ASAM AMINO DAN PEPTIDA
2. PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI PROTEIN
Langkah pertama dalam pemurnian protein adalah memisahkan molekul protein dari zat terlarut lain yang memiliki berat molekul rendah. Kemudian dilakukan beberapa derajat pemisahan protein yang berbeda-beda, berdasarkan sifat-sifat fisik protein seperti muatan listrik, ukuran molekul, serta kelarutan dalam berbagai macam pelarut. Akhirnya, dilakukan proses kromatografi afinitas yang merupakan proses pemurnian tingkat tinggi yang berdasarkan afinitas spesifik
Bab Protein Molekul protein yang memiliki berat molekul lebih dari 5.000 tidak akan dapat melewati membran selofan. Permeabilitas selektif ini merupakan dasar dari proses dialisis. Proses dialisis biasanya dilakukan dengan menaruh larutan protein ke dalam kantung selofan lalu men-celupkan kantung tersebut dalam larutan penyangga. Molekul-molekul kecil akan berdifusi melewati kantung menuju larutan penyangga, sedangkan protein tetap berada dalam kantung.
Protein-protein tertentu dapat diendapkan dari campuran ber-macam-macam protein. Pengendapan dilakukan dengan menambahkan zat kimia tertentu, yakni: garam netral seperti amonium sulfat (salting out); pelarut organik seperti etanol atau aseton; atau zat pengendap seperti asam trikloroasetat. Protein paling sedikit melarut dalam pelarut apapun bila nilai pH sama dengan titik isoelektriknya (pHI). Pada titik isoelektrik ini protein tidak bermuatan sehingga tolakan elektrostatik antara molekul protein menjadi minimal. Meskipun protein bisa saja memiliki muatan negatif sekaligus muatan positif pada titik isoelektriknya, tetapi muatan totalnya nol.
Elektroforesis berarti pergerakan molekul protein bermuatan listrik dalam suatu medan listrik. Prinsip elektroforesis ini dipakai untuk memisahkan molekul-molekul protein yang berbeda. Elektro-foresis protein menggunakan kertas atau gel poliakrilamida. Dalam elektroforesis sering digunakan istilah anoda dan katoda yang membingungkan. Perlu diingat bahwa anion adalah ion bermuatan negatif. Dalam elektroforesis, anion bergerak menuju anoda.
Kromatografi penukar ion bergantung pada interaksi elektrostatik antara protein bermuatan dengan partikel resin penukar ion yang muatannya berlawanan. Kekuatan tarik menarik antara protein dan partikel resin tergantung pada besarnya muatan protein (juga pH larutan) dan pada konstanta dielektrik medium. Interaksi ini bisa dimodifikasi dengan mengatur pH larutan atau mengatur konsentrasi garam.
Pemisahan protein berdasarkan ukuran bisa dilakukan mengguna-kan teknik filtrasi gel. Teknik ini bergantung pada kemampuan molekul protein untuk berdifusi ke dalam pori-pori matriks gel dalam
suatu kolom. Bahan gel yang biasa dipakai adalah dekstran (polimer dari glukosa) yang berbentuk butiran kecil. Bahan ini dijual dengan nama komersial Sephadex, yang terdapat dalam berbagai ukuran pori-pori.
Bila protein berukuran lebih besar daripada pori-pori matriks yang terbesar, maka difusi tidak akan terjadi sehingga protein dielusi dengan cepat. Molekul yang lebih kecil daripada pori-pori yang terkecil akan berdifusi dengan bebas ke dalam semua partikel gel dan dielusi belakangan, yakni setelah dialiri larutan penyangga yang volumenya lebih besar.
Struktur dan sifat peptida maupun protein sangat tergantung pada urutan asam amino dalam rantai peptida. Insulin adalah protein yang pertama kali diurutkan susunan asam aminonya secara lengkap (51 residu asam amino), yakni oleh F. Sanger di tahun 1953. Proses pengurutan protein kini dilakukan menggunakan mesin pengurut protein otomatis (automated protein sequencers). Identifikasi asam amino dilakukan secara step-by-step pada ujung N protein, dengan menggunakan proses kimia yang dikenal sebagai degradasi Edman.
