1. Analisis Kualitatif Natrium Benzoat (AOAC 910.02B 1999) Persiapan Sampel
a. Padatan atau semi padatan :
Sampel sebanyak 50-100 g ditambah dengan 300-400 ml air.
Kemudian dihancurkan dengan menggunakan waring blender. Selanjutnya campuran ditambah dengan NaOH 10 % hingga alkalis dan dibiarkan selama + 2 jam, setelah itu disaring.
b. Cairan
Sampel sebanyak 50-100 ml dibuat menjadi alkalis dengan penambahan NaOH 10 %. Kemudian disaring dengan kapas. Jika sampel berkadar gula tinggi, maka harus diencerkan sampai total padatan terlarut 10-15 %.
Pengujian
Sebanyak 100 ml atau lebih filtrat dari persiapan sampel dimasukkan ke dalam labu pemisah. Kemudian ditambahkan HCl (1+3) sampai asam
(gunakan kertas litmus sebagai indikator) dan ditambahkan lagi 5-10 ml HCl (1+3). Setelah itu, larutan tadi diekstrak dengan 75-100 ml eter. Jika perlu lapisan air diekstrak kembali dengan eter. Ekstrak eter dicuci sebanyak 3 kali, masing-masing dengan 5 ml air. Ekstrak eter yang telah dicuci dimasukkan ke dalam pinggan porselin dan diuapkan ke dalam penangas air. Residu yang dihasilkan mengandung asam benzoat atau eternya, asam salisilat, sakarin, dulsin, dan atau bahan terekstrak lainnya.
Residu yang diperoleh dilarutkan dalam air. Jika perlu dipanaskan sampai 80-85o C selama 10 menit. Larutan tersebut ditambahkan dengan beberapa tetes NH3 sampai larutan menjadi basa. Kemudian larutan diuapkan untuk menghilangkan kelebihan NH3. Residu yang tersisa dilarutkan kembali dengan air panas. Setelah itu, larutan disaring jika perlu. Ke dalam larutan ditambahkan beberapa tetes FeCl3 netral 0.5 %. Terbentuknya endapan Ferribenzoat yang berwarna salmon menunjukkan adanya asam benzoat.
Diagram alir prosedur analisis kualitatif benzoat dapat dilihat pada Lampiran 5.
2. Analisis Kuantitatif Natrium Benzoat a. Penentuan Penggunaan Pereaksi
Pada tahap ini dilakukan analisis larutan natrium benzoat +1000 ppm dengan tiga perlakuan. Perlakuan 1 digunakan bahan kimia yang semuanya pro analysis (p.a) yang terdiri dari NaCl, kloroform, dan alkohol. Perlakuan 2 digunakan kloroform teknis dan alkohol teknis.
Perlakuan 3 digunakan NaCl teknis, kloroform teknis, dan alkohol teknis.
Analisis dilakukan secara duplo. Hasil yang didapat kemudian dilakukan uji t, uji F, dan ANOVA untuk membandingkan apakah ketiga perlakuan tersebut berbeda nyata atau tidak. Berdasarkan uji statistik yang dilakukan dan pertimbangan biaya analisis, akan dipilih satu perlakuan untuk digunakan pada analisis selanjutnya.
Larutan Na-benzoat 1000 ppm
Perlakuan 1 Perlakuan 2 Perlakuan 3
ppm Na-benzoat ppm Na-benzoat ppm Na-benzoat
Uji t, F, dan ANOVA
b. Analisis Saus Sambal
Saus Sambal
Dianalisis 7 kali Dianalisis 7 kali (ekstraksi dengan labu pemisah) (ekstraksi dengan shaker)
Presisi Presisi
Uji t, F, dan ANOVA
c. Uji Banding Antar Laboratorium
Saus Sambal
Dianalisis di laboratorium yang telah terakreditasi
Uji t, F ,dan ANOVA dengan hasil yang didapat dari metode titrimetri
d. Prosedur Analisis Kuantitatif Natrium Benzoat Secara Titrimetri (AOAC 963.19 1999)
Persiapan Sampel a. Prosedur Umum
Sampel dihomogenkan, jika sampel berupa padatan atau semi padat maka harus dihaluskan. Sebanyak 150 ml atau 150 g sampel dimasukkan ke dalam labu takar 500 ml. Kemudian ditambahkan NaCl powder secukupnya untuk menjenuhkan air dalam sampel. Sampel dibuat menjadi alkalis (periksa dengan kertas lakmus) dengan penambahan NaOH 10 % atau dengan suspensi Ca(OH)2 (satu bagian Ca(OH)2 disuspensikan dalam tiga bagian air). Setelah itu, campuran tersebut diencerkan sampai tanda batas dengan larutan NaCl jenuh dan dikocok berulang kali. Larutan dibiarkan selama + 2 jam, dikocok berulang kali, dan disaring. Jika contoh mengandung banyak lemak, bagian yang saringannya terkontaminasi oleh lemak ditambahkan beberapa ml larutan NaOH 10 % ke dalam saringan, kemudian diekstrak dengan eter sebelum penetapan selanjutnya. Jika sampel mengandung alkohol, perlakuan seperti cara d. Jika sampel mengandung sejumlah bahan yang dapat diendapkan oleh larutan NaCl, perlakuan seperti cara e
b. Sampel Saus Tomat
Ke dalam 100 g sampel ditambahkan 15 g NaCl powder dan campuran dipindahkan ke dalam labu takar 500 ml kemudian dicuci wadah semula dengan +150 ml larutan NaCl jenuh. Larutan dibuat menjadi alkalis dengan NaOH 10 % dan diencerkan dengan larutan NaCl jenuh sampai tanda tera. Larutan dibiarkan selama sedikitnya 2 jam, dikocok setiap selang waktu tertentu, disentrifuse jika perlu, kemudian disaring.
c. Sampel Jeli, Jam, dan Marmalades
Dihancurkan 150 g sampel di dalam 300 ml larutan NaCl jenuh kemudian ditambahkan 15 g NaCl dan dibuat menjadi alkali dengan suspensi Ca(OH)2. Selanjutnya dipindahkan larutan tersebut ke dalam labu takar 500 ml dan diencerkan dengan larutan NaCl jenuh sampai tanda tera. Larutan dibiarkan selama sedikitnya 2 jam, dikocok berulang kali, disentrifuse jika perlu, kemudian disaring.
d. Sampel Cider yang mengandung alkohol dan produk sejenisnya Ke dalam 250 ml sampel ditambahkan NaOH 10 % sampai alkalis, kemudian diuapkan pada penangas uap sampai volume larutan menjadi100 ml. Dipindahkan sampel ke dalam labu takar 250 ml, ditambahkan 30 g NaCl powder dan dikocok sampai larut. Selanjutnya diencerkan sampai tanda tera dengan larutan NaCl jenuh. Larutan dibiarkan selama sedikitnya 2 jam, dikocok berulang kali, kemudian disaring.
e. Sampel Ikan asin atau Ikan yang Dikeringkan
Dicuci 50 g sampel yang telah dihaluskan dalam labu takar 500 ml dengan H2O. Sampel dibuat menjadi alkalis dengan NaOH 10 % dan ditepatkan sampai tanda tera dengan H2O. Dibiarkan selama sedikitnya 2 jam, dikocok secara teratur, dan disaring. Lalu dipipet sebanyak mungkin filtrat (>300 ml), dimasukkan ke dalam labu takar 500 ml kedua dan ditambahkan 30 gram NaCl untuk setiap 100 ml larutan. Kemudian larutan dikocok sampai NaCl larut. Larutan tersebut diencerkan sampai tanda tera dengan larutan NaCl jenuh, dikocok sampai homogen dan disaring protein/bahan lain yang mengendap.
Penetapan Sampel
Sebanyak 100-200 ml filtrat sampel dipipet dan di masukkan ke dalam labu pemisah. Filtrat dinetralkan dengan penambahan HCl (1 + 3) dan ditambahkan lagi 5 ml HCl sesudah netral. Filtrat yang telah diasamkan, diekstrak dengan menggunakan kloroform (CHCl3) beberapa
kali dengan volume kloroform 70, 50, 40, dan 30 ml. Untuk mencegah pembentukan emulsi, digoyang-goyang secara kontinyu setiap kali ekstraksi dengan gerakan rotasi. Lapisan kloroform biasanya memisah dengan mudah sesudah dibiarkan beberapa menit. Jika emulsi terbentuk, emulsi dihilangkan dengan mengocok lapisan CHCl3 menggunakan gelas pengaduk, dengan memindahkan dan memisahkan emulsi dengan menggunakan labu pemisah lain atau dengan sentrifusa beberapa menit.
Setiap kali ekstraksi selesai, diambil bagian jernih lapisan kloroform sebanyak mungkin, diusahakan jangan tercampur dengan emulsi. Jika lapisan kloroform yang diperoleh kurang jernih maka perlu dicuci dengan akuades sampai jernih. Selanjutnya seluruh ekstrak kloroform dipindahkan ke dalam cawan penguap porselen, dibilas wadah beberapa kali dengan beberapa ml CHCl3 dan diuapkan sampai kering pada suhu kamar dalam aliran udara kering.
Hasil ekstraksi dapat juga dipindahkan dari labu pemisah ke dalam erlenmeyer 300 ml dan bilas labu pemisah dengan 5-10 ml CHCl3
tiga kali. Ekstrak tersebut didistilasi dengan lambat pada suhu rendah sampai volume ekstrak seperempat dari volume semula, kemudian diuapkan sampai kering pada suhu kamar di atas penangas air sampai tinggal beberapa tetes cairan saja yang tinggal. Selanjutnya residu dikeringkan semalaman (atau sampai tidak tercium bau asam asetat bila sampelnya adalah saus tomat) dalam desikator yang mengandung H2SO4 pekat. Kemudian residu asam benzoat dilarutkan dalam 30-50 ml alkohol, ditambahkan 12-15 ml air dan 1 atau 2 tetes. Diagram alir prosedur analisis kuantitatif benzoat dapat dilihat pada Lampiran 6.
Perhitungan :
Volume larutan ppm Na Titer x N NaOH x 144 x yang dibuat pada x 106 benzoat = persiapan sampel anhidrat Volume yang diambil x berat sampel x 1000
untuk penetapan
A. ANALISIS KUALITATIF NATRIUM BENZOAT
Tujuan analisis kualitatif natrium benzoat adalah untuk mengetahui apakah di dalam suatu sampel terkandung natrium benzoat. Pada analisis ini, sampel yang digunakan adalah sampel saus sambal dan minuman dalam kemasan yang terdapat di pasaran. Kedua jenis sampel yang dipilih tersebut adalah yang mengandung natrium benzoat, seperti yang tercantum pada label kemasan. Masing-masing sampel dilakukan analisis dengan tiga kali ulangan.
Metode analisis yang dilakukan mengacu pada AOAC Official Method 910.02B (1999) yaitu dengan uji feriklorida. Persiapan sampel yang dilakukan untuk saus sambal berbeda dengan sampel minuman dalam kemasan. Pada sampel saus sambal, karena karakteristik substrat atau matriks sampel diperlukan perlakuan pendahuluan yang lebih kompleks agar dapat menghilangkan interferen yang mengganggu dan meningkatkan konsentrasi solute. Untuk sampel minuman, perlakuan pendahuluan yang dilakukan tidak terlalu rumit dibandingkan dengan perlakuan pendahuluan pada makanan (Gomis dan Alonso 1996). Pada saus sambal, dilakukan persiapan sampel untuk sampel padatan atau semi padatan. Pertama-tama sampel diencerkan terlebih dahulu, lalu dibasakan dengan penambahan NaOH 10 %, kemudian didiamkan selama + 2 jam agar reaksi dengan NaOH berjalan dengan sempurna. Setelah itu campuran disaring. Sementara untuk sampel minuman, tidak perlu diencerkan terlebih dahulu. Sampel langsung ditambahkan NaOH 10 % hingga alkalis, kemudian disaring. Untuk sampel minuman ini, tidak perlu diencerkan lagi karena total padatan terlarut (TPT) tidak melebihi 15 %.
