ASAM AMINO DAN PEPTIDA
8. METODE PENENTUAN STRUKTUR PROTEIN
Sebagian besar informasi struktur protein didapat dari analisis kristalografi sinar-x pada kristal protein, serta dari analisis spektroskopi resonansi magnetik inti (nuclear magnetic resonance, NMR) pada larutan protein. Masing-masing teknik tersebut memiliki kelebihan dan kekurangan. Struktur myoglobin adalah struktur protein pertama yang ditentukan dengan resolusi yang cukup untuk melacak jejak rantai polipeptida, yakni pada tahun 1960. Sejak saat itu, beribu-ribu struktur yang sesuai dengan ratusan protein kemudian ditentukan. Koordinat atom-atom dalam struktur protein dan asam nukleat kini banyak tersedia di Protein Data Bank, yang dapat diakses via internet
Bab Protein 1 Persamaan atau aturan pelipatan yang dapat disimpulkan dari data base struktur protein antara lain:
1. Sebagian besar gugus bermuatan berada pada permukaan molekul dan berinteraksi dengan air. Pengecualian untuk aturan ini bi-asanya adalah pada residu katalis yang penting dalam enzim, yang mungkin terstabilkan secara parsial oleh interaksi polar tertentu di dalam bagian hidrofob molekul.
2. Kebanyakan gugus nonpolar (misalnya hidrokarbon) berada di dalam interior molekul, sehingga menghindari kontak dengan air yang tidak disukai secara termodinamika. Pengecualian untuk aturan ini mungkin berfungsi sebagai sisi pengikat spesifik (specific binding sites) pada permukaan molekul untuk protein atau ligan lain. 3. Ikatan hidrogen maksimal terjadi di dalam molekul. 4. Prolin seringkali mengakhiri segmen a-heliks. Sinar-x mempunyai panjang gelombang yang mendekati panjang jarak antara atom-atom yang berikatan dalam molekul (misalnya, ikatan tunggal karbon-karbon berjarak 1,5 Å, sedangkan panjang gelombang sinar-x dari suatu tabung dengan target tembaga adalah 1,54 Å). Bila sinar monokromatik sinar-x berinteraksi dengan suatu molekul, maka molekul tersebut akan terdifraksi dengan pola difraksi yang menunjukkan informasi mengenai lokasi atom dalam molekul tersebut. Akan tetapi jika sampel berada di dalam larutan, maka molekul tunggal protein akan berorientasi secara acak sehingga akan diperoleh informasi bentuk molekul lengkap dengan resolusi yang sangat rendah. Protein serat dan asam nukleat bisa diinduksikan untuk membentuk gel atau serat yang terorientasi. Difraksi sinar-x pada sampel semacam ini digunakan untuk menentukan jarak segmen yang berulang secara teratur, yakni yang dikarakterisasikan sebagai a-heliks dan b sheet dalam protein serta bentuk A dan B untuk DNA dan RNA. Dalam hal ini, difraksi sinar-x hanya bisa dipakai untuk memeriksa model geometrik yang diusulkan, tetapi bukan untuk menentukan struktur secara objektif.
Penggunaan sinar-x yang paling utama adalah pada sampel kristal tunggal. Struktur molekul yang telah ditemukan terdapat dalam ber-macam-macam ukuran, mulai dari beberapa atom sampai virus yang memiliki puluhan ribu atom. Dalam kristal tunggal, semua molekul berada pada kisi-kisi tiga dimensi dengan posisi relatif dan orientasi yang tetap. Intensitas tiap titik dalam pola difraksi dapat diukur, se-hingga informasi mengenai struktur tiga dimensi lengkap dapat di-peroleh.
Kelebihan dan kekurangan kristalografi protein:
1. Teknik ini bisa diterapkan untuk bermacam-macam sampel, antara lain protein, enzim, asam nukleat, dan virus. Teknik ini tidak tergantung pada ukuran molekul.
2. Tidak semua protein bisa dikristalkan, terutama protein membran intrinsik yang harus dilarutkan dalam larutan detergen.
3. Kebanyakan kristal protein tidak berdifraksi membentuk resolusi atom yang sesungguhnya. Untuk itu, urutan protein harus diketahui terlebih dahulu. Struktur tiga dimensi protein lengkap yang pertama kali dipecah-kan menggunakan teknik spektroskopi NMR adalah pada tahun 1986. Fenomena NMR berasal dari fakta bahwa tingkat energi inti dengan spin nonzero akan menjadi tak seimbang ketika inti tersebut diletakkan dalam medan magnet. Dengan demikian, energi inti dapat dikacaukan (digerak-gerakkan di antara tingkat-tingkat energi) dengan menerap-kan getaran frekuensi radio yang panjang gelombangnya sesuai dengan celah di antara tingkat-tingkat energi tersebut. Pengacauan inti seperti ini memungkinkan pengamatan interaksi skalar dan dipolar inti. Inter-aksi skalar dapat memberikan informasi mengenai sudut torsi protein, sedangkan interaksi dipolar memberikan informasi mengenai jarak in-terproton. Struktur protein dihitung menggunakan data urutan asam amino yang dikombinasikan dengan hasil pengukuran sudut-sudut di-hedral dan jarak interproton.
Molekul-Bab Protein 1 ini dapat mengukur kuantitas skalar (sudut torsi dan jarak interproton). Hal ini sangat berbeda dengan kristalografi sinar-x yang menganalisis kisi kristal untuk memperoleh “gambaran” vektor molekul. Karena NMR menganalisis protein dalam larutan, maka teknik ini bisa digunakan untuk melacak detil yang rumit dalam dinamika protein. Kelebihan dan kekurangan spektroskopi NMR protein: 1. Teknik ini dapat diterapkan untuk protein dan asam nukleat dalam bentuk larutan. 2. Terdapat batas ukuran, yakni hanya sampai 35 – 40 kDa. Namun hal ini berarti bahwa kebanyakan domain protein dapat dianalisis menggunakan spektroskopi NMR.
3. Resolusi akhir tidak sebagus kristalografi sinar-x, tetapi dapat diperoleh banyak informasi berguna mengenai dinamika protein.
Pengetahuan kita sekarang akan hubungan antara struktur dan fungsi molekul protein tidaklah cukup untuk menentukan fungsi protein dari strukturnya saja, meskipun, seperti yang telah kita lihat, homologi struktur dengan protein yang fungsinya telah diketahui kadangkala bisa memungkinkan hal ini. Perlu untuk menggabungkan penelitian biokimia dengan informasi struktur. Penelitian biokimia dan biologi sel bisa memberitahukan pada kita apakah suatu protein merupakan reseptor, molekul transpor, atau suatu enzim serta ligan mana yang bisa terikat padanya, juga efek fungsional dari pengikatan ligan seperti ini. Penelitian struktur tiga dimensi kompleks antara ligan spesifik dan protein kemudian akan memberikan informasi detil tentang bagaimana sisi aktif dibangun dan residu asam amino mana yang terlibat dalam pengikatan ligan. Contoh-contoh yang telah kita jelaskan antara lain interaksi protein-DNA, pengikatan gula pada protein pengangkut gula, dan pengikatan inhibitor pada enzim yang memotong ikatan peptide. Peran spesifik tiap residu asam amino untuk fungsi protein bisa diuji dengan membuat mutasi spesifik pada residu yang dipertanyakan dan memeriksa sifat-sifat protein mutan. Dengan menggabungkan dengan cara ini penelitian fungsi dalam larutan, site-directed mutagenesis oleh
teknik DNA rekombinan, dan penentuan struktur tiga dimensi, kita kini berada dalam posisi untuk mendapat wawasan segar ke dalam cara kerja molekul protein.
Struktur tiga dimensi molekul protein bisa ditentukan secara eksperimen dengan dua macam metode, kristalografi sinar-x dan NMR. Interaksi sinar-x dengan elektron dalam molekul yang tersusun dalam kristal digunakan untuk memperoleh peta densitas-elektron molekul tersebut, yang bisa diinterpretasikan dalam suatu model atom. Kelebihan teknik masa kini, seperti kekuatan komputer termasuk kerja grafis, detektor area elektronik, dan sumber sinar-x yang sangat kuat dari radiasi synchrotron, telah sangat memudahkan penggunaan kristalografi sinar-x. Kristalisasi protein bisa sulit dicapai dan biasanya membutuhkan banyak eksperimen berbeda dengan variasi sejumlah parameter, seperti pH, suhu, konsentrasi protein, dan sifat pelarut dan endapan. Kristal protein mengandung saluran-saluran besar dan lubang-lubang yang dipenuhi oleh pelarut, yang bisa digunakan untuk difusi logam berat ke dalam kristal. Penambahan logam berat diperlukan untuk penentuan fasa pancaran terdifraksi.
Struktur sinar-x ditentukan pada berbagai level resolusi. Pada resolusi rendah hanya bentuk molekul yang diperoleh, sedangkan pada resolusi tinggi sebagian besar posisi atom bisa ditentukan dengan akurasi berderajat tinggi. Pada resolusi sedang lipatan rantai polipepitda biasanya terungkap dengan tepat serta juga perkiraan posisi rantai samping, termasuk yang berada pada sisi aktif. Kualitas model tiga dimensi akhir protein tersebut tergantung pada resolusi data sinar-x dan pada derajat perbaikan. Dalam struktur yang telah diperbaiki dengan baik, dengan nilai R kurang dari 0,20 pada resolusi sebesar 2,0 Å, perkiraan error dalam posisi atom adalah sekitar 0,1 Å hingga 0,2 Å, sehingga urutan asam amino diketahui.
Serat biologis, seperti yang bisa dibentuk oleh DNA dan protein serat, bisa mengandung kristalit dengan molekul yang sangat teratur yang strukturnya pada prinsipnya bisa didapatkan pada resolusi atom
Bab Protein 11 jarang seteratur kristal sebenarnya, dan untuk menemukan atom individu perlu untuk memasukkan kecocokan stereokimia dalam analisis sinar-x sehingga strukturnya dapat diperbaiki oleh pemodelan molekul.
Dalam NMR, sifat-sifat spin magnet inti atom di dalam suatu molekul digunakan untuk memperoleh daftar kecocokan jarak antara atom-atom dalam molekul, yang dari sini struktur tiga dimensi molekul protein bisa diperoleh. Metode ini tidak membutuhkan kristal protein dan dapat digunakan pada molekul protein dalam larutan pekat. Namun, penggunaannya terbatas pada molekul protein kecil.