Asam amino pertama dalam urutan suatu peptida (residu ujung-N) bisa ditentukan dengan cara mereaksikan peptida dengan fenilisotiosianat. Pada pH netral, senyawa fenilisotiosianat bereaksi dengan gugus a-amino. Setelah dilakukan hidrolisis asam lemah, hasil reaksi akan bersiklisasi (melingkar), dengan melepaskan residu yang paling ujung sebagai turunan feniltiohidantoin (PTH). Seluruh proses ini adalah proses degradasi Edman (Gambar 3-1). Turunan PTH lalu dianalisis untuk menentukan asam amino asalnya serta kuantitasnya.
Pereaksi lain yang juga bisa digunakan untuk mengidentifikasi ujung N antara lain dansil klorida dan fluoro-2,4-dinitrobenzen. Senyawa-senyawa ini dapat bereaksi dengan residu ujung amino.
Bab Protein Protein
Biokimia: Struktur dan Fungsi Biomolekul 73 menggunakan mesin pengurut protein otomatis (automated protein sequencers). Identifikasi asam amino dilakukan secara step-by-step pada ujung N protein, dengan menggunakan proses kimia yang dikenal sebagai degradasi Edman.
Asam amino pertama dalam urutan suatu peptida (residu ujung-N) bisa ditentukan dengan cara mereaksikan peptida dengan fenilisotiosianat. Pada pH netral, senyawa fenilisotiosianat bereaksi dengan gugus -amino. Setelah dilakukan hidrolisis asam lemah, hasil reaksi akan bersiklisasi (melingkar), dengan melepaskan residu yang paling ujung sebagai turunan feniltiohidantoin (PTH). Seluruh proses ini adalah proses degradasi Edman (Gambar 3-1). Turunan PTH lalu dianalisis untuk menentukan asam amino asalnya serta kuantitasnya. N C S + H2N C C H R1 NH O C H R2 N C N C C NH H S H H O R1 C R2 H N C C N C H R1 S H O H3N C H R2 + Fenilisotiosianat Feniltiohidantoin pH netral pH asam
Gambar 3-1 Reaksi reaksi degradasi Edman
Gambar 3-1 Reaksi reaksi degradasi Edman
Protein
Biokimia: Struktur dan Fungsi Biomolekul 74
Pereaksi lain yang juga bisa digunakan untuk mengidentifikasi ujung N antara lain dansil klorida dan fluoro-2,4-dinitrobenzen. Senyawa-senyawa ini dapat bereaksi dengan residu ujung amino.
N H3C CH3 S Cl NO2 NO2 F O O
Dansil klorida Fluoro-2,4-dinitrobenzen
Banyak protein yang mengandung ratusan residu asam amino, sehingga kurang efektif bila dilakukan penentuan seluruh urutan asam aminonya sekaligus. Hal ini dikarenakan meningkatnya ketidakpastian pada tiap tahap pengurutan. Akan lebih mudah bila dilakukan pemotongan protein terlebih dahulu, agar didapat potongan-potongan protein yang lebih kecil untuk diurutkan. Selain itu, protein bisa saja mengandung jembatan disulfida yang menghubungkan residu-residu sistein pada bagian-bagian rantai yang berbeda atau berjauhan. Ikatan disulfida ini harus diputuskan terlebih dahulu sebelum protein dapat diurutkan.
Salah satu cara yang sering digunakan untuk memotong polipeptida menjadi fragmen-fragmen yang lebih kecil adalah dengan hidrolisis oleh enzim tripsin. Tripsin adalah enzim pencernaan yang diproduksi oleh pankreas. Enzim ini menghidrolisis ikatan peptida pada sisi karboksil residu lisin dan arginin (bermuatan positif):
R1 Lys Ala R2 R1 Lys COO- + NH3+ Ala R2
Tripsin
Banyak protein yang mengandung ratusan residu asam amino, sehingga kurang efektif bila dilakukan penentuan seluruh urutan asam
Biokimia: Struktur dan Fungsi Biomolekul
aminonya sekaligus. Hal ini dikarenakan meningkatnya ketidakpastian pada tiap tahap pengurutan. Akan lebih mudah bila dilakukan pemotongan protein terlebih dahulu, agar didapat potongan-potongan protein yang lebih kecil untuk diurutkan. Selain itu, protein bisa saja mengandung jembatan disulfida yang menghubungkan residu-residu sistein pada bagian-bagian rantai yang berbeda atau berjauhan. Ikatan disulfida ini harus diputuskan terlebih dahulu sebelum protein dapat diurutkan.
