METODE PENELITIAN

Metode penelitian mencakup tahap konfirmasi kultur Salmonella, penyegaran dan pengawetan kultur, persiapan inokulum, pembuatan es, inokulasi kultur, dan evaluasi kemampuan bertahan Salmonella pada es.

1. Konfirmasi Kultur Salmonella (BAM FDA, 2006)

Tahap konfirmasi dilakukan untuk memeriksa kemurnian kultur yang akan digunakan. Konfirmasi kultur Salmonella diawali dengan tahap pewarnaan gram. Konfirmasi kultur dilanjutkan dengan tahap-tahap identifikasi Salmonella. Uji lengkap Salmonella mengacu pada BAM (Bacteriological Analytical Manual). Metode tersebut mencakup lima langkah utama yaitu 1) preenrichment dengan menggunakan media Lactose Broth, 2) selective enrichment dengan menggunakan media Rappaport-Vassiliadis, 3) isolasi Salmonella pada media selektif (HEA, XLDA, atau BSA), 4) identifikasi dan konfirmasi biokimia dengan media TSIA dan LIA.

Penumbuhan Salmonella pada media selektif diawali dengan menginokulasikan 1-2 ose kultur yang berasal dari NA miring ke dalam NB, kemudian diinkubasi pada suhu 37^oC selama 24 ± 2 jam. Satu ose

hasil positif dari NB digoreskan pada media HEA lalu diinkubasi pada suhu 37^oC selama 24 ± 2 jam. Koloni tipikal kemudian digores dan ditusuk pada agar miring TSIA dan LIA untuk kemudian diinkubasi pada suhu 37^oC selama 24 ± 2 jam.

2. Penyegaran dan Pengawetan Kultur (Dewanti-Hariyadi et al., 2001) Kultur Salmonella pada NA miring disegarkan setiap 2 minggu sekali. Penyegaran dilakukan dengan mengambil 1 ose kultur, digores langsung pada NA miring yang baru, kemudian diinkubasi pada suhu 37^oC selama 24 ± 2 jam. Setelah 24 jam, kemudian kultur disimpan pada suhu rendah di dalam lemari es.

Pengawetan kultur dilakukan dengan cara imobilisasi menggunakan manik-manik. Satu ose kultur pada NA miring diinokulasikan pada media NB dan diinkubasi pada suhu 37^oC selama 24 ± 2 jam. Sejumlah volume suspensi kultur dari media NB diambil lalu ditambahkan pada gliserol steril sehingga perbandingan kultur dengan gliserol adalah 8 banding 2. Campuran tersebut kemudian divorteks lalu dimasukkan ke dalam tabung vial steril yang telah berisi manik-manik sehingga seluruh manik-manik terendam. Sisa suspensi dibuang dan kultur yang telah terperangkap dalam manik-manik disimpan pada suhu pembekuan (-40^oC).

3. Persiapan Inokulum

Sebanyak 1-2 ose kultur dari NA miring dipindahkan ke dalam media NB dan diinkubasi selama 24 jam di inkubator bersuhu 37 ^oC. Setelah diinkubasi selama 24 jam, akan diperoleh Salmonella sekitar 10⁹ CFU/ml. Hasil positif dari media NB kemudian diencerkan dengan NaCl sampai pengenceran 10⁴. Kultur hasil pengenceran diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml NB sehingga diperoleh kultur sekitar 10³ CFU/ml.

Suspensi kultur tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37^oC sampai fase log akhir masing-masing galur. Berdasarkan penelitian Hartini (2005) Salmonella Enteritidis dan Salmonella Lexington memiliki fase log

akhir setelah 20 jam inkubasi sedangkan Salmonella Paratyphi memiliki fase log akhir setelah 16 jam inkubasi.

Setelah fase logaritmik akhir tercapai (sekitar 10⁹ CFU/ml), maka kultur siap dipanen dengan cara disentrifuse dingin pada suhu 4^oC pada kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. Bagian supernatan dibuang dan dari endapan yang tersisa (sekitar 10¹⁰ CFU/ml) kemudian ditambah PW sebanyak 10 ml dan dikocok dengan vortex. Pengenceran dilanjutkan sampai konsentrasi 10⁷CFU/ml dan 10⁵ CFU/ml.

Koktil Salmonella diperoleh dengan jalan mencampurkan ke-3 kultur Salmonella masing-masing sebanyak 1 ml dengan penambahan PW. Pencampuran dilakukan untuk mendapatkan Koktil Salmonella yang seragam. Koktil Salmonella yang diperoleh kemudian diencerkan lagi agar mencapai konsentrasi 10⁷ CFU/ml dan 10⁵ CFU/ml. Penginokulasian Salmonella pada es dilakukan pada konsentrasi 10³ CFU/ml dan 10⁵ CFU/ml.