Filtrat yang diperoleh diasamkan dengan penambahan HCl (1+3), kemudian diekstrak dengan eter (dietil eter). Ekstraksi yang dilakukan pada penelitian ini termasuk ekstraksi pelarut (liquid-liquid extraction). Ekstraksi pelarut didefinisikan sebagai proses pemisahan suatu zat dari sebuah campuran dengan melarutkan zat tersebut dalam sebuah pelarut dimana zat tersebut dapat larut tetapi zat lain yang ada dalam campuran tidak dapat larut (Holden 1999). Prinsip dari ekstraksi yaitu jika sebuah larutan kontak dengan
pelarut immiscible, solute akan terdistribusi di antara dua fase cair (liquid) (Jacobs et al. 1974). Pada kesetimbangan, rasio konsentrasi solute dalam dua fase kurang lebih konstan. Rasio ini dinamakan rasio distribusi atau koefisen distribusi. Ketika komponen yang diinginkan berada dalam larutan air (fase kedua), maka komponen itu bisa dipindahkan dengan menggunakan pelarut yang tidak larut air (fase satu). Komponen yang diinginkan tersebut mudah larut dan impurities tidak atau hanya sedikit larut. Ekstraksi sangat berguna untuk memisahkan solute yang diinginkan dari impurities dan by product yang larut air.
Pelarut yang baik untuk ekstraksi harus mempunyai kelarutan yang rendah di fase kedua (biasanya air), titik didih rendah, dan memiliki kemampuan untuk melarutkan analit tanpa melarutkan impurities (Jacobs et al. 1974). Pelarut juga harus bersifat inert dan tidak mengalami reaksi dengan reaktan atau produk. Dietil eter adalah pelarut yang umum digunakan untuk ekstraksi karena sifatnya yang inert dan kelarutan air yang rendah dalam eter (1 g/75 g eter). Kelemahan dari pelarut eter ini adalah sangat mudah terbakar sehingga diperlukan penanganan yang hati-hati.
Setelah ekstraksi, akan terdapat dua lapisan yang terpisah. Lapisan bawah adalah fase aqueous, sedangkan lapisan atas merupakan fase eter. Hal ini disebabkan berat jenis eter (ρ=0.713 g/ml) lebih rendah daripada berat jenis air (ρ=1 g/ml). Pemisahan kedua fase ini dapat dilihat pada Gambar 3. Ekstrak eter kemudian diuapkan pada penangas air (hotplate) pada suhu yang rendah, sehingga akan tersisa residu. Residu tersebut dilarutkan dalam air dan ditambahkan dengan NH3 hingga basa. Larutan kemudian diuapkan untuk menghilangkan kelebihan NH3. Residu yang terbentuk dilarutkan dengan air panas dan disaring untuk menghilangkan kotoran-kotoran sehingga pembentukan ferribenzoat akan jelas terlihat. Filtrat tersebut kemudian ditambahkan dengan FeCl3. Jika sampel positif mengandung benzoat, maka akan terbentuk endapan ferribenzoat yang berwarna kekuningan atau salmon.
Terjadinya endapan ferribenzoat dapat dilihat pada Gambar 4. Pada Gambar 4 terlihat bahwa sebelum ditambah dengan FeCl3, larutan masih terlihat jernih.
Namun setelah ditambah dengan FeCl3, terdapat endapan ferribenzoat yang
berwarna kekuningan atau warna salmon. Adanya endapan tersebut menandakan bahwa sampel tersebut positif mengandung natrium benzoat.
fase eter
fase air
Gambar 3. Pemisahan Fase Eter dan Fase Air
A B
Gambar 4. Pembentukan Ferribenzoat, A = Larutan Sebelum Ditambah Pereaksi FeCl3 0.5 %, B = Larutan Setelah Ditambah Pereaksi FeCl3 0.5 %
Hasil analisis kualitatif natrium benzoat pada sampel saus sambal dan minuman dalam kemasan dapat dilihat pada Tabel 5. Hasil analisis
menunjukkan bahwa kedua sampel tersebut positif mengandung natrium benzoat pada ketiga ulangan yang dilakukan. Hal ini sesuai dengan komposisi yang tertera pada label kemasan yang menyebutkan bahwa kedua sampel tersebut mengandung natrium benzoat.
Tabel 5. Hasil Analisis Kualitatif Natrium Benzoat pada Saus Sambal dan Minuman Dalam Kemasan
Ulangan Saus Sambal Minuman Dalam Kemasan
1 + +
2 + +
3 + +
Keterangan :
+ : positif mengandung benzoat, ditandai dengan terbentuknya endapan berwarna salmon