Salah satu cara yang sering digunakan untuk memotong polipeptida menjadi fragmen-fragmen yang lebih kecil adalah dengan hidrolisis oleh enzim tripsin. Tripsin adalah enzim pencernaan yang diproduksi oleh pankreas. Enzim ini menghidrolisis ikatan peptida pada sisi karboksil residu lisin dan arginin (bermuatan positif):
Biokimia: Struktur dan Fungsi Biomolekul 74 Pereaksi lain yang juga bisa digunakan untuk mengidentifikasi ujung N antara lain dansil klorida dan fluoro-2,4-dinitrobenzen. Senyawa-senyawa ini dapat bereaksi dengan residu ujung amino.
N H3C CH3 S Cl NO2 NO2 F O O
Dansil klorida Fluoro-2,4-dinitrobenzen
Banyak protein yang mengandung ratusan residu asam amino, sehingga kurang efektif bila dilakukan penentuan seluruh urutan asam aminonya sekaligus. Hal ini dikarenakan meningkatnya ketidakpastian pada tiap tahap pengurutan. Akan lebih mudah bila dilakukan pemotongan protein terlebih dahulu, agar didapat potongan-potongan protein yang lebih kecil untuk diurutkan. Selain itu, protein bisa saja mengandung jembatan disulfida yang menghubungkan residu-residu sistein pada bagian-bagian rantai yang berbeda atau berjauhan. Ikatan disulfida ini harus diputuskan terlebih dahulu sebelum protein dapat diurutkan.
Salah satu cara yang sering digunakan untuk memotong polipeptida menjadi fragmen-fragmen yang lebih kecil adalah dengan hidrolisis oleh enzim tripsin. Tripsin adalah enzim pencernaan yang diproduksi oleh pankreas. Enzim ini menghidrolisis ikatan peptida pada sisi karboksil residu lisin dan arginin (bermuatan positif):
R1 Lys Ala R2 R1 Lys COO- + NH3+ Ala R2
Tripsin
Enzim lain yang biasa digunakan untuk pemotongan protein secara selektif adalah kimotripsin. Enzim kimotripsin menghidrolisis ikatan peptida pada sisi karboksil residu aromatik (fenilalanin, tirosin, dan triptofan):
Protein
Enzim lain yang biasa digunakan untuk pemotongan protein secara selektif adalah kimotripsin. Enzim kimotripsin menghidrolisis ikatan peptida pada sisi karboksil residu aromatik (fenilalanin, tirosin, dan triptofan):
R1 Phe Ser R2 R1 Phe COO- + NH3+ Ser R2 Kimotripsin
Metoda kimia non enzimatik untuk pemotongan polipeptida secara spesifik yakni menggunakan pereaksi sianogen bromida (CNBr). Pereaksi ini bereaksi dengan residu metionin:
R1 C N O CH H CH2 CH2 S CH3 Br C N O R2 H C N + R1 C N O CH H CH2 C N O R2 H CH2 CH3 S CN + Br -R1 C N O CH H CH2 C O O + H3N R2 H2O CH2
Bila protein telah dipotong dan masing-masing fragmen peptidanya telah ditentukan urutannya, maka masalahnya sekarang adalah bagaimana menyusun urutan fragmen-fragmen tersebut dalam susunan yang benar. Untuk itu, setidaknya diperlukan dua set urutan fragmen peptida, yang masing-masing set dipotong pada sisi yang berbeda.