4. Pembuatan es dan Inokulasi kultur

Semua sampel es yang digunakan dalam penelitian ini dalam kondisi steril. Es batu dibuat dengan memipet aquades (pH 6,13) sebanyak 39 ml ke dalam kantong plastik tahan panas kemudian disterilisasi. Es mambo (kadar gula 14%) dibuat dengan melarutkan gula sebanyak 14% kedalam aquades. Kemudian larutan gula dipipet sebanyak 39 ml ke dalam plastik tahan panas untuk disterilisasi.

Es susu (kadar gula 14%, kadar protein 2% dan kadar lemak 2%) dibuat dengan penambahan gula dan susu UHT (kadar protein 3,2 % dan kadar lemak 3,2%). Untuk mendapatkan larutan yang memiliki kadar gula 14%, kadar protein 2% dan kadar lemak 2% sebanyak 250 ml maka dibutuhkan gula sebanyak 35 gram dan susu UHT sebanyak 156,25 ml. Air aquades dan gula disterilisasi terlebih dahulu baru kemudian ditambahkan dengan susu UHT. Larutan yang sudah tercampur homogen dipipet secara aseptik sebanyak 39 ml ke dalam kantong plastik steril.

Masing-masing sampel es dibuat dalam dua konsentrasi inokulasi yaitu 3 log CFU/ml dan 5 log CFU/ml. Untuk mendapatkan sampel es dengan konsentrasi inokulum 5 log CFU/ml, sebanyak 1 ml kultur Salmonella yang diperkirakan terdapat 10⁷ CFU/ml diinokulasikan pada sampel sehingga konsentrasi akhir sel dalam es 10⁵ cfu/ml. Untuk mendapatkan sampel es dengan konsentrasi inokulum 3 log CFU/ml, sebanyak 1 ml kultur Salmonella yang diperkirakan terdapat 10⁵CFU/ml diinokulasikan pada sampel sehingga konsentrasi akhir sel dalam es 10³ CFU/ml. Pembekuan es dilakukan pada freezer dengan kisaran suhu -20^oC sampai -25^oC.

5. Evaluasi Kemampuan Bertahan Salmonella

Salmonella yang telah diinokulasikan pada es dihitung jumlahnya dalam interval waktu pembekuan tertentu yaitu pada 0 jam, 24 jam, dan 48 jam. Sampel es diberi perlakuan thawing dalam waterbath pada suhu 30^oC selama 2 menit.

Sampel es yang telah mencair dipipet sebanyak 10 ml dan dimasukkan kedalam erlenmeyer yang berisi 90 ml Lactose Broth dengan tujuan menyembuhkan sel subletal Salmonella setelah mengalami proses pembekuan. Proses penyembuhan tersebut dilakukan pada suhu 37^oC selama 4 jam. Menurut Bernard (2000) lama waktu penyembuhan bagi sel yang mengalami kerusakan akibat pembekuan pada umumnya 4-5 jam pada kondisi optimum.

Pengenceran dilanjutkan sampai 10^-4 dan dipupukkan sampai konsentrasi yang dikehendaki dengan menggunakan medium NA sebagai medium nonselektif dan HEA sebagai medium selektif. Cawan yang berisi media dan sampel tersebut kemudian diinkubasi terbalik pada suhu 37^oC selama 48 jam.

Jumlah koloni yang terbentuk pada cawan dihitung sehingga dapat dilihat kemampuannya bertahan terhadap pembekuan dengan cara membandingkan jumlah Salmonella dari masing-masing interval waktu

yang dilakukan. Perhitungan jumlah Salmonella dilakukan menggunakan Standar Plate Count.

Σ C N =

[ (1^* n1) + (0,1^* n2) +.... ]^* (d)

Dimana

Perhitungan Sel yang Mengalami Kerusakan Subletal

Beberapa peneliti melakukan perhitungan jumlah sel Salmonella yang mengalami kerusakan subletal dengan melihat perbandingan sel-sel yang tumbuh pada medium yang mengandung senyawa penghambat (medium selektif) dan medium yang tidak mengandung senyawa penghambat (medium non selektif) (Fardiaz, 1990). Pada penelitian ini hectoen enteric agar (HEA) digunakan sebagai medium selektif dan nutrient agar (NA) sebagai medium nonselektif.

Pada media NA sel yang bisa tumbuh adalah sel-sel yang rusak dan sel-sel yang normal, sedangkan yang dapat tumbuh pada HEA hanyalah sel-sel yang normal. Jumlah sel yang mengalami kerusakan subletal merupakan selisih antara jumlah sel yang tumbuh pada NA dan jumlah sel yang tumbuh pada HEA.

N = Jumlah koloni per ml atau per g produk

Σ C = Jumlah semua koloni yang dihitung n1 = Jumlah cawan pada pengenceran pertama n2 = Jumlah cawan pada pengenceran kedua D = Pengenceran pertama yang dihitung

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN