknya jumlah dan luasan menggunakan software Image J® Launcher pada folikel limfoid yang terdapat pada organ limpa dan limfonodus dari gambaran histopatologi organ pada mikroskop dengan perbesaran 40x.
Folikel limfoid yang terdapat pada organ limpa dan limfonodus dihitung secara keseluruhan jumlah dan luasnya dari masing-masing perlakuan yang telah dilakuan pada mencit jantan maupun mencit betina. Hasil perhitungan yang diperoleh dibedaakan antara kelompok perlakuan (kontrol, preventif, kuratif, dan campuran dengan madu) serta dibedakan juga anatara jenis kelamin mencit (jantan dan betina) kemudian dibandingkan.
3.4.5 Analisis Data
Data pengamatan yang diperoleh adalah data kuantitatif yang disajikan dalam bentuk rataan dan simpangan baku. Setiap data yang diperoleh dari masing-masing perlakuan dibandingkan dengan data yang diperoleh dari kontrol yaitu mencit yang hanya dicekok dengan Aqua® sebanyak 0.1 ml/ekor/hari. Pembandingan yang dilakukan bertujuan untuk menganalisis perubahan yang terjadi pada pulpa putih yang terdapat pada limpa dan folikel limfoid dari limfonodus mencit kelompok kontrol dengan kelompok lainya. Data kuantitatif yang diperoleh juga dibandingkan antara jantan dan betina untuk melihat keefektifan antara kedunya.
Data kuantitatif yang diperoleh diolah dengan analisa ANOVA dan uji lanjutan Duncan menggunakan program SPSS 16 dalam Microsoft Windows® sehingga dapat dilihat perbedaan nyata maupun tidaknya data yang diperoleh dari masing masing perlakuan.