Sebagian protein mengandung senyawa lain selain asam amino. Protein seperti ini disebut sebagai protein konjugasi. Bagian selain asam amino pada protein konjugasi disebut sebagai gugus prostetik, sedangkan bagian asam amino pada protein tersebut dikenal sebagai apoprotein. Contoh protein
Metode kimia non enzimatik untuk pemotongan polipeptida secara spesifik yakni menggunakan pereaksi sianogen bromida (CNBr). Pereaksi ini bereaksi dengan residu metionin:
Bab Protein Protein
Biokimia: Struktur dan Fungsi Biomolekul 75 Enzim lain yang biasa digunakan untuk pemotongan protein secara selektif adalah kimotripsin. Enzim kimotripsin menghidrolisis ikatan peptida pada sisi karboksil residu aromatik (fenilalanin, tirosin, dan triptofan):
R1 Phe Ser R2 R1 Phe COO- + NH3+ Ser R2
Kimotripsin
Metoda kimia non enzimatik untuk pemotongan polipeptida secara spesifik yakni menggunakan pereaksi sianogen bromida (CNBr). Pereaksi ini bereaksi dengan residu metionin:
R1 C N O CH H CH2 CH2 S CH3 Br C N O R2 H C N + R1 C N O CH H CH2 C N O R2 H CH2 CH3 S CN + Br -R1 C N O CH H CH2 C O O + H3N R2 H2O CH2
Bila protein telah dipotong dan masing-masing fragmen peptidanya telah ditentukan urutannya, maka masalahnya sekarang adalah bagaimana menyusun urutan fragmen-fragmen tersebut dalam susunan yang benar. Untuk itu, setidaknya diperlukan dua set urutan fragmen peptida, yang masing-masing set dipotong pada sisi yang berbeda.
Sebagian protein mengandung senyawa lain selain asam amino. Protein seperti ini disebut sebagai protein konjugasi. Bagian selain asam amino pada protein konjugasi disebut sebagai gugus prostetik, sedangkan bagian asam amino pada protein tersebut dikenal sebagai apoprotein. Contoh protein Bila protein telah dipotong dan masing-masing fragmen peptidanya telah ditentukan urutannya, maka masalahnya sekarang adalah bagaimana menyusun urutan fragmen-fragmen tersebut dalam susunan yang benar. Untuk itu, setidaknya diperlukan dua set urutan fragmen peptida, yang masing-masing set dipotong pada sisi yang berbeda.
Sebagian protein mengandung senyawa lain selain asam amino. Protein seperti ini disebut sebagai protein konjugasi. Bagian selain asam amino pada protein konjugasi disebut sebagai gugus prostetik, sedangkan bagian asam amino pada protein tersebut dikenal sebagai apoprotein. Contoh protein konjugasi antara lain glikoprotein dan proteoglikan yang mengandung karbohidrat dalam ikatan kovalen, serta lipoprotein yang mengandung lipid sebagai gugus prostetiknya.
Tiap protein memiliki berat molekul yang unik. Ukuran atau berat molekul suatu protein pada kondisi tertentu dapat membedakannya dari protein-protein lain. Berat molekul (lebih tepat, berat molekul relatif), Mr, tidak mempunyai dimensi. Mr menunjukkan massa molekul relatif terhadap 1/12 massa atom 12C. Massa molekul itu sendiri biasanya ditulis dalam satuan dalton (Da) atau kilodalton (kDa), dengan 1 Da adalah 1/12 massa atom 12C (1,66 x 10-24 g). Massa molar adalah massa
satu mol yang ditulis dalam gram. Ketiga ukuran yang disebutkan tadi memiliki nilai numerik yang sama, tetapi dengan satuan yang berbeda. Sebagai contoh, serum albumin dapat ditulis memiliki berat molekul 66.000, atau massa molekul 66 kDa, atau massa molar 66 kg mol-1.
Berat molekul suatu protein ditentukan oleh urutan asam amino, modifikasi post-translasi (misalnya glikosilasi), serta gugus nonpeptida (misalnya logam dan kofaktor). Berat sebenarnya dari suatu rantai polipeptida dapat dihitung dari urutan asam aminonya, tetapi ada perhitungan yang lebih mudah untuk memperkirakan berat kasar polipeptida, yakni perhitungan rule-of-thumb (aturan ibu jari). Perhitungan rule-of-thumb berdasarkan pada proporsi asam-asam amino yang ditemukan dalam sebagian besar protein; sehingga berat molekul didapat dengan mengalikan jumlah residu dengan 110. Protein yang memiliki struktur kuaterner disusun oleh beberapa rantai polipeptida terpisah yang ditahan oleh interaksi non kovalen. Berat molekul komponen rantai polipeptida dalam protein seperti ini dapat ditentukan dalam kondisi disosiasi, yakni 8 M urea untuk melemahkan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofob, dan 1 mM merkaptoetanol untuk memutuskan ikatan disulfida. Dari perbandingan dengan berat molekul keseluruhan, dapat ditentukan jumlah rantai polipeptida yang terlibat dalam struktur awalnya (struktur kuarterner).
Berat molekul suatu protein dapat ditentukan menggunakan metode termodinamika, misalnya pengukuran tekanan osmosis, dan juga analisis sedimentasi dalam ultrasentrifuga. Tekan osmosis sensitif terhadap jumlah molekul dalam larutan, sehingga bila massa protein total dalam larutan telah diketahui maka berat molar dapat dihitung. Sedimentasi molekul protein dalam sentrifuga tergantung pada massa molekul.
Berat molekul suatu protein juga bisa diperkirakan dengan menggunakan filtrasi gel, atau dari pengukuran kecepatan migrasi molekul melalui gel elektroforesis; hasil pengukuran-pengukuran ini kemudian dibandingkan dengan sejumlah berat molekul standar yang telah diketahui. Untuk menentukan berat molekul protein secara
Bab Protein 1 Massa molar (M) suatu zat terlarut bisa ditentukan dari pengukuran koefisien sedimentasi (s) dan koefisien difusi (D) menurut persamaan Svedberg: (1 ) RTs M D vρ = − dengan R adalah tetapan gas, T adalah suhu mutlak, volume spesifik parsial dari zat terlarut, dan r adalah kerapatan pelarut. Koefisien sedimentasi tergantung pada ukuran, bentuk, dan berat molar zat terlarut. Koefisien sedimentasi ini ditentukan dari kecepatan sedimentasi zat terlarut dalam medan gravitasi suatu ultrasentrifuga. Koefisien difusi tergantung pada ukuran dan bentuk zat terlarut, dan ditentukan dari kecepatan terbentuknya perbatasan antara larutan dan pelarut murni.
Koefisian sedimentasi sering ditulis dalam satuan Svedberg (S), yang namanya diambil dari Thé Svedberg, penemu sentrifuga: Koefisien sedimentasi beberapa protein dapat dilihat pada daftar berikut. Protein Mr s Lisozim 14.000 1,9 S Hemoglobin 64.500 4,5 S Katalase 248.000 11,3 S Urease 480.000 18,6 S Volume yang dibutuhkan untuk mengelusi protein globular dari kolom filtrasi gel merupakan fungsi penurunan dari berat molekul. Bila hasil elusi protein sampel dibandingkan dengan serangkaian berat molekul standar yang telah diketahui, maka perkiraan berat molekul protein sampel dapat diinterpolasi (Gambar 3-2).
Gambar 3-2 Gel filtrasi protein. Serangkaian protein yang Mr-nya berbeda dianalisis dalam kolom Sephadex G-200 untuk mengetahui volume elusi Vel masing-masing. Volume elusi ini diplotkan dalam grafik, dengan dua titik data yang ditunjukkan oleh lingkaran putih tidak dipakai untuk membentuk kurva kalibrasi.
Protein Mr Vel (mL) Dekstran biru* 106 85 Lisozim 14.000 200 Kimptripsinogen 25.000 190 Ovalbumin 45.000 170 Serum albumin 65.000 150 Aldolase 150.000 125 Urease 500.000 90 Ferritin** 700.000 92 Ovomukoid** 28.000 160 Sampel enzim – 130 *Dekstran biru merupakan karbohidrat yang berat molekulnya besar yang mengandung molekul pewarna yang terikat secara kovalen.
**Tidak digunakan dalam kurva kalibrasi.
Dalam deterjen natrium dodesil sulfat (SDS), banyak protein yang terpisahkan dan terbuka lipatannya. Sama seperti volume elusi, mobilitas elektroforesis rantai-rantai polipeptida yang terdenaturasi oleh SDS juga
4 5 6 80 120 160 200 Log Mr
Gambar 3-2 Gel filtrasi protein. Serangkaian protein yang Mr-nya berbeda dianalisis dalam kolom Sephadex G-200 untuk mengetahui volume elusi Vel
masing-masing. Volume elusi ini diplotkan dalam grafik, dengan dua titik data yang ditunjukkan oleh lingkaran putih tidak dipakai untuk membentuk
kurva kalibrasi. Protein Mr Vel (mL) Dekstran biru* 106 85 Lisozim 14.000 200 Kimptripsinogen 25.000 190 Ovalbumin 45.000 170 Serum albumin 65.000 150 Aldolase 150.000 125 Urease 500.000 90 Ferritin** 700.000 92 Ovomukoid** 28.000 160 Sampel enzim – 130 * Dekstran biru merupakan karbohidrat yang berat molekulnya besar yang mengandung molekul pewarna yang terikat secara kovalen.
Bab Protein Dalam deterjen natrium dodesil sulfat (SDS), banyak protein yang terpisahkan dan terbuka lipatannya. Sama seperti volume elusi, mobilitas elektroforesis rantai-rantai polipeptida yang terdenaturasi oleh SDS juga merupakan fungsi penurunan dari berat molekul. Dengan demikian, berat molekul protein sampel dapat disimpulkan dari mobilitas-mobilitas standar.
Dalam teknik filtrasi gel maupun teknik gel elektroforesis, sifat hi- drodinamik tergantung pada bentuk molekul. Karena itu harus diang- gap bahwa bentuk protein sampel adalah sama dengan bentuk protein-protein standar (misalnya berbentuk bola, elips, dan sebagainya).
Filtrasi gel sangat tergantung pada ukuran efektif, bukan massa. Karena itu, jika kerapatan protein sampel berbeda dengan standar, maka perkiraan berat molekulnya akan tidak tepat.
Protein mengikat SDS, dan dianggap bahwa jumlah SDS yang terikat per gram adalah sama untuk semua protein. Perbedaan jumlah ikatan per molekul akan menghasilkan perbedaan muatan total dan mobilitas elektroforesis, sehingga akan didapat besar berat molekul yang salah.
Dahulu, penggunaan spektrometri massa untuk menentukan berat molekul makromolekul biologis sangat terbatas. Hal ini dikarenakan penguapan sampel dapat menyebabkan dekomposisi termal. Selama bertahun-tahun telah dikembangkan berbagai teknik untuk mengatasi masalah tersebut, dan sekarang spektrometri massa merupakan alat yang digunakan secara rutin dalam sebagian besar laboratorium biokimia. Metode yang kini digunakan untuk menganalisa sampel antara lain: matrix assisted laser desorption (MALDI), yakni sampel dibungkus dalam matriks organik yang memiliki berat molekul rendah kemudian disinari laser UV; electrospray, yakni protein sampel dibuat larutan asam encer kemudian disemprotkan dari jarum bermuatan positif ke dalam kamar vakum (pelarut yang mengelilingi protein menguap dengan cepat meninggalkan molekul protein yang bermuatan positif); serta plasma desorption, yakni menggunakan partikel bermuatan yang berenergi tinggi untuk membebaskan sampel dari suatu pendukung logam. Spektrometri massa memiliki ketepatan sampai sekitar 0,01
% dengan hanya membutuhkan beberapa pikomol sampel, dan dapat digunakan untuk menentukan berat molekul dalam berbagai ukuran, mulai dari asam amino tunggal sampai protein yang lebih besar dari 100 kDa.